高效液相色谱法测定蒙药复方述达格-4有效部位中山奈素和高良姜素的含量

高效液相色谱法测定蒙药复方述达格-4有效部位中山奈素和高良姜素的含量摘要]目的探析蒙药复方述达格-4有效部位高良姜素2与中山奈素应用高效液相色谱法检测的方法。方法应用高效液相反相色谱法，流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液，检测波长286nm，梯度洗脱（0min～20min，34%A→37%A；20min～60min，37%A），流速1.0mL/min，色谱柱为DiamosilC18（4.6mm×250mm，5μm），柱温30°C，进样量20μL。结果山柰素的线性范围为0.01656μg～0.1656μg（γ=0.9999），高良姜素线性范围为0.04μg～0.40μg（γ=0.9999）。重复性试验中，山柰素、高良姜素的平均含量分别为0.43%、1.21%；RSD分别为1.43%、0.94%；加样回收率试验评估中，山柰素、高良姜素的回收率平均值分别为98.92%、99.92%，RSD为2.33%、2.09%。结论高效液相色谱检测法的重复性较佳，简便准确，可为蒙药复方述达格-4质量控制提供依据。

关键词 山柰素；高良姜素；有效部位；蒙药复方述达格-4

[中图分类号]R29[文献标识码]A[文章编号]1674-074２（２０１4）07（b）－０130-03

[作者简介]张海玉（1968-），女，内蒙古呼和浩特人，大专，副主任蒙药师，研究方向：蒙药相关。

[通讯作者]李常胜，讲师，E-mail:immc_kjc@163。

述达格-4为蒙药传统配方，蒙医中用于止痛平喘，药物成分为100g石菖蒲、100g木香、200g紫硵砂，可止痛消喘，具有镇“巴达干赫依”的作用[1]。用于胃肠消化功能低下、胸肋刺痛、气短胸闷、膈肌痉挛等临床病症[2]。述达格-4中主药高良姜具有抗血栓、抗凝血、镇痛、抗腹泻、止呕、抗溃疡等功能，黄酮为其主要药理成分[3]。本研究富集复方药物中黄酮类成分，对其有效部位的含量应用HPLC法进行检测，取得满意效果，现报道如下。

1试药与仪器

MettlerToledo公司生产的AB135-S电子天平，AB135-S型超声清洗仪，日本日立公司生产的LC-2000全自动进样高效液相色谱仪，AgilentChemstation，L-2455紫外检测器。安国市康达中药材有限公司提供蒙药复方述达格-4中各药材，娃哈哈纯净水，乙腈为Fisher色谱纯试剂，其他试剂为分析纯；山柰素（批号：110861-202408；中国药品生物制品检定所）高良姜素对照品（批号：111699-202401；中国药品生物制品检定所）。

2方法与结果

2.1混合对照品储备液制备

于5mL容量瓶内精密称量2.50mg干燥减压后恒重的高良姜素对照品，于10mL容量瓶内称量2.07mg山柰素对照品，甲醇定容混匀后，于25mL容量瓶内分别吸取1mL两种对照品溶液，混合对照品浓度为0.00828mg/mL。

2.2供试品溶液制备

精密称量5g述达格-4药材，放入250mL圆底烧瓶内，将50%的乙醇100mL精密加入，进行2次回流提取，2h/次，用脱脂棉趁热粗滤，将两次提取液合并，溶剂无醇味后回收，对入蒸馏水稀释至15mL；经大孔树脂柱纯化，收集乙醇洗脱液，溶剂回收，25mL容量瓶内定容70%乙醇，摇匀，即为有效部位样品溶液，25mL容量瓶内吸取1mL此溶液，定容70%乙醇，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过。

2.3色谱条件及系统适用性试验

流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液，检测波长286nm，梯度洗脱0min～20min，34%A→37%A；20min～60min，37%A），流速1.0mL/min，色谱柱为DiamosilC18（4.6mm×250mm，5μm），柱温30°C，进样量20μL。在以上色谱条件下，山柰素、高良姜素与相邻色谱峰的分离度均≥1.5，对称因子在0.95~1.05之间，理论板数均≥7000。色谱图见下图1。

1山奈素

2高良姜素

2.4线性关系考察

分别取混合对照品溶液分别进样2.0μL、4.0μL、6.0μL、8.0μL、10.0μL、20.0μL在以上色谱条件下进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，溶液质量X（μg）为横坐标绘制标准曲线，达到山柰素、高良姜素的回归方程分别为：Y=6469053.8311X-1420.7869γ=0.9999（山柰素线性方程）；Y=9011119.0984X-26100.0164γ=0.9999（高良姜素线性方程）；山柰素的线性范围为0.01656～0.1656μg，高良姜素线性范围为0.04～0.40μg。

2.5精密度试验

在以上色谱条件下，选择同一供试品溶液连续6次进样，测得山柰素、高良姜素的峰面积的RSD（n=6）分别为0.90%、2.52%。

2.6重复性试验

同一供试品溶液制备6份，按以上色谱条件检测。

2.7统计方法

采用spss17.0软件系统分析所有数据，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，用t检验，计数资料采用χ2检验。山柰素、高良姜素的平均含量分别为0.43%、1.21%；RSD分别为1.43%、0.94%，见表1。

2.8稳定性试验

在以上色谱条件下，同一份供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10、12、24h重复进样，检测山柰素、高良姜素的峰面积的RSD（n=8）分别为0.79%、2.40%，说明24h内供试品溶液的稳定性较佳。

2.9加样回收率试验

精密称量2.5g述达格-4药材6份，进行有效部位样品溶液制备，在25mL容量瓶内分别吸取1mL样品溶液，加入0.0245mg山柰素、0.0588mg高良姜素标准品，25mL容量瓶内定容70%乙醇，混匀后用0.45μm微孔滤膜滤过，按以上色谱条件检测，计算RSD及回收率。山柰素、高良姜素的回收率平均值分为98.92%、99.92%，RSD为2.33%、2.09%，见表2。

3样品含量测定

取样品3批，3份/批，按以上方法制备供试品溶液，液相色谱仪内注入20μL供试品溶液，记录峰面积，药物中山柰素、高良姜素含量测定依据外标一点法。见表3。

3讨论

3.1选择测定波长

选择测定波长时，高良姜素、山柰素分别在282nm、286nm、290nm处可最大吸收[4]，但经研究二者在286nm处吸收效果最佳[5]，所以测定波长选定为286nm。

3.2选择流动相

在对流动相的系统选择中，高良姜素在乙腈—磷酸水系统中的分离效果较佳[6]。

3.3选择对照品

分析对照样品时，发现黄酮为复方述达格—4有效部位的主要药理成分，山柰素、高良姜素的药理活性较强[7]。山柰素可发挥抗变态反应、抗炎功能，影响人胃癌细胞原位移植裸鼠中的和一表达[8]；而高良姜素可显着防护小鼠酒精型胃溃疡及大鼠结扎性胃溃疡，同时抗炎、抗病毒、抗畸形[9]。

该研究蒙药复方述达格-4有效部位高良姜素2与中山奈素应用高效液相色谱法检测，结果显示：重复性试验中，山柰素、高良姜素的平均含量分为为0.43%、1.21%；RSD分别为1.43%、0.94%；加样回收率试验评估中，山柰素、高良姜素的回收率平均值分为为98.92%、99.92%，RSD为2.33%、2.09%，说明高效液相色谱检测法的重复性较佳，简便准确，可为蒙药复方述达格—4质量控制提供依据。

参考文献

[1]董玉，贾鑫，马强.蒙药复方述达格-4不同配伍对总黄酮和高良姜素含量的影响[J].内蒙古大学学报:自然科学版，2024，43(5):173-174.

[2]贾鑫，武娜，董玉.高效液相色谱法测定蒙药复方述达格-4有效部位中山奈素和高良姜素的含量[J].内蒙古医学院学报，2024，33(3):702-703.

[3]梁选革，张若燕，刘莉丽.红花注射液中槲皮素和山柰素含量的高效液相色谱测定[J].时珍国医国药，2024，23(10):153-156.

[4]杜小伟，王京辉，肖斯婷，等.高效液相色谱法测定不同来源罗布麻叶中槲皮素和山柰素的含量[J].四川医学，2024，31(5):234-236.

[5]BroviaV，RicciardiA，BarbeitoL.N-Acetyl-aspartylglutamate(NAAG)inhumancerebrospinalfluid:Determinationby?highperformanceliquidchromatography，andinfluenceofbiologicalvariables[J].AminoAcidsm，2024，9(2):175-184.

[6]孟宪波.HPLC测定凤眼草中槲皮素与山柰素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2024，19(8):122-123.

[7]吴琼，林一帆，王常丽，等.HPLC