基因工程讲义

PAGEPAGEIII基因工程讲义目录第一章绪

论………………3一、基因工程的诞生………………3二、基因工程的成就………………5三、基因工程安全性的问题…………6四、基因工程研究的内容………… 8第二章基因克隆所需的工具酶…………… 12一、限制性内切酶(restrictionenzyme)……………… 12二、DNA连接酶……………………20三、DNA聚合酶……………………24四、逆转录酶……… 27第三章基因的克隆载体

…… 28一、质粒载体……… 28二、大肠杆菌质粒载体…………… 30三、λ噬菌体载体……………………33四、粘粒载体（柯斯质粒载体）…… 35第四章目的基因的分离克隆

……………… 38第一节化学法合成目的基因………… 38第二节

PCR技术在基因克隆中的应用……………… 38一、PCR基本技术………………… 38二、PCR技术在基因克隆方面的应用……………… 42第三节基因文库技术分离目的基因…………………45一、

基因文库的类别…………………46二、核基因组文库构建……………… 48三、利用PCR技术构建cDNA文库…………………49四、应用差别杂交或扣除杂交法构建cDNA文库…… 49五、人工染色体文库………………… 50第五章重组体的构建、转化及鉴定………… 54一、质粒DNA的分离纯化………… 54二、目的基因与载体的连接………… 54三、重组体向宿主细胞的导入……… 54四、含重组质粒的细菌菌落的鉴定……56第六章克隆基因的表达……… 59第一节

外源基因在原核细胞中的表达……………… 60一、原核生物基因表达的特点……… 60二、基因表达的调控序列…………… 61三、几种类型的原核表达载体……… 62四、提高克隆基因表达效率的途径………………… 63第二节

外源基因在真核细胞中的表达……………… 68一、真核细胞基因克隆载体………… 68外源基因导入真核细胞的方法…………………72第七章重组体的筛选与鉴定…………………76一、遗传检测法…………………… 76二、物理检测法…………………… 78三、核酸杂交筛选法…………………79四、免疫化学检测法………………… 80五、DNA—蛋白质筛选法…………… 81《基因工程》课程教学大纲适用专业生物科学，生物技术预修课程普通生物学、遗传学、生物化学、分子生物学一、编写说明（一）本课程的性质、地位和作用自本世纪70年代基因工程诞生以来，在不到30年的时间内，已取得许多激动人心的成就，并继续向前迅猛发展，成为当今生物科学研究领域中最具生命力、最引人注目的前沿学科之一。基因工程学的出现，给社会发展带来了深刻的影响。许多国家都已把基因工程列为优先发展的高科技项目。本课程主要介绍基因操作的主要技术原理，基因操作的工具酶，克隆载体，目的基因的分离方法，重组体的构建及导入，克隆基因的表达与检测，基因工程研究进展，存在问题及新策略等内容，使学生具备基因工程方面的基本知识和掌握基因工程基本的操作技术。（二）本大纲制订的依据基因工程是生物学科中的高级课程，主要针对高年级本科生和研究生开设。学生在此之前需要掌握普通生物学、遗传学、生物化学、分子生物学等方面的专业知识，以及分析化学、有机化学、无机化学、大学物理等方面的基本知识。（三）大纲内容选编原则和要求（四）实践环节（六）考核方法与要求⒈平时成绩：0%⒉实验成绩：0%⒊试卷成绩：100%，⒋综合考核成绩（七）教材与主要参考书教材：自编讲义主要参考书：1.基因工程，邱泽生，首都师范大学出版社，19922.基因工程原理（上下册），吴乃虎，科学出版社，20013.植物基因工程，王关林，方宏筠，科学出版社，19994.基因工程学原理，马建岗，西安交通大学出版社，2001

PAGEPAGE27第一章绪

论

在研究生物演化的过程中，遗传和变异是两个重要的概念。遗传性赋予生物种的稳定，保证生物种的延续不断。变异性赋于生物种的进化，保证生物种对各种环境的适应。在生物演变的长河中，自然发生的变异是非常缓慢的，随着生物科学的发展，人类开始学会干预生物的变异，经典遗传学的出现，使人们在几年至几十年内便可实现在自然界中需要千百万年才能出现的变异．从而改变了某些物种，有利于人类。从本世纪70年代初，基因工程学诞生，在短短不过30年的时间内已经取得了许多激动人心的成果。它的最大特点，就是以重组DNA的技术，开辟了在短时间内改造生物遗传性的新天地。它填补了生物种属间不可逾越的鸿沟，克服了常规育种的盲目性，使人类有可能按照需要定向培育生物新品种、新类型乃至创造自然界从未有过的新生物。目前，基因工程正以新的势头迅猛发展，成为当今生物科学研究领域中最有生命力、最引人注目的前沿科学之一。

一、基因工程的诞生(一)基因工程的诞生基因工程诞生于1973年，它是数十年来无数科学家辛勤劳动的成果、智慧的结晶。从40年代开始，科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。概括起来，从40年代到70年代初的基因工程诞生，在现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用：1．理论上的三大发现（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA。l934年，Avery在美国的一次学术会上首次报道了著名的肺炎球菌的转化实验结果。超越时代的科学成就，往往不容易很快被人接受，Avery的论文没有得到公认。事隔十年，这一成果才得以公开发表。事实上，Avery不仅证明DNA是生物的遗传物质，而且也证明了DNA可以把一个细菌的性状转给另一个细菌，理论意义十分重大。正如诺贝尔奖金获得者Lede-rbevg指出的，Avery的工作是现代生物科学的革命开端，也可以说是基因工程的先导。（2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。1953年，Walson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型。对生命科学的发展，足以和达尔文学说、盂德尔定律相提并论。

（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸。到了1966年，破译了64个密码子，编排了一本密码字典，叙述了中心法则。从此，千百年来神秘的遗传现象，在分子水平上得到了揭示。2．技术上的三大发明

（1）限制性核酸内切酶的发现

从40年代到60年代，虽然从理论上已经确立了基因工程的可能性，科学家们也为基因工程设计了一幅美好的蓝图。但是，科学家们面对着庞大的双链DNA(dsDNA)，尤其是真核生物，其DNA分子是相当巨大的，仍然是束手无策，不能把它切成单个的基因片段。尽管那时酶学知识已得到相当的发展，但没有任何一种酶能对DNA进行有效的切割。直到1970年，Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶HindIII，使DNA分子的切割成为可能。1972年Boyer实验室又发现了名叫EcoRI的核酸内切酶，这种酶每遇到GAATTC序列，就会将双链DNA分子切开形成DNA片段。以后，又相继发现了大量类似于EeoRI这样的限制性核酸内切酶，这就使研究者可以获得所需的DNA特殊片段，为基因工程提供了技术基础。（2）

对基因工程技术的突破的另一发现是DNA连接酶的发现1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。这种酶能够参与DNA缺口的修复。1970年，美国的Khorana实验室发现了一种叫T4DNA连接酶，具有更高的连接活性。

（3）基因工程载体的发现科学家有了对DNA切割与连接的工具(酶)，还不能完成DNA体外重组的工作。因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力。所以，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将DNA片段连接到一种特定的、具有自我复制的DNA分子上。这种DNA分子就是基因工程载体(Vector)。基因工程的载体研究先于限制性核酸内切酶。从1946年起，Lederberg开始研究细菌的性因子～F因子，经过50和60年代，相继发现其它质粒，如抗药性因子(R因子)，大肠杆菌素因子(CoE)。到1973年，Cohen将质粒作为基因工程的载体使用。

具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。两位科学的“助产士’——Berg和Cohen把基因工程接到了人间。．1972年，美国斯坦福大学的P．Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。他们使用限制性内切酶EcoRI，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体的DNA分别进行酶切，然后再用T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来，结果获得了包含有SV40和λDNA重组的杂种DNA分子。（基因工程的雏形）1973年，斯坦福大学的S．Cohen等人，也成功地进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌(E．Coli)的抗四环素(TCr)质粒PSCl01和抗新霉索(Ner)及抗磺胺(Sr)的质粒R6一3，在体外用限制性内切酶EcoRI切割，连接成新的重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。结果在含四环素和新霉素的平板中，选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落这是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。基因工程从此诞生，这一年被定为基因工程诞生的元年。

二、基因工程的成就

基因工程是一门创造性的科学，有着惊人的发展潜力和广阔的应用前景。基因工程诞生30年来，已经带来了一批突破性的成果，有些已在人们的生产和生活中作出了重大贡献。基因工程从1977年起出现了飞跃的发展。在这一年中，遗传工程取得了一项震撼人心的重要成果。例如：（1）Itakara等使化学合成的激素抑制素基因与大肠杆菌β一半乳糖(苷)酶基因和PBR322质粒重组到一起，然后转化到大肠杆菌中，结果产生出含激素抑制素的嵌合型蛋白质，经溴化氰处理后，有活性的激素抑制素便释放出来。这是真核生物的人造基因首次在原核生物中表达，这一成果的取得大大增强了人们对遗传工程的兴趣和信心。他们用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质，相当于50万头羊脑的提取量，意义非常重大。

（2）1978年，Goedd．1等使化学合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中表达，他们将人胰岛索两条肽链的基因引入到大肠轩菌，培养后大肠杆菌产生了人胰岛素的A链和B链，经二硫键连接后形成人胰岛索分子。有人估计，全世界约有六千万名糖尿病患者，用猪和牛的胰脏提取的胰岛素已经不能满足他们的需要。因此，人胰岛素基因在大肠杆菌中表达成功，使胰岛素的人工大量合成成为可能，为广大的糖尿病患者带来了福音。（3）1979年，Gooddel等使人生长激素基因在大肠杆菌中表达成功。人生长激素由191个氨基酸组成，能促进几童生长，治疗侏儒症。医用人生长激素是从人尸体的脑下垂体分离获得的，来源极为有限。遗传工程菌能产生人生长激素，为这种激素开辟了广阔的来源。（4）1980年，Nagata等使干扰素基因在大肠杆菌中表达成功。干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的作用。用遗传工程菌大量生产干扰素，获得成功，使大规模临床试验成为可能。此外，日本的科技人员使大豆的遗传基因插入大肠杆菌的质粒中，人工合成大豆蛋白获得成功。美国Abbott公司用基因工程方法使大肠杆菌产生出人体尿激酶。（5）1981年，从遗传工程菌获得的新产物有动物口蹄疫疫苗，乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原以及牛生长激素等。上述产物的获得，对人乙型肝炎的诊断和防治，饲养动物的口蹄疫防治以及提高牛肉牛奶的产量具有重要意义。我国乙型肝炎病毒(HBV)基因工程研究工作自1983年开始。上海生化所，中国预防医学科学院病毒所，中国医学科学院基础所，军事医学科学院以及上海生物制品所等许多单位相继开展了HBV的分子克隆和DNA全序列测定、基因定位等理论工作。军事医学科学院还用E．coli生产HBcAg作为肝炎的诊断试剂出售。但一般来说，表达的水平都不太高。可以预料，用基因工程疫苗治疗乙肝的日子已为期不远。三、基因工程安全性的问题从基因工程诞生之日起，受到人类的极大关注。其理论和实践的意义都非常重大，但和任何新生事物一样，其成长过程中也遇到了强大的阻力。基因工程刚诞生的头几年，人们对它有不少争论。举几个简单的例子：1．人们担心“基因逃逸”问题，由于微生物之间通过转导、转化、接合进行基因转移。“有害”基因是否会逃逸到人体或环境中。科学家们经常使用大肠杆菌作为宿主菌。重组质粒转入大肠杆菌中表达，人们担心大肠杆菌会通过研究者的消化道带出实验室。经过连续两年对研究人员的粪便检查，均未发现大肠杆菌和质粒。2．前段时间英国“多莉”的死亡。希特勒。美国科幻电影。3．对转基因食品的安全性的问题。随着全球人口增多，粮食紧张的问题日益严重。许多生物学家致力于高产、高质的农作物。提高农作物产量的方法主要有2方面：一方面发现高产农作物（不大可能）；另一方面减少农作物生长中的损失（旱、涝、病毒、虫，腐烂等）。目前，植物基因工程方面使用技术就是从其他物种上分离有效的基因，然后转移到农作物上（例如：现在已有的，抗虫棉，水稻，土豆，西红柿，大豆，玉米等）。现在产生的问题是，安全性问题。特别是人们将大量的食用转基因食品，其安全性问题应该引起高度重视和科学地评价，确保人民健康，才能使基因工程顺利发展。转基因植物食品的安全性主要包括2方面：（1）

转基因植物食品有无毒性物质及有无过敏性蛋白。①

目的基因编码已知的过敏蛋白；（2）食品安全性中的另一个重要问题是标记基因的安全性评价。nptⅡ(新霉素磷酸转移酶基因)、hpt(潮霉素磷酸转移酶基因)、gent(乙酰转移酶基因)及抗除莠剂的基因在转基因植物中得到高表达，人们食用大量转基因食品是否可能对抗生素产生抗药性。4．基因工程与生态环境平衡转基因作物栽到大田后，会不会和野生亲缘植物自然杂交，导致野生亲缘植物获得抗性，从而影响环境。而导致产生新的杂草类型。如除草剂对已俘获了抗除草剂基因的杂草不再具备除草性能；抗虫基因的俘获也许会导致害虫种类交替进化；这些都迫使人们使用更危险的化学药物。可见转基因植物的大规模种植可能会群落带来极大的不利。群落的影响不但难以预料，甚至可能产生更严重的后果；俘获了毒蛋白基因会由于食草动物难以伤害它而加剧繁衍蔓延，稀有植物品种也许会由于竞争，同种植物的遗传多样性便会减少，昆虫群落也会受到影响。从以上例子可以看出，基因工程是个双刃剑，于是许多社会人士、政府官员、甚至科学家发出呼吁，要求制定法规，限制基因工程的研究。近年来关于转基因植物的安全性问题引起世界性的争论，众说风云，更激起各国的重视投入大量人力、物力进行科学地研究，美国国立卫生研究院(NIH)成立了一个专门委员会处理这些诉颂事宜，并于1975年制定了“通用重组DNA分子研究准则”，尽管已经对基因工程的安全防护作了许多规定，仍有不少科学家联名要求取消危险的实验。对基因工程争论的焦点是害怕基因工程创造的杂种生物会从实验室逸出，在自然界造成难以控制的危害。有害的杂种细菌或病毒与化学物质不同，它们会在自然界不断增殖，造成的危害更大。

研究结果表明，从本质上讲转基因植物与常规育种是一样的。两者都是在原有的基础上对现有品种的某些性状进行修饰，或增加新性状，或者消除不良性状，最后培育出优质高产稳产和抗病、抗逆的新品种，它们的区别只是技术和方法问题。基因工程只是利用现代分子生物学进行单基因或多个基因的转化，增强了育种的目的性和可操作性I缩短了育种周期，应该说是更科学和更安全。例如在常规育种时，父母本的不良基因、甚至是有害基因都传递给下一代。基因工程育种只是把好的基因、有用的基因传递给下一代，使下一代不断优化。关于目的基因的结构与功能应该进行严格科学地研究和选择，堵截有害基因的使用就可以避免上述安全性的疑虑。四、基因工程研究的内容1．定义基因工程产生以来，还没有一个统一的公认定义。一般认为基因工程是指：把体外核酸分子(无论采取什么方法从细胞中取得)组合到任何病毒、细菌质粒或其它载体系统(分子)，形成遗传物质的新组合，并使之进入到原来没有这类分子的宿主体内，而能持续稳定地繁殖。或者说，它是对DNA大分子上的遗传单元(基因)进行体外操作，把不同来源的基因按照设计的蓝图，重新构成新的基因组(即重组体)，再把它引入细胞中，构成具有新的遗传特性的生物。

从上面定义可以看出基因工程的一个重要特征，就是强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的。这就赋于基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间的限制，扩大和带来了定向创造新生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程问世以来，各种相关的名称相继问世。在文献中常见的有遗传工程(Geneticemgineering)、基因工程(Geneengineering)，基因操作(Genemanipulation)、重组DNA技术(RecombianantDNAtechnique)、分子克隆(Molecularcloning)、基因克隆(Genecloning)等，这些术语所代表的具体内容彼此具有相关性，在许多场合下被混同使用，难以严格区分。不过它们之间还是存在一定的区别的。例如，遗传工程比基因工程有更广泛的内容，凡是人工改造生物遗传性的技术如物理化学诱变、细胞融合、花粉培育、常规育种、有性杂交等，还包括基因工程在内。因此，遗传工程包括基因工程，遗传工程不等于基因工程。又如重组DNA技术，它是基因工程的核心内容，但严格地说，基因工程除上述的定义所阐明的内容以外，还应包括体外DNA突变，体内基因操作以及基因的化学合成等。总之，凡是在基因水平上操作而改变生物遗传性的技术都属于基因工程。而重组DNA技术不等于就代表基因工程。

至于生物工程，它是更大范围内改造生物并生产生物产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，除遗传工程、基因工程外，还有酶学工程，细胞工程、发酵工程、农业工程等。

克隆(Clone)一词有必要加以解释。当它作为名词使用时，是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代，或具有相同遗传性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。当克隆作动词使用时，是指从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。因此，基因工程也可称为基因克隆或DNA分子克隆。2．基因工程研究的内容包括以下几个主要内容或步骤(1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。(2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。

(3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。(4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。(5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。(6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析；(7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

表1

重组DNA技术发展史的某些重要事件

年份

重

要

事

件1869

F．Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA1944

0．T．Avery等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质1953

J．D．Watson和F．H．C．Crick在R．Franklin和M．Wilkins的x一射线工作的基础上提出了关于DNA分子结构的双螺旋模型1957

A．Kornberg在大肠杆菌中发现DNA聚合酶I。这是可在试管中合成DNA的头一种核酸酶。现在这种酶已被用来制备标记的DNA探针1958

M．Meselson和F．w．Stahl证实DNA的复制涉及到双螺旋分子两条互补链的分离过程，提出了DNA半保留复制模型1961

M．w．Nirenberg等人应用合成的信使RNA分子[poly(u)]破译出了第一批遗传密码F．Jacob和J．Monod提出了调节基因表达的操纵子模型1965

S.W.Holley完成了第一个酵母丙氨酸tRNA的核苷酸全序列测定1966

M．w．Nirenberg，S.Ochoa和H．G．Khorana共同破译了全部的遗传密码1967

发现了可将DNA链连接起来的DNA连接酶1970

H．O．Smith，K．w．Wilcox，T．J．Kelley分离到第一种核酸内切限制酶，1973

以H．Boyer，P．Berg等人为代表的一批美国科学家发展了关于重组DNA技术。并于1972年得到了第一个重组的DNA分子，1973完成头一个细菌基因的克隆1975

F．Sanger以及A．Maxam和w．Gilbert发明了快速的DNA序列测定技术。1977年第一个全长5387bp的噬菌体ФX174基因组测定完成1978

首次实现了通过大肠杆菌生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素1980

美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以获得专利1981

R．D．Palmiter和R．L．Brinster成功获得第一个转基因小鼠；A．c．Spradling和G·M·Rubin培育出转基因果蝇1982

第一个由基因工程菌生产的药物一胰岛素，在美国和英国获准使用1983

头一个表达其它种植物基因(一个基因)的转基因植物培育成功1985

头一批转基因的家畜(兔、猪和羊)诞生1986

基因工程生物首次在控制的情况下实验性地释放到环境中1988

J·D·watson出任“人类基因组计划”首席科学家，协调举世瞩目的人类基因组测序工作的进行1994

基因工程西红柿在美国上市1995

自然杂志汇集发表了人基因组全物理图，以及3号、16号和22号人染色体的高密度物理图1996

完成了酵母基因组DNA(125×10。bp)的全序列测定工作1997

中国科学院国家基因研究中心以洪国藩教授为首的科学家小组，在世界上首次成功构建了高分辨的水稻基因组物理图

英国爱丁堡罗斯林研究院首次克隆成功多莉羊，引起世界轰动。第二章基因克隆所需的工具酶

基因操作包括以DNA分子的切割和连接为核心的一系列步骤，需要多种具有不同功能的工具酶参与完成。以限制性内切酶(restrictionendonuclease)和DNA连接酶(1igase)为主的多种工具酶的发现和应用，为基因操作提供了十分重要的技术基础。基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应。已经知道有许多种重要的核酸酶，例如核酸内切酶、核酸外切酶，以及用信使RNA模板合成互补链DNA的反转录酶(reversetranscriptase)等，在基因克隆的实验中都有着广泛的用途。一、限制性内切酶(restrictionenzyme)1．限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。早在本世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制(restriction)和修饰(modification)系统。

图中的数字是生长在不同寄主中的^噬菌体的成斑率(EOP)，表示限制程度。在K株或B株上生长繁殖的噬菌体^(K)或L(B)，再次感染原寄主菌株的成斑率均为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4×10-4，所以说受到了限制。

在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中2．核酸内切限制酶的类型

目前已经鉴定出有三种不同类型的核酸内切限制酶，即I型酶、II型酶和III型酶。这三种不同类型的限制酶具有不同的特性(表3—3)。

表3-3

核酸内切限制酶的类型及其主要特性特性I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶

具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份

2种不同的亚基

切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近

距寄主特异性位点3，端24~26bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割

能

能能序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大

1968年，Meselson和Yuan最早从大肠杆菌B和K菌株的限制和修饰系统中分离到限制性内切酶，这种酶后来被命名为I型限制性核酸内切酶。I型限制性内切酶虽可识别DNA分子中特定的核苷酸序列，但它们的切割作用却是随机进行的，其切割方式是，先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互结合，然后沿着DNA移动相当于1000~5000个核苷酸的一段距离后，在似乎是随机的位置上切割一股单链，形成大约75个核苷酸的缺口。因此，I型限制性内切酶在基因操作中没有什么实际的应用价值。在1970年，发现II型酶，由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，而且核酸内切作用又具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。所以在基因工程中我们着重介绍II型酶。3．核酸内切限制酶的命名法

由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点：

①

用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia

coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus

influen—zae)用Hin表示。

②

用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok。如果限制与修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的，则在缩写的寄主菌的种名右下方附加一个标注字母，表示此染色体外成分。例如Ecop1，EcoR1。

⑧如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。

④所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制酶R外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶R．HindIII。同样地，修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M.HindIII。

在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化：

①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。

②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名称R便被省去。4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性与I型及III型核酸内切限制酶不同，II型核酸内切酶只有一种多肽，并通常以同源二聚体形式存在。(1)

基本特性它具有三个基本特性：a.

在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂；b.

2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；c.

因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。a.

识别位点：

绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4~8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。有些识别序列是连续的(如GATC)，有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N是代表任意一种核苷酸碱基，切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构，例如：5′-CTGCAG-3′

5′-CTGCA

G-3′3′-GACGTC-5′

3′-G

+

ACGTC-5′（a）PstI切割位点

5′-GAATTC-3′

5′-G

+

AATTC-3′3′-CTTAAG-5′

3′-CTTAA

G-5′

(b)EcoRI切割位点

5′-GAT

ATC-3′

5′-GAT

+

ATC-3′3′-CTA

TAG-5′

3′-CTA

TAG-5′（c）EcoRV切割位点图

不同的核酸内切限制酶切割DNA分子产生的两种不同的粘性末端(a)

PstI的识别序列，切割后形成3′﹣OH的单链粘性末端，(b)

EcoRI的识别序列，切割后形成5′﹣P的单链粘性末端，(c)

EcoRV的识别序列，切割后形成平末端。在切割位点处，限制酶的作用下磷酸二酯键便会发生水解效应，从而导致链的断裂。这就是所谓的核酸内切限制酶对DNA链的切割作用。b.切割类型：

检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一：（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。c.产生的末端特征：我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端的DNA片段则不易于重新环化。已知有两种不同类型的限制酶都可以产生粘性末端，但一种是形成具有3′﹣OH单链延伸的粘性末端，例如PstI酶就是属于这种类型；另一种则是形成具有5′﹣P单链延伸的粘性末端，例如EcoRI酶便是此种类型的一个代表。(2)

同裂酶(isoschizomers)

有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。(3)同尾酶

(isocaudamer)与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。常用的BamHI,BclI,BglII,XhoI就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybridsite)。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：SalI（5′-G

TCGAC-3′）和XhoI(5′-C

TCGAG-3′)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5′-GTCGAG-3′）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。5．影响核酸内切限制酶活性的因素(1)

DNA的纯度核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法：①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。③延长酶催化反应的保温时间。

在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，因此在这种制剂中的DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。

(2)

DNA的甲基化程度

核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。

(3)

酶切消化反应的温度DNA消化反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况，它们要求37℃以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60℃以上，消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。

(4)

DNA的分子结构DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。

(5)

核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。缓冲液Tris-HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度。

在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。

有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在G

AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过5％(V／V)，那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。6.限制性内切酶反应的终止

消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ对热稳定，则需加入终止反应液(如加入0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L)螯合Mg2+，以终止反应。此外，还可以用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。如果用限制性内切酶消化DNA分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。7.利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。由于大多数生产厂家都针对其特定酶制剂优化过反应条件，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。不同限制酶的缓冲液主要差别在于其中所含NaCl的浓度。当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割。如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①

先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续温育；②

使用实际上所有限制酶均可作用的单种缓冲液[谷氨酸钾缓冲液(KGB)](Hanish和McClelland,1988；McClelland等，1988)。可使各种限制酶的活性达到最高。限制酶消化反应的进行

以下是对0.2~1.0ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。1)将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18pl。2)加入2μl适当的10×限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。3)加入1~2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。1单位酶通常定义为，在建议使用的缓冲液及温度下，在20μ1反应液中反应1小时，使lμgDNA完全消化所需的酶量。除非在酶制剂中污染了DNA酶或外切核酸酶(这种污染情况在商品化的限制酶制品中极少出现)。一般酶量过大或反应时间延长不会发生什么问题。4)将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。5)加入0.5mol／LEDTA(pH8.0)使终浓度达10mmol／L，以终止反应。6)如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可加入6μl凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，即可加样进行电泳。

如欲纯化消化后的DNA，可用酚：氯仿和氯仿各抽提1次，再用乙醇沉淀DNA。8.使用限制酶的注意点1）限制酶十分昂贵!遵循以下建议可以最大限度地节省开支。为能从贮存管内取出小量的酶，只要用一次性使用的移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可。这样，你可以取到少至0.1μl的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释。但切勿用水稀释以免酶变性。2)

限制酶在50％甘油中保存于-20℃时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了DNA或其他酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。3)

尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的1/10，否则，限制酶活性将受到甘油的抑制。4)

通常延长消化时间可使所需的酶量减少。这在切割大量DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反应液进行微胶电泳以判断消化进程。二、DNA连接酶同核酸内切限制酶一样，DNA连接酶的发现与应用，对于重组DNA技术学的创立与发展也具有头等重要的意义。它们都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。核酸内切限制酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂种DNA分子，还必须将它们彼此连接并封闭起来。目前已知有三种方法可以在体外连接DNA片段：１）用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；２）用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)—poly(dT)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；３）DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。１．DNA连接酶的发现

1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。这种酶需要在一条DNA链的3′–末端具有一个游离的羟基(–OH)，和在另一条DNA链的5′–末端具有一个磷酸基团(–P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用(图)。同时，由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能的反应，因此还需要有一种能源分子的存在才能实现这种连接反应。在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用ＮＡＤ＋[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源。值得注意的一点是，DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的ＤＮＡ链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口(gap)，即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。２．ＤＮＡ连接酶的连接机理在反应中，ATP(在有些连接酶是NAD)提供了激活的AMP，同DNA连接酶生成一种共价结合的酶-AMP复合物，同时伴随着释放出焦磷酸(PPi)或烟酰胺单核苷酸(NMN)。其中，AMP(腺苷一磷酸)是通过一种磷酸酰胺键同DNA连接酶的赖氨酸之c—氨基相连。激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5′–末端磷酸基团上，形成DNA—腺苷酸复合物。最后一步是3′–OH对活跃的磷原于作亲核攻击，结果形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。这个反应序列，是由在DNA连接酶—腺苷酸复合物形成过程中，释放出来的焦磷酸的水解作用所激发的。因此，如果是以ATP作能源的话，在DNA骨架上形成一个磷酸二酯键就要花费2个高能磷酸键。而如果是应用NAD+作为腺苷酸的给体，那么每形成一个磷酸二酯键同样也需要花费2个高能磷酸键。

分类：用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源：一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶：另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。这两种DNA连接酶，除了前者用NAD+作能源辅助因子，后者用ATP作能源辅助因子外，其它的作用机理并没有什么差别。T4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中纯化的，比较容易制备，而且还能够将由限制酶切割产生的完全碱基配对的平末端DNA片段连接起来，因此在分子生物学研究及基因克隆中都有广泛的用途。

连接酶连接缺口DNA的最佳反应温度是37℃。但是在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接粘性末端的最佳温度，应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为4~15℃比较合适．３．粘性末端DNA片段的连接3.1粘性末端的连接

DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。应用DNA连接酶这种特性，可在体外将具有粘性末端的DNA限制片段，插入到适当的载体分子上，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。具粘性末端的DNA片段的连接比较容易，也比较常用。当然，按上述这种方法构建重组体DNA分子，也有一些不便之处需要克服。其中最主要的缺点是，由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应混合物中会发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构。这样就会使只含有载体分子的转化子克隆的“本底”比例大幅度地上升，最终给重组体DNA分子的筛选工作带来了麻烦。为了克服这一缺点，现在的载体一般能提供多克隆位点，可采用双酶切进行酶切。3.2平末端DNA片段的连接不具有粘性末端的DNA分子也可以被连接起来。连接这种平末端DNA分子的方法有4种，（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用衔接物连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。（1）直接用T4DNA连接酶连接T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接酶不同。T4DNA连接酶除了能够封闭具有3′–OH和5′–P末端的双链DNA的缺口之外，在存在ATP和加入高浓度酶的条件下，它还能够连接具有完全碱基配对的平末端的DNA分子。这种反应的原因目前尚不清楚。但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。（2）同聚物加尾连接平末端DNA片段

运用末端核苷酸转移酶，能够将核苷酸(通过脱氧核苷三磷酸前体)，加到DNA分子单链延伸末端的3′–OH基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。为了在平末端的DNA分子上产生带有3′–OH的单链延伸，我们需要用5′–特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸。在由核酸外切酶处理过的DNA，dATP和末端核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3′–OH末端将会出现单纯由腺嘌吟核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段称为poIy(dA)尾巴。反过来，如果在反应混合物中加入的是dTTP而不是dATP，那么这种DNA分子的3′-OH末端将会形成poly(dT)尾巴。因此任何两条DNA分子，只要分别获得po1y(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。所加的同聚物尾巴的长度并没有严格的限制。连接分子的裂口可以通过大肠杆菌DNA聚合酶I的作用于以填补上。留下的单链缺口则可由DNA连接酶封闭。上述这种连接DNA分子的方法叫作同聚物尾巴连接法，简称同聚物加尾法。按照同样的道理，也可以用给一种DNA分子3′–末端加上poly(dG)尾巴，给另一种DNA分子3′–末端加上poly(dC)尾巴的办法，使2个不同的DNA分子连接起来．同聚物尾巴连接法是一种十分有用的DNA分子连接法。不但由特定限制酶消化会形成具平末端的DNA片段，就是用机械切割法破裂大分子量DNA，也经常会产生出平末端的DNA片段。此外在重组DNA技术学中占重要位置的，由RNA模板制备的cDNA同样也具有平末端的结构。这些DNA分子的连接，都往往要采用同聚物尾巴连接法．(3)用衔接物连接平末端DNA分子如果重组体DNA是用T4DNA连接酶的平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么就无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用衔接物法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。所谓衔接物(1inker)，是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。衔接物的5′–末端和待克隆的DNA片段5，一末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。（4）DNA接头连接法DNA衔接物连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的衔接物，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。DNA接头(adapter)连接法于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。这种连接法看起来的确是相当简单的，但在实际使用时也遇到了一个新的麻烦。因为处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，尤其是在高浓度DNA接头的环境中情况更盛。目前用于克服这个问题的办法是，对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，使之无法发生彼此间的配对连接。天然的双链DNA分子的两端都具有正常的5′–P和3′–OH末端结构。修饰后的DNA接头分子的平末端，仍与天然双链DNA分子一样，具有正常的末端结构，而其粘性末端的5′–P则被修饰移走，结果为暴露出的5′–OH所取代。这样，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具互补碱基配对的能力，但终因DNA连接酶无法在5′–OH和3′–OH之间形成磷酸二酯键，而不会产生出稳定的二聚体分子。合成的BamHI接头分子同外源DNA片段连接。这个接头的粘性末端具异常的5′–OH基团，因此不会自我多聚化。用多核苷酸激酶及ATP等处理，使连接在外源DNA片段上的接头分子的5′–末端磷酸化，然后插入到事先已用BamHI切割的载体分子上这种粘性末端被修饰的DNA接头分子，虽然丧失了彼此连接的能力，但它们的平末端照样可以与平末端的外源DNA片段正常连接。只是在连接之后，需用多核苷酸激酶处理，使异常的5′–OH末端恢复成正常的5′-P末端，让其可以插入到适当的克隆载体分子上。三、DNA聚合酶分子克隆操作中，常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段，T4DNA聚台酶，T7DNA聚合酶，逆转录酶等。这些DNA聚合酶的共同特点是，它们都能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3′–OH末端，催化核苷酸的聚合，而不发生从引物模板上解离的情况。其中，T7DNA聚合酶的聚合能力最强。1．大肠杆菌DNA聚合酶I

1956年A．Kornberg等首先从E．co1i细胞中分离出来。它是在DNA模板的方向上催化核苷酸聚合的酶，由单一多肽组成球蛋白。1.1功能：DNA聚合酶I是一个多功能酶，它包括三种不同的酶活力：

(1)5′→3′合酶活性：催化单核苷酸结合到DNA模板的3′–OH末端，以ssDNA作模板，沿引物的3′–OH方向按模板顺序从5′→3′延伸。

(2)5′→3′外切酶活性：E．co1iDNA聚合酶1也能从游离的5′–末端降解dsDNA成为单核苷酸。

(3)3′→5′外切酶活性：DNA聚合酶I还能从游离的3′–OH末端降解dsDNA或ssDNA成为单核苷酸。1.2E．coliDNA聚合酶在基因工程中的重要用途：DNA聚合酶I在分子克隆中的主要用途是，通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。缺口转移(nicktranslation)指在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5′→3′，核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。这就是说，当外切酶活性从缺口的5′一侧移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3′一侧补上一个新的核苷酸。但由于PolI不能够在3′–OH和5′–P之间形成一个键，因此随着反应的进行，5′–侧的核苷酸不断地被移去，3′–侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。这种移动特称为缺口转移(nicktranslation)。在迄今已发现的所有大肠杆菌聚合酶中，唯有Poll能够进行这种独立的链的取代反应。在下面我们就可以看到，这对于重组DNA技术学来说的确是十分重要的。DNA杂交探针的制备带放射性同位素标记的DNA杂交探针，在基因分离和操作中都经常要用到。应用缺口转移法制备DNA杂交探针。其典型的反应体系是，在25μ1总体积中含有1μg纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNaseI、PolI、a-32P-dNTPs和未标记的dNTPs。其中，DNaseI的作用在于给DNA分子造成断裂或缺口，随后Poll则作用于这些单链缺口进行缺口转移，使反应混合物中的32P标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，并最终形成从头到尾都被标记的DNA分子。2．K!enow片段大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，又叫做Klenow聚合酶。它是由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶，经枯草杆菌蛋白酶(一种蛋白质分解酶)处理之后，产生出来的分子量为76×103dal的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有的聚合活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5′→3′的核酸外切酶活性。在DNA分子克隆中，Klenow聚合酶的主要用途：标记DNA末端。１）

修补经限制酶消化的DNA所形成的3′隐蔽末端；２）

标记DNA片段的末端；选用具有3′隐蔽末端的DNA片段作放射性末端标记最为有效。用Klenow聚合酶标记DNA片段末端的原理可简单地概括成如下的流程；

样品置25℃下一道温育约1小时，即可完成DNA末端标记。因为待标记的DNA已经用适当的限制酶作了酶切消化，所形成的大小不等的DNA片段群体，它们都只是在末端被标记上，根据它们在分子量上的差别，便可以将这些片段分离出来。用Klenow聚合酶标记的DNA片段，可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。其根据在于被标记的DNA片段是同它们的摩尔浓度成比例，而同它们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程所产生的大小DNA片段都得到了同等程度的标记。据此，我们便可以应用放射自显影法，来确定那些难以被溴化乙锭染色法显现的微小DNA片段的位置。3．T4DNA聚合酶取代合成法标记DNA片段T4DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。具有两种酶催活性，即5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。如同大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段一样，T4DNA聚合酶也可以用来标记DNA平末端或隐蔽的3′–末端。在没有脱氧核苷三磷酸存在的条件下，3′外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。此时它作用于双链DNA片段，并按3′→5′的方向从3′–OH末端开始降解DNA。如果反应混合物中只有一种dNTP，那么这种降解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。这种降解速率的限制，使得DNA核苷酸的删除受到控制，从而产生出具有一定长度的3′–隐蔽末端的DNA片段。于是，当反应物中加入标记的脱氧核苷三磷酸(a-32p-dNTPs)之后，这种局部消化的DNA片段便起到了一种引物——模板的作用。T4DNA聚合酶的聚合作用速率超过了外切作用的速率，因此出现了DNA净合成反应，重新合成了完整的具有标记末端的DNA分子。由于在这种反应中，通过T4DNA聚合作用，反应物中的a-32P-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片段上的原有的核苷酸，因此特称为取代合成。应用取代合成法可以给平末端的DNA片段或具有3′–隐蔽末端的DNA片段作末端标记。四、逆转录酶又称RNA依赖的DNA聚合酶(RNA-—dependentDNApolymerase)。这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶。产物DNA又称cDNA，即互补DNA。它首先是由Baltimore从鼠白血病毒(MurineleukemiaVirus)以及Temin和Mizutan从劳氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus)中于1970年独立发现的，这两个小组的论文同时发表在同一期的英国自然杂志上。逆转录酶也是一个多功能性酶，主要有几种不同的酶活性：(1)

RNA依赖的DNA聚合酶

以RNA链为模板，以带3′–OH末端的DNA片段为引物，沿5′→3′方向合成DNA链。(2)

DNA依赖的DNA聚合酶

以ssDNA为模板，以带有3′–OH末端的DNA片段为引物，从5′→3′方向合成DNA链。(3)

外切RNA酶活性

底物是RNA—DNA杂交分子中的RNA链，有两种活性形式。从RNA链5′–末端外切的称5′→3′外切RNA酶，从RNA链3′末端外切的称3′→5′外切RNA酶H。在基因工程中，逆转录酶的主要用途是转录mRNA成为cDNA制备基因片段。另外，它也可用ssDNA或RNA做模板制作制备，杂交探针。PAGEPAGE81第三章基因的克隆载体

基因克隆的重要环节，是把一个外源基因导入生物细胞，并使它得到扩增。然而一个外源DNA片段是很难进入受体细胞的，即使进入细胞，一般也不能进行复制和功能的表达。这是因为，所得到的外源DNA片断一般不带有复制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的调控系统。这样，进行基因克隆是极为困难的。在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。目前，将外源基因运送到原核生物细胞的载体研究的较多，运送到植物和动物细胞中去的载体还处于探索阶段。本章以原核细胞载体为主，讨论各类载体的结构、功能以及构建过程。在基因工程中所用的载体，主要有5类，(1)

质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。(2)

噬菌体的衍生物。(3)

cosmid(柯斯质粒)。(4)

单链DNA噬菌体M13。(5)

动物病毒。

各类载体的来源不同，在大小、结构、复制等方面的特性差别很大，但作为基因工程用的载体，以下三方面是它们共有的特性和基本要求：

(1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即本身是复制子。(2)容易从宿主细胞中分离纯化。(3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。

各类载体具有自己独特的生物学特性，可以根据基因工程的需要，有目的的选择合适的载体，为此，分别介绍各类载体。一、质粒载体

质粒作为一种裸露的，比病毒更简单的，有自主复制能力的DNA分子，是处于生命与非生命的分界线上。(一)质粒的一般生物学特性

质粒（plasmid)是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。目前对细菌质粒研究的较为深入，在基因工程中，多使用大肠杆菌质粒为载体。

质粒分子的大小为1~200kb，质粒和病毒不同，它是裸露的DNA分子，没有外壳蛋白，在基因组中，也没有溶菌酶基因。质粒可以′友好”的“借居”在宿主细胞中，也只有在宿主细胞中，质粒才能完成自己的复制。同时将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达，赋予宿主细胞各种有利的表型。1．质粒的类型

大肠杆菌中现已找到许多类型的质粒，其中对F质粒，R质粒和Col质粒研究的较为清楚。由于这些质粒的存在，寄主细胞获得了各自不同的性状特征。简介如下：

F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须(pilus)的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌—雄细胞配对。我们称这种过程为细菌的接合作用(conjugation)。在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的F因子按滚环复制模式，经性须作用进入到雌性细胞。配对之后F—受体细胞获得了F因子，也变成为F+细胞。F因子不但能够通过接合作用实现自我转移，而且还能够带动寄主染色体一道转移。由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞（高频重组细胞），就有可能引发寄主染色体发生高频转移。但F因子的这种整合作用是一种可逆的过程，因此在一定的条件下，Hfr细胞又可重新变成F+或F′细胞。

R质粒：也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。根据质粒DNA中是否含有接合转移基因，可以分成两大类群。即接合型质粒和非接合型质粒。接合型质粒亦称自我转移的质粒，这类质粒除含有自我复制基因外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，如F质粒，部分R质粒和部分Col质粒。非接合型质粒亦称不能自我转移的质粒，此类质粒能够自我复制，但不含转移基因组，因此这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞。从基因工程的安全角度讲，非接合型质粒用作克隆载体更为合适。2．质粒的复制类型

一种质粒在一个细胞中存在的数目，称为质粒的拷贝数。根据宿主细胞所含拷贝数的多少，可把质粒分成两种不同的复制型。一种是低拷贝数的质粒，称“严紧型”复制控制的质粒(stringentplasmid)，此类质粒每个宿主细胞仅含1~3份的拷贝。另一类是高拷贝数的“松弛型”复制控制的质粒(relaxedplasmid)，这类质粒每个宿主细胞可达到10~60份拷贝。

一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的，这往往同宿主的状况有关。同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型，这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主的控制。

在一般情况下，质粒的接合转移能力与复制型及分子大小间有一定的相关性。现归纳如下：

分子量大

分子量小

接合型质粒

拷贝数少

非接合型质粒

拷贝数多

严紧型复制

松弛型复制3．质粒的不亲和性

在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性(plasmidincompatibility)，也称不相容性。例如colEI派生质粒，它们之间是互不相容的，也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释)掉。称这些质粒间是不相容的。

彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群Gneompatiblitygroup)。而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。(二)质粒载体的基本条件以上讨论的都是天然质粒，天然质粒的研究在理论上和遗传学等方面作出了贡献，但它很难直接作为基因工程的运载体应用。质粒载体绝大多