第六讲 高效液相色谱法在农药残留分析检测中的应用

第六讲

高效液相色谱法在农药残留分析检测中的应用本讲内容6.1基本原理、特点和分类6.2高效液相色谱仪6.3色谱条件的选择6.4HPLC在农药残留分析中的应用举例农药残留分析大都采用气相色谱配以选择性检测器,但现在使用的农药极性更强、挥发性更低，对它们以及对那些热不稳定的农药气相色谱就无能为力,这样液相色谱就成为农药残留检测领域中的又一主要技术。高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效键合固定相和高灵敏度检测器，因而具备分析速度快、分离效率高、操作自动化的特点。6.1

基本原理、特点和分类基本原理特点

分离效能高选择性高检测灵敏度高分析速度快分类

吸附色谱分配色谱离子色谱体积排阻色谱

高效液相色谱分离模式6.2高效液相色谱仪6.2.1

高效液相色谱仪流程

高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。

1-贮液器2–搅拌、超声脱气器3–梯度洗脱装置4–高压输液泵5–流动相流量显示6–柱前压力表7–输液泵泵头8–过滤器9–阻尼器10–六通进样阀11–色谱柱12–检测器13–记录仪(或数据处理装置)14–回收废液罐高效液相色谱仪流程示意图由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液器及脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点。6.2.2高压输液系统6.2.2.1贮液器

耐腐蚀，可为玻璃、聚醚醚酮（PEEK）材料。0.5~2L，入罐前过滤。6.2.2.2流动相流动相是影响分离的一个重要调节因素。一种理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度，检测器兼容性好，样品容易回收和低毒等特性。正相高效液相色谱法流动相常以己烷做基础溶剂。当洗脱极性较强的组分时，通常用二氯甲烷、四氢呋喃来调节极性。反相高效液相色谱法采用的流动相多为甲醇、乙腈配合水。一般情况下甲醇–水体系能够满足多数样品的分离要求。流动相选择注意事项：纯度：采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相前处理过滤：采用0.45

m或0.22

m滤膜

目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气

目的：除去流动相中溶解或因混合（例如甲醇和水）而产生的气泡方法：◎超声波振荡+抽真空：5min+5min

◎吹氦气法（鼓泡法）：氦气在流动相中的溶解度比空气低，可以将溶解的气体驱逐出去。脱气效果好，但成本高。在0.5MPa的压力下，先以100ml/min，鼓泡15min，然后以20ml/min保持着。◎

在线脱气器:膜过滤器。溶解在流动相中的气体可以从膜中被真空脱出，而液体不会从膜中出来。脱气效果最好。滤膜水

水是反相高效液相色谱法最重要的溶剂，它也是最难纯化和保持其特性的流动相之一。水的纯度至关重要，特别是在痕量分析。可自制或从超纯水制备仪上获得。超纯水制备仪纯水制备仪乙腈

这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光和电化学检测器的要求。甲醇

反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。氯代烃类溶剂在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。6.2.2.3

输液泵要求：◎泵体耐化学腐蚀。使用优质耐酸不锈钢（Cr18Ni2Mo2）◎能在高压下连续工作。40~50MPa。◎输出流量范围宽。◎输出流量稳定，重复性高。Waters600系列泵600系列泵是自带微机控制的色谱泵四元梯度、流速范围宽，大屏幕显示，键盘操作MPa(兆帕)(N/m2)PSI(磅/英寸2)(b/in2)标准大气压（atm）毫米汞柱(托Torr)(0℃,mmHg)巴(bar)公斤力/厘米3(kgf/cm3)1145.0389.8697500.621010.197常用压力单位换算表

控制方式：

恒流控制:恒流泵有注射型泵和往复泵，后者广泛采用。优点：组分保留时间重现性好。

缺点：压力有脉动；柱塞直接与流动相接触；长期运载，单向阀易堵塞。恒压控制：恒压泵。6.2.2.4

梯度洗脱装置所谓的梯度洗脱，就是将两种或两种以上的不同极性的溶剂进行混合，作为流动相使用。在进样过程中，连续不断地按预先拟定的程序改变流动相的浓度和极性。由于流动相极性发生变化，使得选择性得以改善，从而提高了分辨能力，缩短了分离时间。常用的梯度洗脱有低压洗脱、高压洗脱。高压梯度装置是用高压泵分别将两种或三种不同极性的溶剂输入混合器，充分混合后进入色谱柱。多元低压梯度洗脱只需要一个高压泵，而多元高压梯度洗脱就需要多个高压泵。低压梯度和高压梯度洗脱装置示意图低压梯度洗脱高压梯度洗脱典型的高压梯度洗脱程序

6.2.3进样系统

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

6.2.3.1

进样器自动进样器手动进样器定量管（10

L，20

L，50

L，100

L）原理：（六通阀）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入

进样废液样品

淋洗液至分离柱进样阀样品装样废液

淋洗液至分离柱

定量管（环）进样演示（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）样品环Rheodyne7125i六通进样阀自动进样器

可以用全自动或半自动的方式进多个样品一般的设计用Rheodyne阀，气阀驱动

Waters的717+的设计特点全电子设计，精度极好、可靠性高，最多96个样品多方法编程，自动标样程序，优先样品等模式可单独操作也可外部控制(IEEE)样品的冷却及加热-选件U6K设计，交叉污染小、进样范

围宽大屏幕LCD显示，容易使用6.2.4分离系统

色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬为光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5~30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm

以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。

柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。

6.2.4.1

柱箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

柱温控制的优点：6.2.4.2

色谱柱化学键合固定相1酯化键合（Si-O-R型），适用于正相色谱柱2硅烷化键合（Si-O-Si-R型）,适用于反相色谱柱液相色谱填料颗粒技术的沿革保护柱新型的保护柱—SentryGuard各种高效液相色谱柱1–柱管2–压帽3,6–卡套4–筛板5–接口7–螺丝8–输液管柱结构示意图1）柱压低于15MPa2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃3）缓冲液pH使用范围为2～7ODS柱的使用注意点：*硅胶在pH为3～4时稳定性最好*碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。分离类型填料规格（柱长/内径，mm）正相柱HypersilCN(CPS-1),5

m250×4.6HypersilNH2(APS-1),5

m250×4.6ZorbaxNH2,5

m250×4.6反相柱HypersilODS-2(C18),5

m250×4.6HypersilC18–BDS,3

m150×4.6LichrospherC18,5

m250×4.6XTerra

RP

18，5

m250×3.9XTerra

MSC18，2.5

m150×3.0常见的商品牌号液相色谱柱

ODS柱与C18柱的区别一般认为C18是连接了十八烷基碳链的反相固定相的总称。除了硅胶基质外，还可以包括其他基质的填料，比如高聚物小球为基质，氧化铝为基质，氧化锆为基质等键合C18链形成的反相固定相。而ODS是以硅胶为基质键合的C18填料。由于大部分的C18柱是硅胶基质，因此，在很多场合内二者混为一体。RP柱，BDS柱，MS柱

RP柱：在100％的水相条件下对极性化合物有极高保留的C18柱。适用于分离超高极性化合物。在100％水做流动相时可保持稳定。BDS柱：BaseDeactivedSilica，碱钝化硅胶柱。特别适合于强极性含氮的碱性化合物分离。MS柱：超低流失，适用于液质分析用。1）柱压低于15MPa2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃3）缓冲液pH使用范围为2～7ODS柱的使用注意事项：*硅胶在pH为3～4时稳定性最好*碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。柱床损坏及处理6.2.5检测系统

在液相色谱中，按检测的对象分为溶质性质检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，如紫外、荧光、电化学检测器等；总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，如示差折光，电导检测器等。按适用性分类分为选择性检测器，它只能选择性的检测某些物质，如紫外、荧光、电导；通用型检测器，它对大多数物质的响应相差不大几乎适用于所有物质，现将常用的检测器介绍如下:6.2.5.1

检测器的种类

在农药残留分析上应用的检测器主要有：◎

紫外检测器（包括二极管阵列检测器）◎

荧光检测器

◎

电化学检测器◎

蒸发光散射检测器规

格UVFLDEChELSD类型专用专用通用通用梯度洗脱能能不能能线性范围104105105106最小检出量(g)10-1110-1410-810-9对流速敏感性无无有无对温度敏感性低低2%，℃低信号单位吸光度，A荧光度电导率

s/cm光散射液相色谱检测器性能一览表

6.2.5.3

紫外检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比耳定律，A＝KCL优点：1）对温度和流速不敏感

2）可用于梯度洗提缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外检测器的溶剂影响不同种类溶剂有其截止波长溶剂的质量好坏对其截止波长有影响为何溶剂质量不好?含紫外吸收的杂质溶解在其中的氧气缓冲液溶质的紫外吸收二十一世纪标准紫外检测器二极管阵列检测器的优点：1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索4）可以发现单波长检测时未测到的峰二极管阵列检测器工作原理许多化合物有光致发光现象，荧光属于其中的一种。化合物受到入射光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波长长的特征辐射，当入射光停止照射时，特征辐射也很快消失，这种辐射光线就是荧光。荧光产生的实质是原子中电子由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级的能量释放。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要比分子吸收的紫外光波长长，这种光一般是可见光。对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光量子效率及荧光收集效率等成正相关，在相对条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比，这是荧光检测器的定量依据。6.2.5.4荧光检测器结构一台荧光检测器包括以下基本部件：激发光源；选择激发波长用的单色器；流通池；选择发射波长用的单色器及用于检测发光强度的光电检测器。由氙灯光源发出的光，经激发光单色器后，得到所需要的激发光波长。激发光通过样品流通池，一部分光线被荧光物质吸收。荧光物质激发后，向四面八方发射荧光。为消除入射光与散射光的影响，一般要取与激发光成直角的方向测量荧光。近年来，还出现一种激光诱导荧光检测器，其主要区别是光源采用了激光器。荧光检测器示意图工作原理电化学检测器是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的。在液相色谱中对那些没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的化合物，可采用电化学检测法。电化学检测器在痕量分析上主要有安培检测器和电导检测器。前者是以测量电解电流的大小为基础，后者则以测量液体的电阻变化为根据。6.2.5.5电化学检测器6.2.5.5.1安培检测器电化学检测器中应用最广泛的一种检测器。它要求在电解池中发生电解反应，即在外加电压的作用下，利用待测物质在电极表面上发生氧化还原反应引起电流的变化而进行测定的一种方法。工作电极是安培检测器的心脏，通常用玻璃碳材料制成，参比电极一般为Ag/AgCl电极，辅助电极为不锈钢或金、白金材料。三电极安培检测器示意图6.2.5.5.2电导检测器

CD与安培检测器不同，电导检测池内没有电化学反应发生，样品的浓度是通过测量溶液中离子的电导变化获得的。电导检测器主要是用于离子分析。该检测器在实际使用中对水、淋洗液有较严格的要求，离子分析时一般整个流路系统都用PEEK材料，避免不锈钢材料对淋洗液产生影响或淋洗液对不锈钢材料的腐蚀。电导池在使用前后发现有污染时，可用1:1硝酸溶液处理数分钟，以消除污染。在分析过程中，要注意温度对电导率的影响，一般每升高1℃，电导率会增加(2~2.5)%。1-流动相入口2-连接螺母3，6-硅橡胶密封

4-铂电极5-有机玻璃7-电极导线

电导检测器示意图6.2.5.6蒸发光散射检测器1985年世界上第一台蒸发光散射检测器问世，它标志着高效液相色谱仪通用型质量检测器的诞生。

工作原理当一束光线通过一间充满烟雾的房间就会发生光散射现象。在一定的角度测得的光散射强度与烟雾粒子大小和数量成正比，这就是ELSD定量分析的原理。原理上讲它可以检测挥发性低于流动相的所有化合物。经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中，利用高速气流喷成一薄雾，雾化为微小液滴的流动相进入加热的蒸发器(漂移管)蒸发，不挥发的目标化合物微粒化后进入光路发生光散射，散射光被光电倍增管捕获检测。

ELSD检测器结构示意图雾化部分蒸发部分检测部分ELSD在农药残留分析中的应用

目前的灵敏度难以满足要求。报道极少。6.2.6计算机控制系统及数据处理

高效液相色谱数据处理单元：岛津CLASS－VP色谱工作站EmpowerPro中文版色谱工作站6.3色谱条件的选择高效液相色谱法操作条件的选择应遵循色谱理论，主要包括两个方面的问题，即色谱柱效率和溶剂效率。柱效率是指溶质通过色谱柱之后峰的宽度增加了多少，它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关，这就是所谓的色谱动力学过程；溶剂效率是与两个物质和固定相、流动相的分子间作用力不同有关，这就是所谓的热力学过程。要提高柱效率，就得改善色谱柱性能和操作条件；要提高溶剂效率，就得提高固定相的选择性。6.3.1固定液碳链长短对分离的影响采用反相键合相C1、C8、C18对以下6种化合物进行分离。可以看出，随着碳链增加，保留时间明显增加，分离度明显提高。(色谱条件：IBM柱200×4.5mm；流动相：

Ψ（CH3OH∶H2O）=50∶50；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm。)1-尿嘧啶2-苯酚3-乙酰苯4-硝基苯5-苯甲酸甲酯6-甲苯反相液相色谱固定液碳链长度对分离的影响6.3.2对异构体的分离氯氰菊酯有8种同分异构体，如果采用一根柱子无法将其全部异构体分开。若再与一根手性柱串联使用，就可以分开全部异构体，见下图。(色谱条件：左图Chirex3019(Phenomenex)柱，250×4.0mm；右图Chirex3019柱+Chirex3020(Phenomenex)柱；流动相：Ψ（己烷∶二氯甲烷∶乙醇）=500∶10∶0.05，流速：1.0mL/min；检测波长：230nm。)氯氰菊酯8种同分异构体的分离1-对氨基苯磺酸

2-磺胺甲基嘧啶

3-磺胺异恶唑

4-磺胺嘧啶pH值对反相色谱法分离的影响4种磺胺药物在pH1.25~10范围内的分离。在pH1.25~3.0时磺胺异恶唑不稳定，没有流出。pH5.0~7.0流出就发生了。pH9.0有很好的分离，pH10.0分离很差。(色谱条件：ODS柱150×4.6mm，5

m；流动相：Ψ（20mMKH2PO4∶CH3CN）=95∶5，流速：1.0mL/min；检测波长：270nm。)3.5.3pH值对分