高三生物一轮复习课件第54讲基因工程的基本工具和基本操作程序

第54讲

基因工程的基本工具和基本操作程序2025届生物一轮复习第九单元考点一

重组DNA技术的基本工具1.基因工程概述

生物类型生物产品人们的愿望转基因遗传性状2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)

脱氧核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端(2)DNA连接酶黏性末端限制酶(3)载体噬菌体受体DNA上限制酶酶切位点标记考点一

重组DNA技术的基本工具一、基因工程的概念指按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。别名：操作环境：操作对象：操作水平：工程原理：最终目的：

生物体外基因DNA分子水平基因重组【归纳定义】重组DNA技术定向改造生物性状考点一

重组DNA技术的基本工具二、基因工程的诞生和发展历程(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间

。(2)DNA双螺旋结构的提出和

的证明。(3)中心法则的确立。(4)

的破译。(5)基因转移载体和

的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。转移半保留复制遗传密码限制酶、DNA连接酶和逆转录酶→DNA的空间结构和基本组成单位相同→都遵循碱基互补配对原则→所有生物共用一套密码子考点一

重组DNA技术的基本工具二、基因工程的诞生和发展历程(6)

体外重组的实现。(7)重组DNA表达实验的成功。(8)DNA测序和合成技术的发明。(9)

技术的发明。(10)

技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。DNAPCR基因组编辑考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”限制性内切核酸酶载体DNA连接酶考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具1、限制性内切核酸酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“）

主要从原核生物中分离纯化而来①来源：选择性必修3P71“旁栏思考”：原核生物中存在限制酶的意义是什么？提示切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。教材隐性知识考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“）

主要从原核生物中分离纯化而来①来源：数千种②种类：③特点：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开专一性选择性必修3P71“旁栏思考”：限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？提示原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰教材隐性知识考点一

重组DNA技术的基本工具EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“）④作用：断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键EcoRⅠ(识别GAATTC序列,在G与A之间切割)考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“）⑤作用结果：SmaⅠ(识别GGGCCC序列,在G与C之间切割)5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端中心轴线两侧中心轴线处切割一次，形成一个切口，两个黏性末端5'5'3'3'考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具GAATTCCTTAA

GG

AATTCCTTAAGGCTTAAAAT

TCGGCTTA

AAAT

TCG用同种限制酶切割(EcoRⅠ)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？思考：考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具GCTTAAAAT

TCGGCTTAAAATTCG考点一

重组DNA技术的基本工具AGATCTTCTAG

AG

GATCCCCTAGGATCTAGGAT

CTAGCCTA

GGAT

CCG用两种不同限制酶切割同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端，黏性末端相同的片段可以进行连接考点一

重组DNA技术的基本工具BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y能够连接的原因是

。酶切后产生相同的黏性末端，并遵循碱基互补配对原则【典例】考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具

缺口怎么办？ATCTAGGAT

CTAGCCTAGGATCCG考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具2、DNA连接酶（——”分子缝合针“）①作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。②类型：a、E·coliDNA连接酶：b、T4DNA连接酶：来源于大肠杆菌，只能“缝合”黏性末端来源于T4噬菌体，“缝合”黏性末端和平末端效率较低考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具选择性必修3P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶

(填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA连接酶连接的是

，而DNA聚合酶是把单个的

连接到已有的DNA片段上。②

起作用时需要以一条DNA链为模板，而

不需要模板。不是两个DNA片段脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA连接酶教材隐性知识考点一

重组DNA技术的基本工具与DNA有关的几种酶的比较考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具3、载体（——”分子运输车“）作为运载工具，携带外源DNA片段进入受体细胞。①作用：质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒②种类：

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。a、来源：真核或原核细胞b、结构：环状双链DNAC、特点：能自我复制考点一

重组DNA技术的基本工具三、重组DNA技术的基本工具3、载体（——”分子运输车“）③载体应具备的条件（特点）：c、有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选a、有一或多个限制酶切割位点b、能在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制通常是抗性基因，也可以是荧光蛋白基因）考点一

重组DNA技术的基本工具标记基因的筛选原理考点一

重组DNA技术的基本工具模拟重组DNA过程目的基因质粒重组DNA考点一

重组DNA技术的基本工具…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG模拟重组DNA过程通常用两种不同限制酶同时切割目的基因和载体（双酶切法）：防止载体自身连接、目的基因自身环化和确保目的基因插入的方向(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。提示限制性内切核酸酶Ⅰ：限制性内切核酸酶Ⅱ：(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。提示用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。考向

结合基因工程的基本工具，考查科学探究1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。C下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(

)A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接B2.(2024·广东珠海调研)大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是(

)A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养3.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中_______________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA连接酶连接。上图中_________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。EcoRⅠ、Pst

ⅠEcoRⅠ、Sma

Ⅰ、Pst

Ⅰ、EcoRⅤ(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是

。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能

；质粒DNA分子上有

，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指______________________________________________________________________________________________________。磷酸二酯键自我复制限制酶切割位点用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列考点二

基因工程的基本操作程序(2)利用PCR获取和扩增目的基因引物脱氧核苷酸耐高温温度1.目的基因的筛选与获取人工合成目的基因基因文库两种引物(2)利用PCR获取和扩增目的基因

耐高温的DNA聚合酶指数形式琼脂糖凝胶电泳2.基因表达载体的构建——核心受体细胞RNA聚合酶受体细胞中是否含有目的基因2.基因表达载体的构建——核心标记基因限制酶3.将目的基因导入受体细胞只有该步骤没涉及碱基互补配对原则目的基因子房T－DNA染色体DNA显微注射受精卵4.目的基因的检测与鉴定PCR抗原—抗体杂交考点二

基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定考点二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。1.目的基因：编码蛋白质的基因，或具有调控作用的因子2、筛选合适的目的基因①从相关的已知

的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用

和序列比对工具进行筛选。结构和功能清晰序列数据库考点二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取3、目的基因的获取①人工合成目的基因：

（化学合成法、逆转录法）当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。②PCR

和扩增目的基因获取a、PCR（聚合酶链式反应）：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。考点二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取②PCR

和扩增目的基因获取b、PCR反应的条件：一定的缓冲溶液（一般添加Mg2+激活DNA聚合酶）DNA模板（需含有目的基因）四种脱氧核苷酸(或dNTP）耐高温的DNA聚合酶（不需要解旋酶，DNA在高温下解旋）2种引物能严格调控温度的温控设备PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题：考点二

基因工程的基本操作程序(1)什么是引物？(2)PCR技术为什么需要引物？ATCGAATCGGTT

TAGCTTAGCCAADNA聚合酶母链DNA子链DNA引物3′5′5′DNA聚合酶不能从头合成子链，只能从3’端延伸DNA链引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3′引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3’端连接脱氧核苷酸考点二

基因工程的基本操作程序(3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？提示目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2(4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？提示两种引物之间不能互补配对。考点二

基因工程的基本操作程序(5)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。考点二

基因工程的基本操作程序(6)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？提示经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。考点二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取②PCR

和扩增目的基因获取c、PCR反应的过程：90单链50引物72d、PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定。考点二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取①人工合成目的基因：②PCR

和扩增目的基因获取③通过构建基因文库来获取目的基因3、目的基因的获取考点二

基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、目的：使目的基因

，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代启动子标记基因2、基因表达载体的组成及作用：考点二

基因工程的基本操作程序提醒启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)考点二

基因工程的基本操作程序载体（质粒）DNA分子（含目的基因）同种限制酶处

理或产生相同黏性末端的不同

种限制酶处理带有黏性末端切口带有相同黏性末端的目的基因片段重组DNA分子（重组质粒）3、基因表达载体构建过程（课本P80）种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞（感受态）→基因表达载体导入细胞中考点二

基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞能发育成完整个体繁殖快、单细胞、遗传物质少考点二

基因工程的基本操作程序Ti质粒目的基因构建基因表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌植物细胞导入植物细胞表现出新性状的植物将目的基因插入染色体DNA中T-DNA植物组织培养注意：1、农杆菌转化法过程可转移的DNA将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达考点二

基因工程的基本操作程序辨析：①农杆菌转化法小结：Ti质粒目的基因构建基因表达载体转入农杆菌导入植物细胞T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中表达新性状

该过程经过____次拼接、____次导入？(1)第一次拼接___________________________(2)第二次拼接___________________________(3)第一次导入___________________________(4)第二次导入___________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）优先选择受伤的叶片与重组质粒的农杆菌培养，叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌考点二

基因工程的基本操作程序辨析：②转化：转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。考点二

基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定(如分子杂交技术)原理：抗原抗体特异性结合考点二

基因工程的基本操作程序△DNA分子杂交技术——检测目的基因是否插入15N15N变性变性探针（PCR扩增）转基因生物的DNA杂交DNA分子（PCR扩增）出现杂交带考点二

基因工程的基本操作程序△分子杂交技术——检测目的基因是否转录探针（PCR扩增）出现杂交带转基因生物的mRNA15N15N变性DNA-RNA杂交分子1.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。①第1组：_______________________________________________________；②第2组：_______________________________________________________。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效2.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？

提示

经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。D考向

围绕基因工程的操作程序，考查科学探究1.(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(

)A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落2.(2023·全国乙卷，38)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指___________________________________________________________________ ______________________________________。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为

；②为

，其作用是___________________________________________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_______________________________。终止子启动子提供RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动GFP突变基因转录出mRNA将含有表达载体的细胞筛选出来(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是____________________________________________________________________________________________________________(答出1点即可)。(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是____________________________________________________________________________________________________________。 GFP基因虽然发生了突变，但由于存在密码的简并现象(密码子的简并)，突变基因所编码的氨基酸序列并未改变

将YFP基因插入表达载体，再将构建成功的重组表达载体导入不能发黄色荧光的真核细胞中，观察黄色荧光是否出现3.(2023·全国甲卷，38)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。 (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是__________________________。 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是

。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是

。疫苗中不含乙肝病毒DNA用于筛选含有重组表达载体的细胞RNA聚合酶(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取

进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是____________________________________________________________________________。(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。___________________________________________________________________________________。染色体DNA(基因组DNA)

与目的基因特异性互补且带有标记的DNA片段(带标记的含有目的基因的DNA片段)从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定1.DNA的粗提取与鉴定不溶于2mol/L二苯胺(2)方法步骤研磨上清液95%一个方向2mol/L二苯胺5min蓝色2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础可解离相反琼脂糖凝胶电泳大小和构象(2)PCR实验操作步骤微量移液器离心管底部PCR仪(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______________的紫外灯下被检测出来。①成功扩增出DNA片段的判断依据是____________________________________。②进行电泳鉴定的结果应该是____条条带。如图所示，该片段大小约为________

bp。300nm可以在紫外灯下直接观察到DNA条带一750考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定一、DNA的粗提取与鉴定1、基本原理：不溶于2mol/L二苯胺沸水浴考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定2、实验材料：新鲜洋葱（香菜、菠菜、菜花或猪肝等）不能用哺乳动物成熟的红细胞（如猪血细胞），因为无细胞核和各种细胞器可以用鸡血细胞，需加入柠檬酸钠，防止血液凝固一、DNA的粗提取与鉴定考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定一、DNA的粗提取与鉴定95%沸水注意加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、操作流程：a、抑制DNA水解酶的活性，防止DNA降解；b、低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂；c、降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出破碎细胞考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定二、DNA片段的扩增和电泳鉴定1、实验原理：①PCR原理：利用了

原理。DNA的热变性②电泳：DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷

的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的

等有关。相反大小和构象考点三

DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定二、DNA片段的扩增和电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳(1)DNA鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色。(2023·广东卷，11D)(

)(2)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(2022·山东卷，13A)(

)(3)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。(2022·湖北卷，5)(

)×√×(4)PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。(2022·辽宁卷，12C)(

)(5)用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近。(2019·江苏卷，10A)(

)××D考向1

结合DNA的粗提取与鉴定，考查科学探究能力1.(2023·广东卷，11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(

) A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色A2.(2021·山东卷，13)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(

) A.加入适量的木瓜蛋白酶 B.37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟 C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精 D.加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→加入NaCl调节浓度至0.14mol/LD考向2结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究3.(2024·广东肇庆调研)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的是(

)A.该载体最可能为环形DNA分子B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C.限制酶R1与R2的切割位点最短相距200bpD.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂4.(2024·山东烟台模拟)PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题：(1)DNA复制时子链延伸的方向是

(填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为

。图15′→3′引物(2)如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列出的引物中选出一对合适的引物

。5′—GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG—3′3′—CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC—5′图2引物Ⅰ引物Ⅱ甲5′—GACCTGTGGAAGCA5′—CATACGGGATTG乙5′—CTGGACACCTTCGB5′—GTATGCCCTAAC丙5′—CGAAGGTGTCCAGC5′—GTTAGGGCTTAC丁5′—GCTTCCACAGGTCD5′—CAATCCCGTATG甲和D(3)下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内容。a.按配方准备好各组分。b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA、4种脱氧核糖核苷三磷酸、

、引物、缓冲液等。c.

使反应液聚集在微量离心管底部。d.将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。e.进行PCR。(4)PCR的产物片段中，只有

才是符合要求的目标产物。耐高温的DNA聚合酶离心双链短产物片段1.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(

)BA.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli连接酶或