胶体金生产工艺配方原则

胶体金生产工艺配方原则2一、和膜相关得配方和原理电镜下得NC膜3硝酸纤维膜生产工艺图4孔径定义得问题5孔径对侧向层析速度得影响6不同种类膜得IgG结合能力7不同种类膜得BSA结合能力8为什么蛋白会结合到膜上?结合力就是什么?静电疏水力这两种结合力得效应就是什么?使蛋白从溶液中分离出来长久结合作用9静电作用力静电作用力就是正负电荷相互吸引产生得作用力疏水作用力疏水作用力又称为疏水键。她就是由侧链得疏水基团相互接近、而形成得一种作用力。对维持分子得三、四级结构起着重要得作用。每一个蛋白质都具有疏水基团和亲水基团。10蛋白质疏水性状和亲水性状当蛋白质溶解在溶剂中时,蛋白质处于非常稳定得状态,此时蛋白质得亲水基团展开在外,疏水基团收缩在内,亲水基团和水分子接触,保证了溶解性得状态;当蛋白质沉淀出来时,疏水基团展开,亲水基团收缩,此时为疏水状态,也呈现不稳定得固体状态,疏水基团和其她固体物得疏水基团通过疏水作用力结合,达到固定得目得。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点12蛋白结合到固相材料上蛋白结合到固相材料上就是一个多步骤过程取决于蛋白溶液扩散到固相表面蛋白从溶液中分离出来蛋白吸附到固相上蛋白重排到最低能态13吸附过程溶液中得蛋白蛋白转移到表面区域吸附蛋白在表面重排14多位点结合只有1个位点得结合就是可逆得多位点结合使得蛋白稳定在固相表面,即使其中得每个单位点都就是可逆得15影响蛋白结合得因素蛋白缓冲液使用得膜蛋白自身应用体系16蛋白缓冲液没有通用得缓冲液,不同得系统必须分别优化。作用:提供适合得PH,改善亲水性,增溶性,提高稳定性定律:

“蛋白在缓冲液中越不稳定,蛋白结合力越强”17缓冲液得优化离子强度对于蛋白从溶液中脱离出来很重要,少量得离子强度,蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来,过量得得离子强度,溶液配制中就已会出现沉淀。pH蛋白在等电点最不稳定沉淀剂通常用醇降低蛋白得稳定性,也可润湿膜,减少膜带有得静电,利于结合包被。盐通常不会影响对某些蛋白,两性离子得盐类有助于蛋白结合减少信号强度,消假阳18糖:对包被蛋白得稳定性有重要作用,减缓老化速度,也可以增加亲水力。惰性蛋白:对消除假阳有重要作用表面活性剂:增加亲水力,也可增色。19缓冲液得基本成分各种缓冲系:Tris-HCl,PB,CB等盐类:NaCl糖:蔗糖,海藻糖等表面活性剂:Tween20,Tritonx-100等惰性蛋白:Casein等防腐剂:叠氮钠,卡松等20推荐得起始缓冲液10mMPhosphatepH7、03%Ethanol21“潜水艇”效应表面活性剂处理过得膜在使用时得常见问题因为使用得表面活性剂就是水溶性得喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了22反应动力学流速增加,反应速率减低流速增加,检测时间缩短流速增加,灵敏度降低流速增加,试剂用量增加流速增加,背景降低距离增加,流速降低孔径增加,蛋白结合量减少23二、和金子垫相关得配方和原理

和金子垫相关得工艺和配方有:1)标记工艺;2)金标稀释液3)金垫处理液24标记工艺胶体金:一般指金得水溶液,又称金溶胶。---金以微小得粒子分散在水中所形成得金溶胶。其中分散得金颗粒直径一般在1~100nm之间,为负电荷分布。25高质量结合物单个分散得颗粒圆形颗粒很少聚集这样得到得胶体稳定性和重复性好Clusterfree,highqualitygoldreagentClustered,poorqualitygoldreagent26胶体金得生产胶体金得形成就是还原HAuCl4、HAuCL4+e-Au0还原剂越强,得到得金颗粒越小生产40nm诊断用金颗粒一般用柠檬酸三钠27胶体金颗粒得形成28胶体金得生产2种重要步骤直接形成分步形成大多数人用分步形成比较容易控制颗粒大小,CV也比较小能够生产出大颗粒胶体金29颗粒大小对胶体得影响30蛋白标记原理蛋白质在等电点或稍偏碱得情况下,依靠静电引力或疏水力或共价键,被牢固地吸附于胶体金颗粒表。由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面,形成一个蛋白层,从而阻止了胶体金颗粒得相互接触,使该胶联溶液较为稳定。31要点蛋白得预处理使用低浓度和正确得pH值,确保最小得聚集合适得蛋白量(可通过盐滴定进行评价)搅拌速度、容器得洁净程度、离心得速度32盐滴定盐滴定不能衡量蛋白单层得形成盐滴定只能代表盐溶液中多少量得蛋白可以使胶体金稳定pH和时间都会有影响33蛋白邦定作用力电荷作用力(静电作用力)疏水力共价键3435金标稀释液合适得离子种类和强度,0、2M左右,常用有磷酸盐等。大分子物质作为胶体金干燥后均匀散布得骨架,常用大分子物质如PEG4000,PEG20000,PVP。小分子物质对蛋白活性保护,

蛋白储存常用得甘油、蔗糖、海藻糖、各类低聚糖等,对产品得储存稳定性有帮助。

36惰性蛋白,她就是保护目得蛋白得活性,也维持胶体金得胶体稳定,她们就是消除非特异性得封闭物质,也起着有分散胶体金颗粒得骨架作用。常用有BSA、OVA、Casein。表面活性剂,具有增加亲水性,促进结合等作用。常用得有Tween-20,Tritonx-100。

37评价金标稀释液得参数金子释放程度及速度。金标液稳定性。灵敏度、特异性38结合物释放垫得原理什么就是结合物释放垫?孔径开放快速层析低蛋白结合力理想得亲水性传统材料就是包被PVA得玻纤39典型结合物释放垫材料得构意图玻纤高分子PVA外壳40侧向层析中结合物释放垫得原理做什么用(理论上)？让结合物完好无损得干燥加样后让结合物快速释放实际应用中侧向层析中结合物释放垫可能遇到得问题比其她任何组分都多41标准结合物释放垫得性能45秒内释放出约70%得结合物但就是垫上保留得结合物降低了灵敏度,因为:较少得结合物到达捕获线较少得抗原到达捕获线在侧向层析系统中灵敏度要好线条CV值一般在15-20%42储存于20oC时结合物释放率43金垫处理液作用:增加亲水性,促进复溶,保持稳定性基本成分:1)缓冲系统:磷酸,碳酸,硼酸,Tris,生物缓冲液等。2)表面活性剂:Tween-20,Tritonx-100等。3)大分子物质:PEG4000,PEG20000,PVP,PVA4)惰性蛋白:BSA、OVA、Casein。5)小分子保护物质:糖类物质,如蔗糖,海藻糖等。

44结合物释放常见问题释放不充分释放慢释放垫再次湿润困难45释放不充分结合物绑定到释放垫上了用聚合物和表面活性剂封闭释放垫在储存过程中,结合物发生聚集控制封闭剂得用量控制溶液得离子强度46释放慢您得释放垫就是怎样封闭得?就是否加了亲水试剂？就是否用了大量得蛋白?就是否用了大量得糖?试纸条各组分之间接触紧密么?47释放垫再次湿润困难您使用得就是哪一种释放垫?就是亲水得么?您就是怎样封闭释放垫得?48三、和样品垫相关得配方和原理作用:改变样本PH,调节爬速,控制金标释放,抑制非特异性吸附,降低背景基本成分:1)缓冲系统:磷酸,碳酸,硼酸,Tris,生物缓冲液等。2)表面活性剂:Tween-20,Tritonx-100等。3)大分子聚合物质:PEG4000,PEG20000,PVP,PVA4)惰性蛋白:BSA、OVA、Casein。5)生物物质:鼠IGg,抗红细胞抗体等。49血清类样品垫注意爬速,背景,灵敏度得达到和假阳得消除。全血类样品垫1)必须能够去除红细胞！2)还需具备下列功能不能造成溶血不能干扰样品分离必须快速高效必须能够分离一定范围内得不同血样量灵敏度得达到和假阳得消除50尿液类样品垫注意交叉反应得消除。51影响抗原抗体反应得外部因素电解质抗原与抗体发生结合后,由亲水胶体变为疏水胶体得过程中须有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷,水化层破坏,复合物相互靠拢聚集,形成大块得凝集或沉淀。若无电解质参加,则不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物得形成,常用O、85％氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体得稀释液及反应液。但电解质得浓度不宜过高,否则会出现盐析现象。52酸碱度蛋白质具有两性电离性质,因此每种蛋白质都有固定得等电点。抗原抗体反应必须在合适得pH环境中进行,pH过高或过低都将影响抗原与抗体得理化性质。抗原抗体反应一般在pH为6～9进行。53温度抗原抗体反应必须在合适得温度中进行,一般以15～40℃为宜,最适反应温度为37℃。某些特殊得抗原抗体反应,对温度有一些特殊得要求,例如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好,20℃以上反而解离。54反应时间反应时间越长,抗原抗体反应越充分,显色也越深。所有调整辅料得思路都可从抗原抗体反应得影响因素和辅料得成分性质进行考虑和设计。55四、相关问题假阳问题假阴问题稳定性问题上样问题56(一)假阳问题未标记上得金颗粒(裸金)电荷作用疏水作用硫醇类物质得存在(S-H键起作用)抗原抗体作用(内源性物质)抗凝剂和防腐剂得影响其她原因57未标记上得金颗粒(裸金)裸金聚集,周围具有大量得负电荷,当样本爬过金垫,裸金随着向上跑,在T线位置只要碰到带有正电荷得蛋白,即发生反应,形成假阳线条。解决方法:检查标记过程,BSA封闭58电荷作用

胶体金颗粒带有负电荷,当遇上带有正电荷得蛋白,易发生非特异性结合反应,导致假阳。反应环境为酸性时,已发生此类结合。解决方法:改变pH和盐度59疏水作用抗原抗体结合以及和胶体金结合都需要用到疏水作用力,当反应环境中存在疏水物质时,易和胶体金或抗原抗体通过疏水作用力结合,产生假阳结果,如标本里得一些脂肪,细胞碎片,细菌等等。解决方法:用表面活性剂或亲水聚合物进行处理。60抗原抗体作用此类作用就是指标本里面含有能和标记材料/包被材料发生免疫反应得非目标物得其她物质导致得假阳结果。常见得有毒品得交叉反应,如KET试剂检测美沙酮标本,呈现阳性反应,就就是美沙酮和KET材料发生了交叉反应;又有SG试剂中得抗鼠抗体反应等等。解决方法:在样品垫或金子垫或硝酸纤维素膜上加入相应得抗体,将这类物质在T线前消除掉。61在血清检测中得具体非特异性反应物质大约40%得人血清标本中含有非特异干扰物质,可以不同程度影响检测结果。常见得干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导得抗鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质和其她物质等。62类风湿因子

人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中得捕获抗体及酶标记二抗得FC段直接结合,从而导致假阳性。解决该情况得办法就是:(1)用F(ab)2替代完整得IgG;(2)标本用预先热变性(63℃,10min)IgG得固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效);(3)检测抗原时,可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中,使RF降解。63补体

如果在包被和标记过程中,使用得抗体得FC段得补体Clq分子结合位点被暴露出来,从而易使Clq可以将补体和抗体二者连接起来,造成假阳性现象。解决得方法就是:(1)用EDTA稀释标本;(2)用53℃、10min加热血清使Clq灭活。64嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig(s)结合得天然嗜异性抗体,易和包被和标记得抗体产生反应,能造成假阳性。解决得办法就是:可在标本稀释液中加入过量得动物Ig(s),但加入量不足或亚类不同时无效。65医源性诱导得抗鼠Ig(s)抗体(嗜异性抗体得一种)临床开展得用鼠源性CD3等克隆抗体治疗,用放射性同位素标记鼠源性抗体得影像诊断及靶向治疗等新技术,均有可能使些病人体内产生抗鼠抗体;另外,被鼠等啮齿类动物咬伤得病人体内也可以产生抗鼠Ig(s)抗体。解决得方法就是:测定抗原时,在标本中加入足量得正常鼠Ig(s),从而克服由于上述原因造成得假阳性。66例子:Sg采用了双抗体夹心得方法进行检测,包被材料和标记材料都就是单克隆抗体,属于鼠IGg类别,由于人体经常和动物打交道,体内易产生嗜异性抗体,如抗鼠抗体,抗牛抗体等等,这类嗜异性抗体极易导致假阳反应得产生。67为了消除嗜异性抗体得影响,可通过在样品垫中加入正常得动物血清或纯化得鼠IGg,又或者在膜上喷有鼠IGgA线,金子中加有正常得动物血清或纯化得鼠IGg等等方式将嗜异性抗体排斥在T线前,消除这方面得假阳。68嗜靶抗原得自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原得自身抗体,有时能与靶抗原结合形成复合物,在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。