T-GRM 100-2024 深色有隔内生菌胞外聚合物生产工艺规范

ICS13.020.01CCSD00/09GRMProductionProcessSpecificationsforExtracellularPolymericSubstancesofDarkIT/GRM100—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 3.1菌种选择 3.2培养基的配制 3.3培养基优化配制 3.4培养条件 3.5提取与纯化 23.6冻干粉胞外聚合物制备方式 23.7液态胞外聚合物制备方式 23.8胶囊胞外聚合物的制备方式 23.9产品形式与储存 24检验与质量控制 24.1深色有隔内生菌胞外聚合物产量 24.2深色有隔内生菌胞外聚合物成分组成 24.3深色有隔内生菌胞外聚合物外观质量测定 25安全与环保要求 36产品包装、运输标识 36.1产品包装 36.2运输标识要求 3附录A（规范性）胞外聚合物官能团的测定 4A.1方法提要 4A.2仪器 4A.3分析步骤 4A.4结果计算 4A.5允许差 4T/GRM100—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本标准适用于深色有隔内生菌胞外聚合物的生产过程，旨在规范生产工艺，确保产品质量，满足矿山生态修复、农田土壤改良和环境治理工程等领域的实际需求。通过对培养条件、生产工艺、产品质量控制及安全管理的系统规范，为胞外聚合物的产业化应用提供了技术指导。本文件由中关村绿色矿山产业联盟提出并归口。本文件起草单位：西安科技大学西部矿山生态环境修复研究院、中国矿业大学（北京）矿山生态修复研究院、天山实验室、北京合生元生态环境工程技术有限公司。本文件主要起草人：毕银丽、彭苏萍、谭海、张士双、解琳琳、赵静、白雪蕊、武超、肖礼、张延旭、柯增鸣、王坤、全文智1T/GRM100—2024深色有隔内生菌胞外聚合物生产工艺规范本标准规定了由深色有隔内生菌合成胞外聚合物的技术要求，包括菌种选择、培养基配制、培养条件、生产过程控制、产品收集与纯化、质量检测、产品包装标识、运输标识等要求。本文件适用于以微生物为生产主体的胞外聚合物工业化生产工艺流程。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。HJ/T415-2008环保用微生物菌剂环境安全评价导则GB4789.2-2022食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB4789系列标准检测产品微生物安全性3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1菌种选择生产菌种为深色有隔内生菌Alternariasp.17463，为安全、可控的微生物。在矿区生态修复领域已取得较好的生态修复效应。该菌种经过于中国西北内蒙古自治区锡林浩特市胜利露天矿土壤中分离、鉴定和筛选，并符合相关生物安全要求。3.2培养基的配制活化培养基主要成分包括：将土豆切成小块放入锅中，加水1000mL加热至沸腾，维持20-30min，经8层纱布过滤，保留上清。加入葡萄糖20g，琼脂18g，121℃灭菌20min。种子培养基主要成分包括：蔗糖10g/L、麦芽提取物10g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.45g/L及维生素B10.02g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。发酵培养基主要成分包括：蔗糖30g/L、麦芽提取物25g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.45g/L及维生素B10.02g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。3.3培养基优化配制葡萄糖替换为蔗糖，浓度从10g/L提高至30g/L，麦芽提取物浓度从10g/L提高至25g/L，硫酸镁浓度从0.25g/L提高至0.45g/L，磷酸氢二钾浓度从0.5g/L提高至2g/L，磷酸二氢钾浓度从0.5g/L提高至1g/L，pH从6.0提高至7.0。该配比条件下，确保了深色有隔内生菌的生物量和胞外聚合物的产量和质量。3.4培养条件3.4.1活化培养条件取约5mm的菌饼于活化培养基28℃培养7-10天。确保菌饼底部为黑色，顶部菌丝为白色。菌株传代次数应控制在20代以内。3.4.2种子培养条件2T/GRM100—2024取约5mm的菌饼接种于装有200mL种子培养基的500mL锥形瓶中，28℃,180r/min培养2天，使该菌株生长至对数生长期。3.4.3发酵培养条件将培养好的种子接种于装有7L发酵培养基的10L发酵罐中，接种量为10%，初始搅拌转速为400r/min（提高发酵液溶氧，便于菌体的快速增长），6h-120h搅拌转速设置为300r/min（降低转速减少搅拌桨对菌体的损伤），罐体压力为0.05MPa，共培养5天，发酵结束后发酵液较为粘稠，菌丝量较大，发酵液与菌丝较难分开。可采用分批发酵、流加发酵或连续发酵工艺，具体选择视规模和生产需求而定。3.5提取与纯化发酵液通过离心、沉淀（如酒精沉淀法）或膜分离技术进行粗提。进一步纯化可采用超滤、柱层析等方法，根据应用需求确定纯化程度。3.6冻干粉胞外聚合物制备方式烘干法应严格控制温度。烘干法和冻干法两种制备方法得到胞外聚合物结构组成一致。3.6.1烘干法将提纯后的胞外聚合物絮状沉淀放置于烘箱中，45℃烘干至恒重，并通过破碎机破碎为粉末状，便于溶解使用。3.6.2冻干法将提纯后的胞外聚合物放置于冷冻干燥机中，冷凝器设置温度为-80℃,真空度小于10Pa，脱水24h后使用破碎机破碎为粉末。3.7液态胞外聚合物制备方式将胞外聚合物溶于水后振荡，使胞外聚合物完全溶于水中。制备浓度和体积可根据实际施用需求、方式和地点而定。3.8胶囊胞外聚合物的制备方式将烘干或冻干研磨后的胞外聚合物粉末使用胶囊机制成胞外聚合物胶囊，胶囊遇水可以降解，缓释出胞外聚合物，每个胶囊胞外聚合物含量约0.2g，密封防潮吸水。3.9产品形式与储存最终产品可为胞外聚合物冻干粉、胶囊或液态（溶于水储存条件应避免高温、高湿等条件。推荐储存温度：液态胞外聚合物2–8°C，胞外聚合物冻干粉或胶囊产品可室温保存，需配制干燥剂。避免胞外聚合物保存在45℃以上和0℃以下，空气湿度超过40%的条件中。4检验与质量控制4.1深色有隔内生菌胞外聚合物产量采用干重法计量。4.2深色有隔内生菌胞外聚合物成分组成功能基团：采用红外光谱分析，参照附录A。4.3深色有隔内生菌胞外聚合物外观质量测定采用目视检测法和扫描电镜观测法执行。研磨后的胞外聚合物为粉末状，扫描电镜200倍下为絮状结构。3T/GRM100—20245安全与环保要求生产过程中应严格设置尾气处理装置，使用1mol/L氢氧化钠收集尾气，确保符合环境保护相关法规要求。6产品包装、运输标识6.1产品包装6.1.1粉剂和胶囊产品粉剂产品使用清洁的50mL闭口离心管包装，每管产品的净重30g，离心管内添加干燥剂。胶囊产品使用密闭溶剂包装，容器内需配制干燥剂，周围温度切勿超过45℃。6.1.2液态胞外聚合物产品胞外聚合物液体应盛装于密封性能良好的耐压容器中（如塑料桶、玻璃瓶或专用塑料袋并有防渗漏措施。容器外层应使用防护包装（如泡沫箱或瓦楞纸箱），以防止运输过程中容器损坏或泄漏。周围温度切勿超过45℃。6.2运输标识要求产品应避免雨淋、受潮、曝晒以及与有毒、有害或易污染的物品混装运输。包装上应清晰标注“防潮”、“防晒”等警示标志以及产品名称、批次号、净重、储存条件等信息。4T/GRM100—2024（规范性）胞外聚合物官能团的测定A.1方法