高三二轮复习生物：标记基因专题训练

标记基因专题复习1标记基因的作用基因工程操作的第三步是将目的基因导入受体细胞，导入受体细胞的不是单独的目的基因，而是载体与目的基因在限制酶和DNA连接酶的作用下形成的重组DNA分子。这一步操作中需要进行筛选，需要筛选出哪些受体细胞中导入了目的基因。筛选时需要用到与目的基因重组的载体上的标记基因，标记基因是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。例1.（2023年全国乙卷节选）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为；②为，其作用是；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是。2标记基因的种类及筛选原理质粒等载体上常有特殊的标记基因，标记基因一般是抗生素的抗性基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，但是标记基因不能等同于抗性基因。高中生物学教学中标记基因的种类主要包括抗生素抗性标记基因、β-半乳糖苷酶显色反应标记基因和营养标记基因等。2.1抗生素抗性标记基因常用的抗生素抗性标记基因主要有氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（chlr）及卡那霉素抗性基因（kanr）等。抗生素抗性标记基因的筛选原理如下：①前提：目的基因要转入的受体细胞如大肠杆菌（填“有”或“没有”）抵抗相关抗生素的能力。②过程：将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，然后把受体细胞培养在含有该抗生素的培养基中。③结果：抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在培养基上，被抗生素杀死的细胞是，未被杀死的细胞是。④原理如下图所示：例2.（2021年全国乙卷）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有______________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是。2.2β-半乳糖苷酶显色反应标记基因某些载体，如M13噬菌体，PUC质粒系列、pGEM质粒系列等，它们的载体上都携带lacZ′基因一段序列，它编码β-半乳糖苷酶的α肽，产生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培养基中的无色X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色[1]。若将外源基因插入到载体上lacZ′序列中，使α基因失活，使α肽失活。因此携带空载体的大肠杆菌呈蓝菌落，携带外源基因的大肠杆菌呈白菌落[2]。例3.图甲为一种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段。Ap为氨苄青霉素抗性基因，lacZ′为蓝色显色基因，其表达产物可以将无色化合物X-gal转化成蓝色物质，使菌落呈蓝色。EcoRⅠ、PvuⅠ为限制酶。回答下列问题：获取目的基因D时应选择图乙中的_________对其所在的DNA进行切割。利用自身不含lacZ′基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，要在已转化的含重组质粒的受体细胞、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的受体细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是。2.3营养标记基因当细胞中合成某种营养物质的酶的编码基因失活，就成为营养缺陷型，但如果导入细胞的重组DNA分子能够弥补缺陷的基因，培养基中就无需补充有关的营养成分。营养标记为重组体克隆的选择提供了方便的方法[2]。例4．（2021年江苏卷改编）URA3基因是酵母筛选标记基因，缺失该基因酵母无法合成尿嘧啶，用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入重组质粒A-m（A为载体，上面含有URA3基因，m为目的基因），然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是。3利用影印平板培养法进行筛选3.1只有1个标记基因时会出现“假阳性”现象若载体上只有1个标记基因,一般不能破坏其结构,否则无法在导入重组质粒后对含有重组质粒的受体细胞进行筛选。载体上只有1个标记基因时会出现“假阳性”现象，即导入了含有目的基因的重组质粒的受体细胞和导入了不含目的基因的空质粒的受体细胞都能正常表达标记基因,造成无效筛选。3.2有两个及以上标记基因时的筛选外源DNA片段插入抗生素抗性基因内部时，将导致相应的抗性基因的失活。这种因外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活[1]。若载体上有两个及以上的标记基因,则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏,从而达到比只有1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”现象。例如,载体上含有两个不同的标记基因A和B，若目的基因插入到标记基因A内部时，会使标记基因A的结构遭到破坏而失去活性。选择标记基因A不能正常表达而标记基因B能正常表达的受体细胞，即为成功导入了重组载体的受体细胞。此时常运用“影印平板培养法”来检测重组载体是否导入受体细胞。例5．（2023年湖北卷）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落3.3利用影印平板培养法筛选影印平板培养法是一种通过盖印章的方式，达到在一系列培养皿平板的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种和培养方法[3]。影印平板培养法最初是证明抗药性突变并非由于接触了药物引起的，而是突变在接触药物之前就已自发地随机地产生了，药物只是起着定向选择作用。在基因工程中可以利用影印平板培养法检测基因表达载体是否导入受体细胞，如下图所示，利用EcoRⅠ和BamHⅠ两种限制酶构建基因表达载体并且导入无青霉素和四环素抗性的大肠杆菌中，将大肠杆菌培养在含青霉素的培养基A中，形成如图所示的6个菌落，然后利用影印平板培养法原位接种在含四环素的培养基B中，形成如图所示的4个菌落。培养基A中的菌落就是含有重组质粒的大肠杆菌。例6.（2016年课标Ⅰ卷改编）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化原本无Ampr和Tetr的大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：1）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是；并且和的细胞也是不能区分的，其原因是。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有的固体培养基。2）上述筛选的具体步骤如下，先将大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的固体培养基上培养，得到如图2的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的固体培养基上培养，得到如图3的结果(空圈表示与图2对照无菌落的位置)。图3结果显示，多数大肠杆菌中导入的是___________，与图3空圈相对应的图2中的菌落表型是___________________________________，即为含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落。标记基因专题复习参考答案例1、鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。例2、答案：一至多个限制酶切割位点用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞例3、答案：PvuⅠ将受体细胞接种在含有氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上培养，形