高三二轮复习生物：基因工程中的各种鉴定课件

2025年高考生物学

复习

生物技术与工程二轮

微专题：基因工程中鉴别相关问题强化教学内容展示步骤二

鉴别是否成功构建基因表达载体

步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞步骤四

目的基因的检测与鉴定步骤一PCR扩增产物鉴别

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。转基因抗虫棉非转基因抗虫棉从社会中来苏云金杆菌与载体拼接

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因构建基因表达载体思考

如何鉴别PCR扩增产物？加样孔→PCR仪在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像有关。扩增的结果：DNA条带的分布及粗细程度通过与指示分子大小的标准参照物（DNAMarker)对比，大致估计样本DNA的大小步骤一PCR扩增产物鉴别将Bt基因通过PCR扩增，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到电泳图谱如下：思考：①耐高温的DNA聚合酶失活；②引物出现质量问题；③变性时温度低，变性时间短④Mg2+浓度过低①引物特异性不强或容易聚合成二聚体②复性时温度过低③DNA聚合酶的浓度过高④模板DNA出现污染⑤Mg2+浓度过高未出现扩增条带可能的原因有：出现非特异性扩增条带可能的原因有：步骤一PCR扩增产物鉴别【典例1】

镉(Cd)作为一种重金属元素，会严重威胁人体健康。科研人员将Cd响应启动子CadR与绿色荧光蛋白基因(EGFP)组合在一起导入大肠杆菌，构建能够检测环境中Cd污染的生物传感器。已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。相关信息如图所示，其中P1、P2、P3表示引物。（1）通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来，该技术所依据的原理是______。对PCR产物进行电泳检测，结果显示除EGFP基因条带外，还有多条非特异性条带(引物和模板不完全配对导致)。为减少非特异性条带的产生，可适当_______(填“提高”或“降低”)PCR中复性过程的温度。不同的DNA分子大小、构象不同，在凝胶中的迁移速率不同提高步骤一PCR扩增产物鉴别【典例2】

（2023·广东·高考真题节选）为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。提醒

核酸电泳进行突变基因检测步骤一PCR扩增产物鉴别【典例3】

步骤一PCR扩增产物鉴别

碱基缺失

3

1

步骤一PCR扩增产物鉴别苏云金杆菌与载体拼接

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因构建基因表达载体

思考鉴别是否成功构建基因表达载体（目的基因是否正确插入载体，包括位置、顺序等方面）【典例4】

图甲图乙

不是F2和R1或F1与R2步骤二

鉴别是否成功构建基因表达载体

【典例5】

（2021·辽宁·高考真题节选）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9kb(1kb=1000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题:图1注:M为指示分子大小的标准参照物;小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养,随机挑取单菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒,用PvuⅡ和EcoRⅠ进行酶切,酶切产物经电泳分离,结果如图2,

号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。3步骤二

鉴别是否成功构建基因表达载体

苏云金杆菌与载体拼接

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因构建基因表达载体

思考鉴别目的基因是否导入受体细胞。方法：PCR扩增、电泳检测，制备培养基筛选。鉴定并筛选出含有基因表达载体（重组质粒）的受体细胞（1）最常用的标记基因是抗生素的抗性基因和抗除草剂基因：如氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）及卡那霉素抗性基因（kanr）等。（2）利用营养缺陷型宿主可以将相应生物合成基因作为标记基因。带有合成基因的载体可使宿主细胞在基础培养基中生长，无需补充原来所缺的营养成分。（3）颜色反应报告基因：如蓝白斑筛选相关基因（LacZ基因），绿色荧光蛋白基因（GFP基因），荧光素酶报告基因等。常见标记基因种类步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞

有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：【情境1】Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞①②③④1235487691235487691.影印含氨苄青霉素含四环素（或两种抗生素都有）2.挑选有③和④只有③

影印平板法结果：在氨苄青霉素平板上生长、但在四环素

平板上不长的菌落（2、4、5）即为④。步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞【与课本联系P98页】

某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。请根据以上信息回答下列问题。

(3)选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有哪些优势？该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，含有空质粒（没有连接目的基因的质粒）的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞【与课本联系P98页】

某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导人大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。请根据以上信息回答下列问题。

(4)含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什么颜色？为什么？含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达，形成β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解。步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞【典例6】(4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将转化后的大肠杆菌接种到含有四环素和X-gal的培养基上，结果发现长出了蓝色和白色两种菌落。若需进一步鉴定该生物传感器是否制备成功，需要进行的操作是_______。

镉(Cd)作为一种重金属元素，会严重威胁人体健康。科研人员将Cd响应启动子CadR与绿色荧光蛋白基因(EGFP)组合在一起导入大肠杆菌，构建能够检测环境中Cd污染的生物传感器。已知LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。相关信息如图所示，其中P1、P2、P3表示引物。

挑选白色菌落，放在含镉的培养基上培养，观察菌落是否有绿色荧光出现步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞【典例7】(2024·辽宁·高考真题节选)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞【典例7】注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。p35s为启动子(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。HygBRF3R2步骤三

鉴别目的基因是否导入受体细胞1.分子检测2.个体水平鉴定③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等②检测目的基因是否转录出了mRNA①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？步骤四

目的基因的检测与鉴定

类型检测内容方法

分子

检测目的基因是否整合到受体细胞染色体DNA上目的基因是否转录出mRNA目的基因是否翻译出蛋白质个体水平鉴定