基因工程的基本操作程序 高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序第2课时将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序（4个步骤）目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定旧知回顾目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。实质：将目的基因整合到受体细胞基因组中。将目的基因导入受体细胞的方法：导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法显微注射法Ca2+转化法（我国科学家独创）（常用）转化的概念：将目的基因导入受体细胞方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中含目的基因的DNA溶液花粉管通道法（我国科学家独创）将目的基因导入受体细胞—植物细胞方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。花粉管通道法将目的基因导入受体细胞—植物细胞农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的T-DNA可转移至被侵染的细胞，并整合到该细胞的染色体DNA上。（可转移的DNA）1.农杆菌的特点：农杆菌转化法任务：分析将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定1.在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA(可转移的DNA)上，原因是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA___________________________________________________________。

可转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上[思考]构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？探究—学习笔记P64将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等导入体细胞导入受精卵2.操作方法：农杆菌转化法随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。第一次拼接第二次拼接第一次导入第二次导入(2)两次导入：1.农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。核心归纳—学习笔记P65目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射早期胚胎培养获得具有新性状的动物①个体大，易操作。②受精卵全能性高，易培养成完整个体。显微注射法1.操作方法：2.过程：将目的基因导入受体细胞—动物细胞胚胎移植注射器固定吸管【补充】病毒侵染法科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。感受态细胞Ca2+处理细胞重组基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收重组DNA分子42℃,1min冰上3minCa2＋处理1.操作方法：2.过程：将目的基因导入受体细胞—微生物细胞

常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）2.受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。核心归纳—学习笔记P65生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法受体细胞转化过程农杆菌转化法显微注射技术Ca+处理法体细胞或受精卵受精卵原核细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca+处理细胞→微生物细胞膜的通透性增加形成感受态细胞→重组质粒与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子将目的基因导入不同细胞的方法将目的基因导入受体细胞2.基因表达载体中具备标记基因(如抗生素抗性基因)，已经对受体细胞进行了筛选，基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定，原因是：在含抗生素的选择培养基上能生长的可能是_________________________

，因此第四步需要对目的基因是否导入进行进一步的检测。此外，即便在选择培养基上能生长的细胞中导入的是基因表达载体，但是仍然不知道目的基因插入的

等是否正确，能否正确

，因此也需要在

水平上进行检测和鉴定。导入了基因表达载体或未插入目的基因的空载体位置、方向表达转录和翻译以及个体探究—学习笔记P65Bt基因mRNABt抗虫蛋白抗虫棉目的

：检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性目的基因的检测与鉴定类型检测内容分子水平的检测检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质个体生物学水平的鉴定个体是否具有相应性状如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因—通过PCR等技术检测转基因生物提取DNAPCR操作是否扩增出目的基因M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；

PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果电泳操作目的基因的检测与鉴定—分子水平的检测①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因将受体细胞的所有DNA分子提取出来进行电泳实验，与marker对比判断是否含目的基因。拓展

基因探针是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。检测将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因—DNA分子杂交技术目的基因的检测与鉴定—分子水平的检测原理：碱基互补配对1.复制水平的检测(DNA分子杂交技术)拓展延伸—学习笔记P65(1)原理：碱基互补配对原则。(2)基因探针：用放射性同位素或荧光物质标记的目的基因。(3)检测受体细胞是否含目的基因的具体过程：拓展延伸—学习笔记P65如：检测Bt基因是否翻译出mRNA提取棉花细胞mRNA逆转录产生DNA对扩增产物进行检测用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录目的基因的检测与鉴定—分子水平的检测②

检测目的基因是否转录出了mRNA—通过PCR等技术检测RNA分子杂交(NorthernBlot)流程图转基因生物标记的基因探针—分子杂交技术②

检测目的基因是否转录出了mRNA2.表达水平的检测进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理相似，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物细胞内的

mRNA；进行翻译水平的检测则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。拓展延伸—学习笔记P65③检测目的基因是否翻译出相应蛋白质如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物放射性检测

（杂交带）抗原与抗体的特异性结合原理：目的基因的检测与鉴定—分子水平的检测抗原—抗体杂交目的基因是否表现出相应的性状采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况目的基因的检测与鉴定—个体生物学水平鉴定—检测是否具有抗性以及抗性强度等方法：抗虫、抗病接种实验3.个体水平上检测转基因生物的方法举例转基因生物检测方法观察目标抗虫植物害虫吞食害虫是否死亡抗病植物病毒(菌)感染是否出现病斑抗盐植物盐水浇灌是否正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂是否正常生长获取目的基因产物的转基因生物提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较细胞产物功能活性是否正常核心归纳—学习笔记P653.如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上检测的方法是_____________

；如果目的基因是耐盐基因，在个体水平上检测的方法是____________________________

。进行抗虫接种实验用一定浓度的盐水浇灌探究—学习笔记P654.目的基因的检测与鉴定核心归纳—学习笔记P65获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取目的基因检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性将含有目的基因的表达载体导入受体细胞用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体基因工程的基本操作流程图基因工程的基本操作步骤(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞(

)提示为培育抗除草剂的作物新品种，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。(2)Ti质粒上的T－DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起(

)×√判断正误—学习笔记P64(3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞(

)提示常用受精卵作为培育转基因动物的受体细胞。(4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术(

)(5)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则(

)(6)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定(

)×√√√判断正误—学习笔记P641.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。下列相关说法不正确的是A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要

用到限制酶和DNA连接酶B.图中Ⅱ是含目的基因的重组

质粒，步骤②是将重组质粒

导入棉花细胞C.图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达√落实—学习笔记P662.(2023·六盘水高二调研)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。下列有关分析错误的是A.提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若检测到细胞中无Bt

抗虫蛋白，则说明抗虫基因不能表达B.若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若检

测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则说明抗虫基因能正常转录和翻译C.若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的

DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能

正常转录D.若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞√1.人工合成目的基因2.常用PCR特异性地快速扩增目的基因获取目的基因的方法目的基因的筛选与获取3.从基因文库中获取基因文库基因组文库cDNA文库2.从基因文库中获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）基因文库cDNA文库

将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。基因组文库适当的不同限制酶切割与质粒连接每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。该受体菌群为基因组文库基因组文库某种生物体内的全部DNA受体菌如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。某种生物体内的全部DNA某个时期基因选择性表达转录转录转录转录mRNA翻译翻译翻译翻译蛋白质cDNA文库--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非编码区非编码区编码区(编码mRNA)启动子终止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG转录mRNA某原核细胞基因反转录GT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTACCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……GT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……cDNA复制双链DNA受体菌无启动子、终止子等非编码区--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非编码区非编码区编码区(编码mRNA)启动子终止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG转录某真核细胞基因外显子内含子外显子内含子外显子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG初始mRNA成熟mRNA反转录GT……ATCCTAGGTCTACGT……ATCCTAGGTCTACCA……TAGGATCCAGATG复制受体菌无启动子、终止子等非编码区及无内含子文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）基因多少小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因cDNA文库与基因组文库的比较网络构建1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转济基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？科研人员对长江流域种植的抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。到社会中去—教材P832.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对，他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？(1)基因策略。最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CryIAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。到社会中去—教材P83外源基因插入基因组中，可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。在大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因（B-葡糖醛酸糖苷酶基因）的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。二、拓展应用练习与应用—教材P831.将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法：显微注射技术；将目的基因导入微生物细胞的方法：用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。2.对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。3.目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测受体