海洋污染物毒性分析用 模式鱼种 海水青鳉世代培育技术规范-地方标准格式审查稿

ICS07.080CCSA4537Toxicityanalysisofmarinepollutants—Modelfish—TechnicalspecificationforgenerationbreedingofOryziasmelastigmaIDB37/TXXXX—XXXX前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4世代培育气候室 通用要求 功能区分区 25循环水日常饲养与管理 2饲养装置 2环境条件 3饲养管理 36亲鱼静水繁育与管理 4繁育装置 4繁育条件 4繁育管理 47受精卵孵化与管理 5孵化装置 5孵化条件 5孵化管理 68质量控制 6质量要求 6环境检测 6信息记录 6附录A（规范性）海水青鳉世代培育信息记录表 8DB37/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省海洋局提出并组织实施。本文件由山东省海洋标准化技术委员会归口。1DB37/TXXXX—XXXX海洋污染物毒性分析用模式鱼种海水青鳉世代培育技术规范本文件规定了用于海洋污染物毒性分析的模式鱼种海水青鳉世代培育中人工气候室（以下简称“气候室”）、循环水日常饲养与管理、亲鱼静水繁育与管理、受精卵孵化与管理、质量控制等要求。本文件适用于海洋水体中重金属、有机污染物、微塑料等污染物毒性分析用模式鱼种海水青鳉的世代培育，其他模式鱼种世代培育参照使用。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3097海水水质标准GB14925实验动物环境及设施GB19489实验室生物安全通用要求GB/T39649实验动物实验鱼质量控制NY5073无公害食品水产品中有毒有害物质限量3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1海水青鳉仔稚鱼Oryziasmelastigmalarvae孵化出膜至发育为幼鱼之前的海水青鳉。3.2海水青鳉幼鱼Oryziasmelastigmajuvenile鳞片发育完全，形态与成鱼相似但未达到性成熟的海水青鳉。3.3海水青鳉亲鱼Oryziasmelastigmabroodstock性成熟、用于繁殖后代的海水青鳉。注：一般指大于3月龄的海水青鳉。4世代培育气候室4.1通用要求2DB37/TXXXX—XXXX世代培育气候室应具备独立运行空间，能够对各个环境因子，如温度、湿度和光照等进行自动控制和调节，保证恒温、恒湿。气候室电力供应、监测警报、实时记录等运行管理应符合GB19489规定。4.2功能区分区气候室分为以下功能区，各功能区进行物理隔离，并应符合以下要求。a)培育水制备区：用于过滤自然海水或配制人工海水，配备抽滤泵等过滤装置、盐度计等人工海水配备仪器、调温装置、曝气装置等，其环境条件设置按5.2执行。b)循环水饲养区：用于海水青鳉成鱼和不同世代仔稚鱼、幼鱼的饲养，配备物理过滤、生物过滤等循环水处理装置，其环境条件设置按5.2执行。c)静水繁育区：用于海水青鳉亲鱼的繁育，配备繁育缸、吸卵器等装置，其环境条件设置按6.2执行。d)受精卵孵化区：用于海水青鳉受精卵孵化，配备充气泵、孵化桶等装置，其环境条件设置按7.2执行。e)活体饵料孵化区：用于饵料卤虫的孵化，配备充气泵、孵化桶、收集网等装置，其环境条件设置按7.2执行。f)储物区：用于人工饵料、鱼捞、吸卵器等物品存放，其环境条件设置按5.2执行。g)实验区：独立于主体培育区，用于实验观察和处理，根据功能分为以下分区。1)观察分区：主要用于亲鱼筛选、鱼卵与粪便分离、受精卵显微观察等，配备显微镜、体视解剖镜、解剖针、胚胎培养皿、相机等器具，该区域的鱼体或胚胎可再次返回繁育区、孵化区等功能区。短时间观察环境条件设置按5.2执行，长时间观察环境条件设置应符合观察对象管理要求。2)处理分区：主要用于亲鱼、仔稚鱼、鱼卵的急性或慢性毒理试验，配备显微镜、体视解剖镜等观察分析仪器和容量瓶、移液枪、振荡器等器具，该区域经处理的鱼体或胚胎应留置实验区，不应返回繁育区、孵化区等功能区，以防交叉污染。其运行管理应根据毒理试验对象适时调整。5循环水日常饲养与管理5.1饲养装置5.1.1饲养架应选用不锈钢等耐腐蚀、耐高温材料，每层饲养架高度不应低于60cm，配备3只～5只LED灯管和1只紫外灯管，其中LED灯管功率范围为5W～20W，紫外灯管功率范围为5W～11W，于饲养架顶层安装LED灯管，进水口处安装紫外灯管。5.1.2饲养缸应选用玻璃等无毒、无害、耐腐蚀、耐高温、易清洗材质，透明度高，易观察，饲养缸体积宜大于15L，尺寸可根据饲养架实际高度和宽度调整，使用前采用3％～5％的高锰酸钾溶液消毒，满水浸泡7d5.1.3循环净化装置循环净化装置应包括以下设备。a)进水管，配过滤网。3DB37/TXXXX—XXXXb)过滤系统，包括：1)一级过滤层，为白棉过滤层；2)二级过滤层，为石英培菌球过滤层；3)三级过滤层，为生化棉过滤层。c)排水管，应设置散水孔。d)循环泵。5.2环境条件5.2.1温度室温为24℃~30℃,24h温差不应超过3℃。水温为25℃~28℃,24h温差不应超过2℃。5.2.2湿度空气湿度为40％～60％。5.2.3光强采取光暗比为14h:10h方式培育，早6点至晚8点为照明期，光强为60μmol•m-2s-1～120μmol•m-2s-1。5.2.4水质海水青鳉循环水饲养应采用自然海水或人工海水。自然海水应取自无污染海域，使用前经沉淀砂滤，盐度为31±3，海水水质应符合GB3097一类水质要求；人工海水应按照配方配制，所用试剂及浓度应符合表1要求，应现用现配，使用前曝气并静置，pH值为8.0～8.5，盐度为31±3。表1培养液所用试剂及浓度硫酸钠（NaSO）5.3饲养管理5.3.1饲养密度循环水系统饲养海水青鳉仔稚鱼，鱼体活动水体密度应低于10尾/L，最优培养密度不宜超过5尾/L；海水青鳉幼鱼活动水体密度应低于5尾/L，最优培养密度不宜超过3尾/L；成鱼活动水体密度应低于3尾/L，最优培养密度不宜超过1尾/L。5.3.2饵料投喂5.3.2.1投喂量4DB37/TXXXX—XXXX仔稚鱼投喂初孵卤虫无节幼体密度为1×103个/L～2×103个/L，幼鱼投喂初孵卤虫无节幼体密度为1×104个/L～2×104个/L，成鱼投喂初孵卤虫无节幼体密度为2×105个/L～4×105个/L。仔稚鱼投喂应配合小球藻藻液，保持活动水体中藻密度为1×103cells/mL～5×103cells/mL。5.3.2.2投喂频次每日定时投喂2次初孵卤虫无节幼体，期间搭配1次人工饵料。仔稚鱼人工饵料粒径0.20mm～0.35mm，幼鱼和成鱼人工饵料粒径0.35mm～0.80mm。5.3.3换水根据具体实验应进行不定期补换水，应保持每两周补换水量不低于总水量的30期间可添加淡水保持水体盐度稳定。6亲鱼静水繁育与管理6.1繁育装置6.1.1繁育架同5.1.1。6.1.2繁育缸繁育缸材质和消毒步骤同5.1.2。繁育缸体积宜为10L，缸体长宽比不低于2:1，底部应配有受精卵收集装置。6.2繁育条件6.2.1温度室温为24℃~32℃,24h温差不应超过3℃。水温为26℃~30℃,24h温差不应超过2℃。6.2.2湿度同5.2.2。6.2.3光强同5.2.3。6.2.4水质同5.2.4。6.3繁育管理6.3.1亲鱼筛选亲鱼筛选条件包括。a)月龄：6月龄～8月龄。b)状态：色泽正常、体形完整、摄食良好、活动有力、体质健壮。c)雄性亲鱼：臀鳍鳍条长、呈完整锯齿状的雄鱼。5DB37/TXXXX—XXXXd)雌性亲鱼：臀鳍呈完整长条状、腹部圆润的雌鱼。6.3.2亲鱼密度亲鱼活动水体密度不应超过1尾/L，雌雄比例为1:1，繁育缸不宜超过6对亲鱼，亲鱼密度与雌雄配比宜为10L水体中含2雌和2雄亲鱼。6.3.3饵料投喂6.3.3.1投喂量亲鱼投喂初孵卤虫无节幼体密度为2×105个/L～4×105个/L。6.3.3.2投喂频次每日定时投喂2次初孵卤虫无节幼体，期间搭配2次人工饵料。饵料粒径为0.35mm～0.80mm。6.3.4换水应保持每两日换水量为总水量的20％～30％。7受精卵孵化与管理7.1孵化装置7.1.1孵化桶材质应选用透明PVC或玻璃，形状宜为圆筒状，底部为圆锥形，无死角，保证受精卵或卤虫卵均能充气上下浮动。7.1.2孵化配件配有氧气泵、止逆阀、气量调节阀、充气软管等孵化配件，其中氧气泵功率宜为1.5W。7.2孵化条件7.2.1温度同6.2.1。7.2.2湿度同5.2.2。7.2.3光强采取光暗比为14h:10h方式培育，早6点至晚8点为照明期，光强为80μmol•m-2s-1～120μmol•m-2s-1。7.2.4溶解氧水体溶解氧应大于8.0mg/L。7.2.5水质同5.2.4。6DB37/TXXXX—XXXX7.3孵化管理7.3.1孵化前处理受精卵采集后应采用洁净海水反复冲洗，去除水体中的亲鱼粪便等杂质。投放入孵化桶前应在体视解剖镜下观察胚胎受精情况，采用解剖针剥除坏死的受精卵。7.3.2孵化密度保持受精卵孵化水体密度不超过500枚/L，最优孵化密度为200枚/L～300枚/L。保持活体饵料卤虫卵孵化密度为10g/L。7.3.3换水受精卵孵化应保持每两日换水量为总水量的20％～30％。保持每日收集活体饵料卤虫无节幼体后，全部换水。7.3.4孵化后管理仔稚鱼孵化出膜后，应在72h内采用塑料滴管或小烧杯将其移至循环水饲养缸，饲养密度同5.3.1，饵料投喂同5.3.2。8质量控制8.1质量要求用于海水青鳉世代培育鱼种的来源应当清晰，保证为世代培育遗传背景明确的海水青鳉。鱼卵、仔稚鱼、幼鱼与亲鱼质量应符合GB/T39649和NY5073要求，具体包括以下要求。a)鱼卵质量要求：外形完整，无损伤，胚胎发育特征符合正常发育时期形态学观察。用于开展海洋污染物毒性分析用的鱼卵，应为同一发育时期的受精卵，发育时长相差不宜超过6h。b)仔稚鱼质量要求：尾部破壳孵出，鱼体旋转式快速游动至水面，间歇性运动。1日龄鱼体可上下颌不停闭合，鳔充气。4日龄鱼体游动迅速，能够停留在不同水层觅食。用于开展海洋污染物毒性分析用的仔稚鱼，应为同一月龄，发育时长相差不宜超过5d。c)幼鱼质量要求：脊柱、颌骨等器官发育正常，各鳍条发育完善，雌雄分化特征明显，呼吸、游泳、捕食等行为正常。用于开展海洋污染物毒性分析用的幼鱼，应为同一月龄，发育时长相差不宜超过10d。d)亲鱼质量要求：应符合6.3.1。用于开展海洋污染物毒性分析用的雌性与雄性亲鱼月龄应相近，发育时长相差不宜超过20d。雌雄亲鱼应具较高适配性，若出现明显争斗行为，应立即调换配对。8.2环境检测世代培育过程应对气候室环境与水环境进行定期检测。气候室环境按照GB14925的规定进行检测，水质按照GB3097中的方法进行检测。检测频率为每6个月1次，遇到停电、加热元件损坏等特殊情况，应加测1次，环境不应发生剧烈变化。8.3信息记录世代培育过程应按照附录A的样式，对环境参数、饵料投喂、亲鱼信息、繁育情况、孵化信息等数据进行记录，应符合下列要求：7DB37/TXXXX—XXXXa)海水青鳉循环水日常饲养与管理信息记录表按表A.1执行。当环境参数异常时，应立即按照5.2的规定作相应调整；b)海水青鳉亲鱼繁育与管理信息记录表按表A.2执行。亲鱼死亡率超过10或每尾雌鱼日产卵量低于10枚，或鱼卵受精率低于70则判定为繁育异常，应立即调整投喂量、检查温度和光照等环境条件，按照6.2和6.3的规定作相应调整；c)海水青鳉受精卵孵化与管理信息记录表按表A.3执行。受精卵受精后16d孵化率低于50%,则判定为孵化异常，表明在温度控制、病原微生物控制等方面存在问题，应立即检查温度或更换水体，按照