分子生物学实验讲义

实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从Ikb至200kb以上不等。各种质粒都

是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定

地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体

的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒

DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒

DNAo

碱裂解法是•种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和

SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复

性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀

下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯

化他-澳化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二静分级沉淀等方法，但

这些方法相对昂贵或费时，对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和

乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、

DNA片段的分离和酹切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

二、实验试剂

1.溶液I:50mM葡萄糖，25mMTris-HCI(pH8.0),10mMEDTA(pH8.0)。IM

Tris-HCl(pH8.0)12.5ml,0.5MEDTA(pH8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml。

在10lbf/in2高压灭菌15min,贮存于4℃。

2.溶液II:0.2NNaOH,1%SDS。2NNaOH1ml,10%SDS1ml,加ddH20至lOmlo使用

前临时配置。

3、溶液HI：醋酸钾(KAc)缓冲液,pH4.8。5MKAc300ml,冰醋酸57.5ml,加ddH20

至500ml。4℃保存备用。

4.TE：lOmMTris-HCl(pH8.0),ImMEDTA(pH8.0),»IMTris-HCI(pH8.0)1ml,0.5M

EDTA(pH8.0)0.2ml,加ddH2O至100mLElbf/in2高压湿热灭菌20min,4。保存备用。

5、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)

6.乙醇(无水乙静、70%乙醇)

7、5XTBE：Tris碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2-2H2O4.65g,加ddH20至1000mlo

15lbf/in2高压湿热灭菌20min,4c保存备用。

8、澳化乙锭(EB):lOmg/ml

9、RNaseA(RNA醒A)：不含DNA酶(DNase-free)RNaseA的lOmg/ml,TE配制，沸

水加热15min,分装后贮存于-20℃。

10、6Xloadingbuffer(上样缓冲液):0.25%澳酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗

糖水溶液。

11、1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml0.5XTBE,微波炉加热至

完全溶化，冷却至60c左右，加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5ug/ml(注意：EB为强诱

变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却

30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5XTBE),即可上样。

三、实验操作

1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0mlLB（含相应抗生素）液体培养基

中,37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）o

2.取1.0ml培养物入微量离心管中，室温离心8000gX1min,弃上清，将离心管倒置，使

液体尽可能流尽。

3.将细菌沉淀重悬于100U1预冷的溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4.加200g新鲜配制的溶液II,颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰

上2-3min,使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5.加入150M预冷政溶液HI,将管温和颠倒数次混匀，见白色冢状沉淀，可在冰上放置

3-5min°溶液川为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成,不可溶

复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀,4C离心8000gXlOmin,小心移出上清于一新微

量离心管中。

6.加入450UI的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,4℃离心8000gXIOmin0

7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.0倍体积（1ml）预冷的无水乙醉，混匀,

室温放置5min,4℃离心12000gXlOmin,弃上清。

8、加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1次,4℃离心8000gX7min,弃上清，将沉淀在室

温下晾干或吹干（不能过于干燥，造成溶解困难）。

9、沉淀溶于20U1TE（含RNascA20ug/ml）,-20℃保存备用。

四、质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料湿化乙锭进行染色。该物质含有一

个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切

接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收

254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。

这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶

中含有游离澳化乙锭时即可以检测到少量的DNAo

取制备的质粒DNA1-2U1,力U适当loadingbuffer诧匀上样，采用l-5V/cm的电压，使

DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

五、注意事项

本裂解法小最制备质粒DNA重夏性好，一般无麻烦。若所提取质粒DNA不能被限制

性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

六、习题：

1.什么是质粒？质粒有什么主要用途？

2、分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而又的，它必须具备哪三个基本要素？

3、制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？

实验琼脂糖凝胶电泳实验

一、实验目的

（1）学习琼脂糖凝狡电泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其

等电点为PH2-2.5,在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5）,核酸分子带负电荷，在电场中向正

极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时；具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效

应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：

（I）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA

分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越

慢。

（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子

量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中

移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定

质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其

他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切能分别水解,

然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着

电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场

强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有

离子存在时（如误用蒸储.水配制凝胶），电导率最小,DNA几乎不移动；在高离子强度的缓

冲液中（如误加10X电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA

变性。

演化乙呢（Ethidiumbromide,EB）（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm

紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样

品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于澳化乙咤有致癌的嫌疑，所以现在也开发

出了安全的染料，如Sybergrecn。

常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处

理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern杂交，因为变性后的RNA是单链，其

泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后

条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效

杂交。

三、试剂与器材

（一）材料

电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等

（二）试剂

1.50*TAE（1000mL）:242gTris,57.1mL冰醋酸，18.6gEDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溟化乙咤，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装,

室温避光保存。

3、DNA加样缓冲液：（）.25%澳酚蓝,0.25%二甲苯青,50%甘油（w/v）。

4.DNA分子量标准

四、操作方法

常规的水平式琼脂糖电泳：

制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含豉；一般

情况下，可参考下表：

琼脂糖的含量（％）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）

0.360-5

0.620-1

0.710-0.8

0.97-0.5

1.26-0.4

1.54-0.2

2.03-0.1

1.制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入lx电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将

琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动，使附于瓶型上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时

应盖上封口膜，以减少水份蒸发。

2.胶板的制备：将胶槽置于制胶板上，插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面

保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50C左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB（也

可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5Pg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟），摇匀，轻轻

倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加

入lx电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

3.加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应

不小于IX。用10UL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应

更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面注意：加样前要先记下加

样的顺序和点样量）。

4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电

压不超过5V/cm0当琼脂糖浓度低于0.5%,电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正

极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当澳酚蓝移动到距离胶

板中央时，停止电泳。

5、观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的

或已加有EB的电泳胶板，DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系

统中拍照并保存之。

五、注意事项

1.EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到

桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理

方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下）,然后加入0.2倍体积新鲜配制的

5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体枳新鲜配制的0.5mol/L的亚硝酸钠，混匀,

放置1天后，加入过量的Imol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200

左右。

2、由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使DNA迁移

率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5ug/ml的

EB溶液浸泡染色的方法。

六、实验报告要求与思考题

1.附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）

k-2000-

「1005

175g

厂500~

卜25“

M:1KbDNAladder；I:质粒DNA

2.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

3.如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？

4.为什么分子生物学实施时要担心EB?

5、琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？

电泳流程图:

实验PCR扩增eGFP基因

一、PCR技术的基本原理

PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的每核甘酸引

物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经

PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右,

引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板―引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原

料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半

保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种

新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基

因扩增放大几百万倍。（Plateau）o到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝,

PCR技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法

可适应于大多数DNA扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基

础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。

1.模板：单、双链DNA和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA,须先通过

逆转录得取第一条cDNA.虽然PCR可以仅用极微量的洋品，但为了保证反应的特异性，一

般宜用ng量级的克隆DNA,ug级的染色体DNA,待扩增样品质量要求较低，但不能混合

有任何蛋白的、核酸晦,TaqDNA聚合酣的抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。

2、引物：引物是决定PCR结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能

选择碱基随机分布，GC含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚噂吟、多聚喀咤

或其它异常序列的引物。12）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3，一末端）的序列。

3、防止引物间的互补，特别要注意避免具有3,末端重叠的序列。

4.引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。

5、引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体解链；然后冷却至37-55℃,使引物与模板

退

二、实验试剂

（-）仪器与器皿

PRC扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性eppcndorf管，凝胶成像仪

（二）试剂与材料

1.琼脂糖凝胶电泳试剂

1）电泳缓冲液:Tris一乙酸0.04mol/LPH8.00.002mol/LEDTA

2）加样缓冲液:0.25%溟酚兰40%w/v蔗糖

3）澳化乙锭溶液:0.05mg/ml液化乙锭/水

4）琼脂糖

2.TaqDNA多聚酶

3、5'反应缓冲液：

125mmol/LTris-HClpH8.2；10mmol/LMgC12；0.5mg/mlgelatin：125mmol/L（NH4）2SO4；

Formamide25%

4.混合dNTP液（dATPdGTPdTTPdCTP各2.5mmol/L）

5.DNA模板

6.引物1（lOumol/L）

7、引物2（l（）umoL，L）

8、无菌水

三、实验步骤

1.按顺序在200U1指形管中加入以下试剂与样品：（因购入的试剂批次不同，加样时有

所差别，以预实验结果为准。

1）ddH2O37U1

2）10*Buffcr5U1（含有MgCL2）

3）dNTP2Ml

4）引物1（上游）2u1

5）引物2（下游；2ul

6）模板1口1（pEGFP质粒）

7）TaqDNA聚合前lul（2.5U）

总体积共50P1

2.在PCR扩增仪上按以下反应条件编入程序：（以下为参考值，因扩增的DNA片段不

同，各类PCR扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA片段的要求及仪器而定

参数。）

1）预变性94c3分种

2）循环条件（30次）

变性94℃3（）秒

复性55℃30秒

延伸72℃1分

3）延长延伸72℃7分钟

编完反应程序，置反应管于PCR犷增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。

3.PCR扩增完毕，配1.5%琼脂糖凝胶，电泳观察结果。

4、凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA片段

四、习题

1.PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？

2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

实验从动物组织（猪肝）中提取DNA

一、实验内容

采用SDS裂解和蛋占酶K消化法从猪肝中提取DNA,并进行琼脂糖凝胶电泳分析。

目的

（1）掌握SDS裂解法从猪肝中的原理和方法；

（2）巩固DNA的琼脂糖凝胶电泳分析实验.

二、实验原理

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破

碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醉）重复抽提，使蛋白

质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA,从而得到纯净的DNA分子。

三、实验材料

新鲜猪肝

TES缓冲液:pH8.0Tris-HCllOmmoL/L,EDTAImmoL/L,SDS0.1mmoL/L

四、实验步骤

1.剪取约0.5g肝脏组织，放入到研钵中磨碎；

2.向研钵中再加入1MTES轻轻研磨，将TES与破碎的组织混匀；

3.吸取5351al组织匀浆液于2mlEP管中，再加入60jlSDS（10%）,5.09蛋白酶K,充

分混匀后，于56°C保温1h,每30分钟轻摇1次：

4.放置到室温，加入等体积饱和酚（600|11）,颠倒混匀，11000rpm,离心1（）min,吸取

400pl水相，并转移至一个新的1.5ml离心管中；

5.加入2倍体积（10（H）可）的无水乙醇和1/10倍体积（40口1）3M醋酸钠沉淀DNA,1200（）

rpm离心lOmin,弃乙醉；

6、加入适量TE溶解DNA和RNAseA（具体依DNA的多少而定），并利用0.7%的琼

脂澹进行电泳分析。

五、注意事项

1.在将猪肝剪碎前要将猪肝清洗干净，除去脂肪及系膜成分。

2.抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

3.取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

4.乙醉漂洗去乙厚时，不要荡起DNA。

5、离心后，不要晃动离心管，拿管要稳。

6、在乙醇沉淀后，经啕心要观察留在EP管中的小白点，其主要成分就是DNA,在以后

的实验中都要细心观察，防止因将小白点丢失。

六、习题

1.为了获得高质量的肝脏DNA,在实验过程中应注意什么。

2.结合本人操作体会，总结在提取过程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白质的方法有哪些？

实验限制性内切酶切割DNA

一、实验目的

1.通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子；

2.根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶：

3.掌握DNA的酶切技术。

二、实验原理

限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前

已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核甘酸顺序，这一顺序大多为具有一对

称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的EcoRI识别…GAATTC…切割后产生…

CTTAAG-、-G和AATTC…的末端，

…CTTAAG…该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的

末端为3'-OH和5'-磷酸基团，即…G-OH和…CTTAA-P。

有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如San3A识别…GATC…；有的识别六

碱基对，如上述的ECORIo识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更

高（四碱基酶为44=256,六碱基酶为46=4096）,因而可将DNA切割成更小的片段，而识

别八碱基对的NotI…GCGGCCGC…、•••CGCCGGCG…则识别和切割位点更少（48=

65536）,但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。

限制性内切酶作用的温度一般为37℃,反应体系中以Mg2+为唯一的辅助因子,

且要求pH缓冲在7.5左右。

商品酶都保存在50%的甘油溶液中,-20C贮存，活性通常较高,5u/U1（每单位即最适条

件下1小时内完全酶解1ugDNA的酶量）。

三、实验材料

待酹切的DNA样品

四、实验仪器、器皿及试剂

1.仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、星泳槽、紫外检测灯

2.器皿:Eppendorf管、Tip、试管架

3、试剂：标准DNA（Marker）

EcoRI限制性内切酶

10Xbuffer:50mmol/INaCl

lOmmol/lTris-HCl(pH7.5)

MgCh

Immol/IDTT(一硫苏糖醉)

五、实验步骤

1.将DNA样品8.5u1（质粒pEGFP,1Pg）

2、加入1ulIOXbuffer,施解buffer由厂家提供。

3、加入lu（0.5Ml）的限制性内切酶EcoRI（限制性酶很昂贵,从・20℃取出要

置于冰上，吸取要新的Tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放回冰箱）。

4.混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37℃温育1小时。

5、进行电泳检杳酶切结果，100V25分钟。

6.紫外灯下观察消化效果。

六、注意事项

1.分子生物学实验大多为微量操作，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格

注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。现介绍三种微量取样方法：

(1)吸样时，将Tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。此法可吸取0.2〜0.5UI的样品，注

意不要将Tip尖全部插入溶液，这样Tip壁上会沾上很多的样品，导致吸样不准。

(2)用1cm长的塑料毛细管代替Tip吸样，此法也可吸取0.2~0.5u1的样豉。

(3)目前也有细长Tip出售，专门用于吸取微量样品。

2.限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。这就要求每次吸酶时

要用新的无菌Tip。另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制性内切酶的失活。因此，要

注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要尽可能快，以

使限制性内切酶拿出冰箱的时间尽可能短。

若用同一酶消化很多样品时，可先计算出所需酶量(可稍多计一点)，取出此量的酶与

IX缓冲液混合，然后再分装至各个反应管内。这样可节约用酶且缩短操作过程、减少污染

机会。

3.开启Eppcndorf管时，手不要接触到管盖内面，以防杂酣污染。

4、样品在37℃与65℃保温时，要注意将Eppcndorf管盖严，以防水进入管内造成实验

失败。

5、无实验必要应尽量避免长时间的消化样品。因长时间消化，限制的溶液中可能存在的杂

酶会影响试验结果。

七、习题