【高考生物】2026步步高大一轮复习讲义第九单元　生物技术与工程阶段排查　回扣落实（九）含答案

【高考生物】2026步步高大一轮复习讲义第九单元生物技术与工程阶段排查回扣落实（九）阶段排查回扣落实（九）一、网络构建前挂后联二、易错易混再判断(1)腐乳的制作仅是毛霉参与了豆腐的发酵。(×)提示多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母菌、曲霉和毛霉。(2)泡菜制作过程中，有机物的干重和种类将减少。(×)提示泡菜制作过程中，有机物的干重将减少，而有机物的种类将增加。(3)醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生乙酸。(×)提示醋酸菌在有氧、缺少糖源条件下利用乙醇产生乙酸。(4)酵母菌是一类单细胞真菌，果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度。(×)提示果酒发酵所需的最适温度低于果醋发酵温度。(5)制作果酒、果醋时，对发酵瓶、榨汁机等需用体积分数为70%的酒精消毒。(√)(6)葡萄酒呈深红色的原因是发酵过程中葡萄皮的色素进入到发酵液中。(√)(7)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(×)提示选择培养基可以筛选分离出某种微生物。(8)脲酶催化尿素分解产生NH3。(√)(9)对细菌进行计数时，可以用平板划线法。(×)提示对细菌计数可以采用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法。(10)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(√)(11)刚果红与纤维素形成红色复合物，可以通过是否产生透明圈来分离纤维素分解菌。(√)(12)在进行植物体细胞杂交前，必须用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得原生质体。(√)(13)用高Ca2＋—高pH融合法可人工诱导原生质体的融合。(√)(14)制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。(×)提示制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。(15)体细胞核移植时，去核卵母细胞的“核”是指纺锤体。(×)提示去核卵母细胞的“核”是指纺锤体—染色体复合物。(16)应用体细胞核移植技术生出的犊牛与供体奶牛遗传物质完全相同。(×)提示应用体细胞核移植技术生出的犊牛与供体奶牛遗传物质基本相同。(17)目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是采用化学物质处理。(×)提示目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。(18)雄性动物刚刚排出的精子并不具有受精能力，必须获能后才具备受精能力。(√)(19)精子获能就是获得“能量”。(×)提示精子获能是指精子获得受精“能力”，而不是获得“能量”。(20)胚胎移植技术中对供体和受体母畜都要进行相同激素处理。(×)提示对供体和受体母畜进行同期发情处理时，所用激素相同，但供体母畜进行超数排卵时还要用促性腺激素。(21)胚胎分割移植时应选取发育良好、形态正常的囊胚或原肠胚。(×)提示胚胎分割移植时应选取发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，一般不用原肠胚。(22)对囊胚进行分割时，要将滋养层细胞均等分割。(×)提示对囊胚进行分割时，要将内细胞团均等分割。(23)限制酶也可以识别和切割RNA。(×)提示酶具有专一性，限制酶只能识别和切割DNA。(24)DNA连接酶可以连接磷酸二酯键，也可以连接氢键。(×)提示DNA连接酶只能连接磷酸二酯键。(25)将重组表达载体导入动物受精卵常用Ca2＋处理法。(×)提示将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。(26)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。(√)三、长句应答多强化1.核心概念(1)(选择性必修3P10)消毒和灭菌：消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌则是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。(2)(选择性必修3P34)细胞全能性：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。(3)(选择性必修3P81)转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.结论语句(1)(选择性必修3P6)酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，可用于酿酒，制作馒头和面包等。(2)(选择性必修3P7)醋酸菌是好氧细菌，当O2、糖源都充足时通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸；当缺少糖源时则直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸。(3)(选择性必修3P18)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。(4)(选择性必修3P18)同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。(5)(选择性必修3P37)在进行植物体细胞杂交之前，必须先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得原生质体。(6)(选择性必修3P49)杂交瘤细胞既能大量增殖，又能产生特定抗体。(7)(选择性必修3P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。(8)(选择性必修3P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须含有启动子、终止子等。3.规范表述(1)倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是___________________________________________________________________________________。提示既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染(2)制作果酒时，若酵母菌的数量充足且温度适宜，但获得的发酵液中酒精浓度较低，则出现该结果的原因可能是__________________________________。提示培养过程中发酵瓶密封性不好，混入了氧气(3)体外进行动物细胞培养时，培养液要定期更换，其目的是______________________________________________________________________________________。提示以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害(4)胚胎移植的实质是______________________________________________________________________________________________________________。提示早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移(5)进行胚胎移植的优势是______________________________________________________________________________________________________________。提示可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力(6)限制酶的作用是_____________________________________________________________________________________________________________________。提示能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开热点微练11PCR技术与电泳相关问题(时间：40分钟)【精准强化】1.(2024·山东泰安模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述正确的是()A.第一轮PCR过程中复性所用的温度与第二轮PCR复性的温度是一样的B.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，该定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链D.将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU)，属于蛋白质工程答案D解析为了使两轮PCR在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第二轮PCR的复性温度应该比第一轮高，A错误；若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则载体上需要具备启动子和终止子等结构才能进行转录和翻译，B错误；除第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU)，属于蛋白质工程，D正确。2.(2024·山东潍坊模拟)恶性高热是一种潜在致命性单基因遗传病，患者一般无症状，但当接触麻醉剂后，会诱发患者出现高热等症状，死亡率极高。某家庭的母亲和女儿皆患有恶性高热，母亲因该病去世，女儿经及时抢救而康复。科研人员对该家庭成员进行了基因检测。控制该性状的某一基因可在限制酶的作用下切割成两条不同长度的DNA片段，用凝胶电泳法分离后可显示出不同的带谱如图所示(控制该性状的基因为完全显性，且不位于X、Y染色体的同源区段)。下列说法错误的是()A.该遗传病属于常染色体显性遗传病B.结合3、4可推断2号不患病的概率是100%C.该致病基因是由正常基因碱基的替换形成的D.4号与无麻醉剂接触史的女子结婚，后代能出现的基因型最多有3种答案B解析据题意可知，该家庭女儿患恶性高热，儿子相关致病基因检测结果与女儿相同，因此儿子也患恶性高热；父亲只有500bp和800bp的片段，女儿和儿子既含1300bp片段，也含500bp和800bp的片段，说明女儿和儿子都是既含致病基因，又含正常基因，若是该致病基因在X染色体上，且不位于X、Y染色体的同源区段，儿子就不会同时含有致病基因和正常基因，因此判断该病为常染色体显性遗传病，A正确；根据题意，“控制该性状的某一基因可在限制酶的作用下切割成两条不同长度的DNA片段”，若是致病基因被切割成两条不同长度的DNA片段，父亲有可能是患者，B错误；据题图可知，某限制酶作用于相应基因后，正常基因和致病基因的总长度不变(都是1300bp)，因此推测该致病基因由正常基因碱基的替换形成，C正确；由分析可知，该病为常染色体显性遗传病，4号是杂合子，用A/a表示相关基因，4号与无麻醉剂接触史的女子(基因型为AA、Aa或aa)结婚，当该女子的基因型为Aa时，后代出现的基因型最多，有AA、Aa、aa，3种，D正确。3.(2023·浙江6月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是()A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子答案B解析由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′→3′，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3－GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。4.(2024·河北唐山质检)如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是()A.用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序B.用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序C.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序D.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序答案C解析直接选用引物①、④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物②和引物③可实现对已知的T－DNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T－DNA两侧的未知序列，C正确。5.(2024·河南名校联盟)重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是()注：引起凸起处代表与模板链不能互补的突变位点。A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因D.过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物答案B解析过程②为PCR反应，需要在添加了Mg2＋的缓冲液中才能进行，需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等，A正确；两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故总共形成3种DNA分子，B错误；过程④获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；过程⑤是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D正确。6.(2024·湘豫名校联考)人体内的t－PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但大剂量使用会诱发颅内出血。如果将t－PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。先对天然的t－PA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良t－PA蛋白。如图是通过重叠延伸PCR获取t－PA改良基因和利用质粒pCLYⅡ构建含t－PA改良基因的重组质粒示意图(图中重叠延伸PCR过程中，引物a、b用来扩增含有突变位点及其上游序列的DNA片段，引物c、d用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA片段)。请回答：(1)已知t－PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链(图中t－PA基因的上链)上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR，示意图中的点表示突变部位的碱基，引物b中该部位的碱基是，引物c该部位的碱基是。PCR中需要引物的原因是__________________________________________________________________________________________________。(2)重叠延伸PCR中，PCR1和PCR2分别进行，产物混合后再进行PCR3。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是____________________________________________________________________________________________________________。答案(1)GCDNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连接到双链DNA片段的引物链上(或DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链)(2)引物b和引物c遵循碱基互补配对，会使引物失效解析(1)已知t－PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链上的碱基序列是ACA，半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t－PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t－PA基因上链第84位发生的碱基替换为C→G，题图中显示引物b与t－PA改良基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G，引物c与t－PA改良基因的上链互补，故其中相应部位的碱基与下链相同，即该部位的碱基是C。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸。(2)题图信息显示，引物b和引物c遵循碱基互补配对，因此，如果PCR1和PCR2同时进行，会使引物失效，无法达到预期目的。7.(2023·广东卷，20)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备___________________________________________________。(3)转化后，T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了______________________________。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约%的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的T2代阳性植株(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。答案(1)野生型(2)Ti质粒启动子和终止子(3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因②75③自交100解析(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和作为载体的Ti质粒进行切割，再用DNA连接酶将两者连接。在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没于农杆菌(T－DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)菌液进行转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入。根据题意，选出单一位点插入的植株，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：8.(2023·山东卷，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________________________________(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了，条带2所检出的蛋白(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。答案(1)RNA聚合酶复制原点、标记基因、限制酶切割位点(2)F1和R2或者F2和R1a链(3)J－V5融合蛋白不是解析(1)与图甲中启动子结合的酶是RNA聚合酶。图甲中有启动子和终止子等，作为载体，质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位均包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′，图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，只有抗V5抗体时，出现条带1，抗V5抗体能与V5编码序列表达标签短肽V5特异性结合，只有抗J蛋白抗体时，出现条带1和条带2，且条带1较宽，说明该物质能与抗J蛋白抗体特异性结合，因此出现条带1证明细胞内表达了J－V5融合蛋白，而条带2可能是杂质。9.(2024·北京顺义区检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。下图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入；图甲所示的基因定点突变技术需要次PCR；获得产物A需要的引物是。(2)研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯化后，利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为，基因M1的长度为。项目基因MAB长度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.05(3)通过图甲过程获得的基因M1仍需要大量扩增，此时选择的引物是，为了与图乙中的Ti质粒相连，还需要分别在它们的端引入限制酶的识别序列。(4)构建基因表达载体时，M1基因必需插入Ti质粒的中，原因是___________________________________________________________________。答案(1)TaqDNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等3引物1和引物3(2)0.23kb6.09kb(3)引物1和引物25′HindⅢ、PstⅠ(顺序应与前面的引物对应)(4)T－DNATi质粒上的T－DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体上解析(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入TaqDNA聚合酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等。从图甲可以看到，从加入引物到获得基因M1总共经历了3次PCR。产物A的两端互补的引物是引物1和3。(2)基因M上有3个酶切位点(箭头处)，完全酶切产生4个片段，分别为3.24kb、2.8kb、0.15kb、0.13kb，共6.32kb，A片段酶切后产生2个片段，分别为2.8kb、0.09kb，B片段酶切后产生2个片段，分别为3.24kb、0.05kb，图中A片段和B片段的“……”是相同的，因此“……”处为0.05kb，则基因M1的长度为2.8＋0.05＋3.24＝6.09(kb)，因此基因敲除片段的长度为6.32－6.09＝0.23(kb)。(3)获得基因M1后，与M1两条链两端互补的引物是引物1和引物2。由于质粒上有三个酶切位点，切割后会出现不同的黏性末端，而基因M1两端没有能与黏性末端互补的序列，故需要分别在基因两条链的5′端引入限制酶的识别序列，根据基因M1插入质粒的位置可知，添加的是限制酶HindⅢ、PstⅠ的识别序列。微专题11PCR技术与电泳相关问题【知识必备】题型一PCR技术的相关计算1.PCR扩增过程中的循环图示与规律2.PCR中的数量关系复制次数123nDNA分子数2482n含其中一种引物的数量1372n－1同时含两种引物的数量0262n－2共消耗引物的数量26142n＋1－2[典例1](2024·河北石家庄统考)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是()A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体，其原理是抗原—抗体杂交答案C解析PCR需要根据cDNA的核苷酸序列合成引物，同时RT—PCR还需要探针与待测样本DNA混合，故需要根据cDNA的核苷酸序列合成探针，A正确；PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误；RNA病毒的检测方法有：①RNA检测，即检测病毒的遗传物质RNA；②特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；③特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体，后两种方法的原理是抗原—抗体杂交，D正确。[典例2](2024·山东淄博模拟)定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：(1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的(填“①”或“②”)。(2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________。为将改良基因构建在质粒上，还需要等酶。(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是___________________________________________________________________________________。答案(1)2②(2)SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接BglⅡ、DNA连接酶(3)β－半乳糖苷构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β－半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色解析(1)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到的DNA有一个不