发酵工艺的控制课件

发酵工艺的控制发酵是一种很复杂的生产过程，其好坏涉及诸多因素，如菌种的生产性能、培养基的配比、原料质量、灭菌条件、种子质量、发酵条件和过程控制等。不论是老或新品种，都必须经过发酵研究这一阶段，以考察其代谢规律、影响产物合成的因素，优化发酵工艺条件。高产菌种对工艺条件的波动比低产菌种更敏感，故掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对生产的稳定和提高具有重要的意义。7.1发酵过程的操作类型7.1.1分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。一次投料，一次接种，一次收获间歇培养分批发酵过程一般可粗分为四期，即适应（停滞）期、对数生长期、生长稳定期和死亡期；也可细分为六期：即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期。分批发酵的优缺点：§操作简单、周期短§染菌的机会减少§生产过程、产品质量易掌握§不适用于测定过程动力学§对基质浓度敏感的产物，用分批发酵不合适7.1.2补料分批发酵一种介于分批培养和连续培养之间的操作方式。在进行分批培养的时候，向反应器内加入培养基的一种或多种成分，以达到延长生产期和控制培养过程的目的。没有输出或间歇放掉部分发酵液（半连续发酵）补料分批发酵与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点：1）可除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾；2）避免培养基积累有毒代谢物。与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题。半连续发酵的不足：1）放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体；2）定期补充和带放使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大；3）发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵产物的合成；4）一些经代谢产生的前体可能丢失；5）有利于非产生菌突变株的生长7.1.3连续发酵

连续培养或连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，使培养系统内培养液的液量维持恒定的微生物培养方式。连续发酵的优缺点：1）可提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；2）便于自动控制；3）增加了染菌机会：长时间不断地向发酵系统供给无菌空气和培养基；4）菌种发生变异的可能性较大。7.2发酵条件的影响及其控制微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件的控制。了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。常规的发酵条件：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体，通氨速率以及补水等。表征过程性质的状态参数：pH、溶氧（DO）、溶解CO2、氧化还原电位、尾气O2和CO2

含量、基质或产物浓度、代谢中间物或前体浓度、菌浓等。间接状态参数：比生长速率、摄氧率、释放速率（CER）、呼吸商（RQ）、基质消耗速率和产物合成速率等。7.2.1基质浓度对发酵的影响及其控制培养基的优化碳源浓度的影响：例：★谷氨酸发酵中，控制乙醇（作为碳源）浓度在2.5~3.5g/L可延长谷氨酸合成时间；★葡萄糖氧化酶（GOD）发酵中，降低葡萄糖用量，从8%降至6%，补入2%氨基乙酸或甘油，可使酶活分别提高26%和6.7%。7.2.2灭菌情况一般随灭菌温度的升高，时间的延长，对养分的破坏作用越大，从而影响产物的合成。如葡萄糖氧化酶发酵培养基的灭菌条件对产酶的影响：灭菌蒸汽压力/(lb/in2)1015时间/min15251525葡萄糖氧化酶酶活/(U/mL)48.0843.7235.0427.107.2.3种子质量§接种菌龄一般，接种菌龄以对数生长期的后期，即培养液中菌浓接近高峰时所需的时间较为适宜。最适的接种菌龄要经多次试验，根据其最终发酵结果而定。§接种量接种量的大小是由发酵罐中菌的生长繁殖速度决定的。7.2.4温度对发酵的影响和及其控制

微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。(1)温度对微生物生长的影响大多数微生物在20-40℃的温度范围内生长。嗜冷菌在温度低于20℃下生长速率最大，嗜中温菌在30-35℃左右生长，嗜热菌在50℃以上生长。(2)温度对发酵过程的影响

温度对青霉菌生长速率、呼吸强度和青霉素生产速率的影响如上图所示。可以看出，温度对参与生长繁殖、呼吸和青霉素形成的各种酶的影响是不同的。青霉菌：生长E=34kJ/mol

呼吸E=71kJ/mol

产物合成

E=112kJ/mol青霉素形成速率对温度最为敏感，偏离最适温度引起的生产率下降比其他两个参数的变化更为严重。活化能E反映温度变化对酶反应速率的影响(3)温度对发酵液物理性质的影响＃影响氧在发酵液中的溶解度

温度溶氧＃影响基质的分解速率

如菌体对硫酸盐吸收在25℃时最小(4)温度对生物合成方向的影响金色链丝菌

研究发现，温度与微生物的调节机制关系密切。例如，在20℃时，氨基酸末端产物对其合成途径的第一个酶的反馈抑制作用，比在其正常生长温度37℃时更大。因此，考虑在抗生素发酵的后期降低温度，加强氨基酸的反馈抑制作用，使蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些，从而使发酵代谢转向抗生素的合成。（5）影响发酵温度的因素发酵热

发酵热指的是发酵过程中释放出来的净热量，以J/(m3·h)为单位表示。

发酵热在整个发酵过程中是随时间变化的。所以，为使发酵在一定温度下进行，必须采取措施——在夹套或蛇管内通入冷水加以控制（小型的发酵罐，在冬季和发酵初期，散热量大于产热量则需用热水保温。（6）

最适温度的选择

所谓最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的合成。对不同的菌种、不同的培养条件、不同的酶反应以及不同的生长阶段，最适温度有所不同。例如，青霉素产生菌的最适生长温度为30℃，但产生青霉素的最适温度是24.7℃。★在不同的发酵阶段选择不同的温度（抗生素发酵）★参考其它发酵条件例如，通气条件较差的情况下，可以适当降低温度，一方面增加溶解氧浓度，另一方面降低菌体的生长速率，以弥补因通气不足而造成的代谢异常。★考虑培养基成分和浓度例如，在使用较稀薄或较易利用的培养基时，提高温度则养分往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，产量降低。

发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。7.2.5pH对发酵的影响和及其控制（1）pH对发酵过程的影响pH影响菌体的生长和产物的合成：（1）酶活（2）菌体的形态：细胞壁厚度、菌丝直径（3）细胞膜的电荷状态：引起膜渗透性的变化，从而影响菌对养分的吸收和代谢产物的分泌（4）产物的稳定性（5）对某些生物合成途径有显著影响微生物生长和生物合成的最适pH微生物生长：细菌（6.3~7.5),霉菌和酵母菌（3~6),放线菌（7~8)

微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH往往不一样，这不仅与菌种的特性有关，也取决于产物的化学性质。产品菌生长最适pH范围产物合成最适pH范围青霉素6.5~7.26.2~6.8链霉素6.3~6.96.7~7.3四环素6.1~6.65.9~6.3土霉素6.0~6.65.8~6.1红霉素6.6~7.06.8~7.3灰黄霉素6.4~7.06.2~6.5几种抗生素发酵的最适pH范围（2）发酵过程中pH的变化

发酵过程中，由于菌在一定温度及通气条件下对培养基中碳、氮源等的利用，随着有机酸或氨基氮的积累，会使pH产生一定的变化。这种变化的根源是培养基的成分和微生物的代谢特性。引起培养液的pH发生波动的因素引起pH下降的因素：1）培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累2）消沫油加得过多3）生理酸性物质的存在引起pH上升的因素：1）氮源过多2）生理碱性物质存在3）中间补料中氨水或尿素等的碱性物质加入过多（3）最适pH的选择和调节选择最适pH的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又要最大限度地使产物合成获得高的产量。控制pH的方法★酸碱中和（可以迅速中和培养基中当时存在的过量酸碱）★根本措施：调节培养基中生理酸性物质与生理碱性物质的配比，然后通过中间补料进一步加以控制。氧是一种难溶于水的气体。在25℃，1×105Pa条件下，氧在纯水中的溶解度为1.26mmol/L，空气中的氧在纯水中的溶解度更低（0.25mmol/L）。在28℃氧在发酵液中的100%的空气饱和浓度只有7mg/L左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期，即使发酵液被空气饱和，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗尽。在好氧深层培养中，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。7.2.6溶氧对发酵的影响和及其控制（1）临界氧发酵行业用空气饱和度百分数来表示溶氧浓度。这只能在相似的条件下，在同样的温度、罐压、通气搅拌下进行比较。这种方法能反映菌的生理代谢变化和对产物合成的影响。临界氧：不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度，如对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。★呼吸临界氧值可用尾气O2含量变化和通气量测定，也可用溶氧电极测定。各种微生物的临界氧值：

细菌和酵母：3~10%放线菌：5~30%霉菌：10~15%★合成的临界氧值：考察不同溶氧浓度对生产的影响，便可求得合成的临界氧值。注意：●实际上，呼吸临界氧值不一定与产物合成临界氧值相同。

●生物合成临界氧浓度并不等于其最适氧浓度。●在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。过高的溶氧对生长可能不利。（2）溶氧作为发酵异常的指标

生长过程从培养液中溶氧浓度的变化可以反映菌的生长生理状况。发酵溶氧变化异常，可及时预告生产可能出现的问题。★操作故障或事故★中间补料是否得当★污染杂菌：溶氧会反常地迅速（一般2~5h)跌到零，并长时间不回升。这比无菌试验发现染菌要提前几个小时。但有时会出现染菌后溶氧反而升高的现象。式中，dc/dt——单位时间内发酵液溶氧浓度的变化[mmol/(L·h)]KL——氧传质系数，m/h；

a——比表面积（m2/m3)c*——氧在水中的饱和浓度，mmol/L；

cL——发酵液中的溶氧浓度，mmol/L。在稳定情况下，氧分子从气体主体扩散到液体主体的传递速率即氧的传质方程式为：（3）溶氧的控制凡是使KLa和c*增加的因素都能使发酵供氧改善。供氧方面增加C*的办法：★在通气中掺入纯氧，提高氧分压；★提高罐压提高KLa(提高设备的供氧能力）的办法：项目设备条件项目设备条件搅拌器空气流量类型；封闭或开放式叶片形状；弯叶、平叶或箭叶搅拌器直径/罐直径挡板数和挡板宽度搅拌器档数和位置每分钟体积比[(V/V)/min]空气分布器的类型和位置搅拌转速罐压雷诺准数“K”因子功率准数弗罗德准数Pa与氧传质有关的工程参数需氧方面（3）溶氧的控制式中，r——摄氧率，mmolO2/(L·h)；

QO2——呼吸强度，mmolO2/(g菌·h)；

X——菌浓，g/L。若发酵液中溶氧保持不变，即供氧=需氧，则使供需失去平衡的因子也会改变溶氧浓度。项目工艺条件项目工艺条件菌种特性培养基的性能好气程度菌龄、数量菌的聚集状态，絮状或小球状基础培养基组成、配比物理性质；粘度、表面张力等补料或加糖温度溶氧与尾气O2及CO2水平消泡剂或油表面活性剂配方、方式、次数和时机恒温或阶段变温控制按生长或产物合成的临界值控制种类、数量、次数和时机种类、数量、次数和时机影响需氧的工艺条件控制溶氧的工艺手段（1）改变通气速率（增大通风量）：增大KLa值。注意，过分增大通气速率会产生副作用，如泡沫生成、罐温增高等。（2）改变搅拌速度：转速较低时，增大搅拌速度对提高溶氧浓度有明显作用；当转速很高时，再增大搅拌速度起不到调节作用，反而打碎菌丝体，使菌体自溶并减少产量。（3）改变气体组成中的氧分压（4）改变罐压：提高C*。不是十分有效（5）改变发酵液的理化性质：如加消沫剂、补加无菌水、改变培养基的成分等（6）加入传氧中间介质：一般是不溶于培养液的液体，呈乳化状态来提高气液相之间的传递。传氧中间介质有：血红蛋白、烃类碳氢化合物（煤油、石蜡等）、含氟碳化物。方法作用机理投资运转成本效果对生产作用气体成分C*变化中到低高好好搅拌速度KLa变化高低好好挡板KLa变化中低好好通气速率KLa变化低低中不定温度C*、氧需求变化低低变化不定基质浓度氧需求变化中低好不定罐压C*变化中到高低中好电解生产氧C*变化中低高小规模传氧中间介质KLa变化中中好好各种溶氧控制方法的比较7.2.7二氧化碳对发酵的影响和及其控制（1）二氧化碳对发酵的影响CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的一种基质，它是细胞代谢的重要指示。CO2的抑制作用

影响菌体生长、形态及产物合成大多数微生物适应低CO2浓度（0.02~0.04%体积分数）。当尾气CO2浓度高于4%时微生物的糖代谢与呼吸速率下降。高浓度的CO2会影响产黄青霉的菌丝形态。CO2对细胞的作用机制：CO2——主要作用在细胞膜的脂肪酸核心部位

——影响磷脂、亲水头部带电荷表面及细胞膜表面上的蛋白质

当细胞膜的脂质相中CO2浓度达到一临界值时，膜的流动性及表面电荷密度发生变化。这将导致膜对许多基质的运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，生长受抑制，形态发生变化。（2）呼吸商与发酵的关系呼吸商：RQ值可以反映菌的代谢情况，例如酵母培养过程：

RQ=1

糖代谢走有氧分解代谢途径，仅供生长、无产物形成；

RQ>1.1

走EMP途径，生成乙醇；

RQ=0.93

生成柠檬酸；

RQ<0.7

生成的乙醇被当作基质再利用。★菌在利用不同基质时，其RQ值也不同；★在抗生素发酵中在生长、维持和产物形成阶段的RQ值也不一样。（3）二氧化碳浓度的控制发酵液中CO2浓度受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度、罐压大小和设备规模等。值得注意的是，罐内的CO2分压是液体深度的函数。CO2浓度的控制：根据其对发酵的促进或抑制作用，通过调节通气量和搅拌速率，提高或降低其浓度。7.2.8加糖、补料对发酵的影响和及其控制

分批发酵常因配方中的糖量过多造成细胞生长过旺，供氧不足。解决这个问题可在过程中加糖和补料。补料的作用是及时供给菌合成产物的需要。通过补料控制可调节菌的呼吸，以免过程受氧的限制。补料的策略：一次性大量：操作简便，但会造成发酵液瞬时大量稀释，扰乱菌的生理代谢，难于将过程控制在最适合于生产的状态；多次少量：麻烦些，但更合理；连续流加：快速、恒速、指数和变速流加。补料的依据和判断：★依据：菌的形态、发酵液中糖浓度、溶氧浓度、尾气中的氧和CO2含量、摄氧率、呼吸商等★不同的发酵品种有不同的依据。一般以发酵液中的残糖浓度为指标。也有用产物的形成来控制补料。★不同的补料方式会产生不同的效果。7.3泡沫对发酵的影响及控制7.3.1发酵过程中泡沫的产生（1）由外界引进的气流被机械地分散形成（2）由发酵过程产生的气体聚结生成的发酵泡沫（3）发酵液中糖、蛋白质和代谢物等的存在起到稳定泡沫的作用泡沫产生的原因（1）通气、搅拌的剧烈程度（2）培养基所用原材料性质：蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、黄豆饼干粉、酵母粉和糖蜜等是主要的发泡物质。培养基中蛋白质含量越多，发酵液的粘度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久稳定。另外，培养基的灭菌方法、灭菌温度和时间也会影响到培养基成分的变化，从而影响培养基的起泡能力。泡沫消长的影响因素：7.3.2泡沫对发酵的危害（1）使发酵罐的装填系数减少（2）造成大量逃液，导致产物损失（3）增加了染菌的机会（4）增加了菌群的非均一性（5）消泡剂的加入给提取工序带来困难7.3.3发酵过程中泡沫的控制★机械消沫★化学消沫（消沫剂消沫）（1）机械消沫原理：利用物理作用，靠机械的强烈振动或压力的变化促使泡沫破碎。优点：节省原材料，不会增加下游工段的负担，减少染杂菌。缺点：效率不高（作为消沫的辅助方法），不能从根本上消除泡沫成因。例如：耙式消泡桨装在发酵罐的搅拌轴上，桨上的齿面略高于液面，靠轴的旋转带动来打碎泡沫，起到消泡的作用。罐内机械消沫罐内机械消沫通过喷头将含气泡的培养液喷向转向板，使其破裂，然后再流回发酵罐。罐外机械消沫罐外机械消沫（2）化学消沫★化学消沫的机理：化学消沫剂是表面活性剂。一般好的消沫剂应同时具备降低液膜的机械强度和表面粘度这两种性能。★常用的消沫剂（溶解度较小、分散性较差的高分子化合物）：a)天然油脂类：玉米油、豆油、菜油及猪油等b)高级醇类：十八醇、聚二醇等c)聚醚类：聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯氧丙烯甘油（“泡敌”）等d)硅酮类：聚二甲基硅氧烷及其衍生物e)氟化烷烃★消沫剂的使用方法：

a)机械分散、或借助分散剂

b)与载体一起使用

c)多种消沫剂并用

d)利用乳化剂增强消沫剂的消沫作用（2）化学消沫7.4发酵染菌的防治及处理染菌是发酵生产中的一个致命弱点，轻者影响了生产产品的收率和产品质量，重者会导致“倒罐”，造成严重的经济损失。★连续搅拌★供给无菌空气、排放多余空气★多次添加消沫剂、补充培养基★定时取样分析目前：提高生产技术水平，尽可能防止发酵染菌的发生，而且一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。7.4.1染菌的途径分析●种子包括进罐前菌种室阶段出问题●培养基的配制和灭菌不彻底●设备上特别是空气除菌不彻底和过程控制操作上的疏漏7.4.2染菌的判断和防治◆镜检◆无菌试验◆一些状态参数，如溶氧变化、排气中的CO2含量等◆异常现象，如菌体生长不良、耗糖慢、pH值异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常延长、发酵液的粘度异常增加等▲造成发酵染菌的原因有很多，且常因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气中有杂菌、种子带菌、灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。▲一般，从染菌的种类可大致判断其来源▲对抗生素发酵染菌：前期——原则上可适当改变生长参数，使有利于生产菌而不利于杂菌的生长，或加入某些抑制杂菌的化合物。中后期——除非是噬菌体通常后果不会那么严重。7.4.3染菌的挽救或处理（1）种子培养期染菌的处理

种子受到杂菌污染后，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。同时采用备用种子。（2）发酵前期染菌的处理

如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基重新进行灭菌处理后再用；否则，补充新鲜培养基，再进行灭菌处理。也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施。（3）发酵中、后期染菌的处理加入适当的杀菌剂或抗生素，以抑制杂菌的生长，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其他措施。若产物含量已达一定值，也可放罐。废液应加热灭菌后才能排放。（4）染菌后对设备的处理

彻底清洗发酵罐，并加热灭菌后才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。7.4.3染菌的挽救或处理7.5发酵终点的判断

产率、得率、发酵系数、高的产物浓度◆如要提高总产率，则必须缩短发酵周期。即在产率降低时放罐。◆放罐时间对下游工序有很大的影响。放罐过早，会残留过多养分，增加提取工段的负担；如放罐过晚，菌丝自溶，不仅会延长过滤时间，还可能使一些不稳定的产物浓度下跌，扰乱提取工段。◆临近放罐时加糖、补料或消沫剂要慎重。发酵类型不同，要求达到的目标也不同，因而对发酵终点的判断标准也应有所不同。判断放罐的指标主要有：产物浓度、过滤速度、菌丝形态、氨基氮、pH、DO、发酵液的粘度和外观等绝大多数抗生素发酵掌握在菌丝自溶前，极少数品种在菌丝部分自溶后放罐，以便胞内抗生素释放出来。7.6发酵过程参数监测的研究概况★常规在线测量和控制发酵过程的设定参数：罐温、罐压、通气量、搅拌转速等★状态参数的测量pH和溶氧电极：为了克服漂移和潜在的探头失效问题，发明了探头可伸缩的适合于大规模生产的装置。尾气分析：红外和顺磁氧分析仪可分别测定尾气CO2和O2含量，也可用质谱仪测定。★离线分析除pH和DO外，没有可就地监测培养基成分和代谢产物的传感器，这是由于开发可灭菌的探头或建立一种能无菌取样系统有一定困难。所以，发酵液中的基质（糖、脂质、盐、氨基酸），前体和代谢产物（抗生素、酶、有机酸和氨基酸）以及菌量