分子生物学常用技术及其应用课件

分子生物学常用技术及其应用

目录第一节

基因工程

geneticengineering

重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉不能忘记的人

孟德尔(1822-1884)，“遗传学之父”，奥地利原天主教神父

在1865年他根据豌豆七对不同性状的杂交实验，总结出遗传因子的概念以及在生殖细胞成熟中同对因子分离、异对因子自由组合两条遗传规律，也就是人们称为的孟德尔因子和孟德尔定律。他发现了遗传基因原理，总结出分离规律和自由组合规律，为遗传学提供了数学基础，创立了孟德尔学派。

不能忘记的人

摩尔根（ThomasHuntMorgan）（1866―1945年）美国遗传学家

不能忘记的人

从1910年到30年代托马斯·亨特·摩尔根及其助手在果蝇遗传实验中，进一步证实了孟德尔因子的存在，证实了孟德尔已经发现过的遗传的分离定律和自由组合定律，而且还作出了另外两大重要发现：一是发现基因是在染色体上，二是发现了遗传的基因连锁和互换定律。在果蝇遗传实验的基础上，摩尔根还建立了作为摩尔根理论主要基础的基因学说。

“实验方法的本质在于要求每一种见解或假说都必须通过实验的检验，然后才得以承认其科学地位。”——摩尔根

不能忘记的人沃森（JamesDeweyWatson）和克里克（FrancisHarryComptonCrick）

1953年4月25日，英国《自然》杂志发表了沃森和克里克的文章“核酸的分子结构——脱氧核糖核酸的一个结构模型”。标志着DNA双螺旋结构的建立，从此，遗传学的历史和生物学的历史都从细胞阶段进入了分子阶段。

桑格（FrederickSanger）、吉尔伯特（WalterGilbert）

桑格（英国化学家）由于最早准确地测定了胰岛素51个氨基酸的序列而获得1958年的诺贝尔化学奖。22年后，他又因测定了一种噬菌体的DNA一级结构而获1980年的诺贝尔化学奖。在DNA测序领域，吉尔伯特也因其卓越的工作获得80年的诺贝尔化学奖，共同为推进生命科学的进步作出了贡献。

伯格（美国生物化学家）通过把两个不同来源的DNA连接在一起并发挥其应有的生物学功能，证明了完全可以在体外对基因进行操作。他作为“重组DNA技术之父”，于1980年获诺贝尔化学奖。1973年，美国斯坦福大学医学院的科恩等人和博耶等人将大肠杆菌中两种不同特性的质粒片段用内切酶和连接酶进行剪切和拼接，获得了第一个重组质粒，然后通过转化技术将它引入大肠杆菌细胞中进行复制，并发现它能表达原先两个亲本质粒的遗传信息，从而开创了遗传工程的新纪元。伯格（PaulBerg）、科恩、H·博耶

不能忘记的人穆利斯（KaryB.Mullis）

1985年穆利斯发明了高效复制DNA片段的“聚合酶链式反应(PCR)”技术，利用该技术可从极其微量的样品中大量生产DNA分子，使基因工程获得了革命性发展。“实验科学，与人们习惯的其他事物都不同，像一株野草，在我们不经意间成长着。这株野草一年四季都能结出许多耀眼的真理和奇妙的机器。艺术囿于奇想和时尚。宗教着重内心而仅能自持。法律忽而放纵我们，忽而使我们沦为奴隶。惟有实验科学，才以一种不可预见但有规律的方式给我们每个人送来果实。为了获取这些果实，旧时的帝王定会不惜兵戎相见”。——穆利斯相关概念工具酶载体基本原理基本过程基因工程在医学中的应用本节主要内容一、基因工程的基本概念（一）DNA重组(DNArecombination)不同来源的DNA分子可以通过末端共价连接（磷酸二酯键）而形成重新组合的DNA分子，这一过程称为DNA重组。DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。基因克隆示意图（二）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）（三）生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端逆转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记碱性磷酸酶切除末端磷酸基末端脱氧核苷酸转移酶3′末端多聚尾二、常用的工具酶：（一）限制性核酸内切酶1.定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ一把特殊的剪刀

—限制性内切酶的发现

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）作用：限制-修饰系统第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。2.命名Hin

dⅢ属

系

株序Haemophilus

influenzae

d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶3.Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

4.Ⅱ类酶的切割位点

：出现两种末端粘性末端粘端（5’突出、3’突出）平头末端平端

GGATCCCCTAGG4~6bp粘性末端与平头末端

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

5’-G5’-AATTC-3’3’-CTTAA-5’G-5’Sticky

ends（1）5’突出粘性末端

ApaI5’-GGGCCC-3’3’-CCCGGG-5’

5’-GGGCC-3’C-3’3’-C3’-CCGGG-5’（2）3’末端突出的粘性末端

EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’（3）平头末端（钝性末端）1、DNA连接酶大肠杆菌的DNA连接酶T4噬菌体的DNA连接酶（二）其它工具酶2.DNA聚合酶（1）种类及性质主要有：大肠杆菌DNA聚合酶IT4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶①要求有DNA单链为模板和3’-OH的引物链②具有5’3’聚合活性、5’3’外切酶活性、和3’5’外切酶活性③要求DNA底物具有5’-磷酸和3’-羟基共同特性：（2）主要用途合成ds-cDNA第二条链对DNA的3’端进行填补或末端标记E.coli

DNA聚合酶I用于缺口平移，制作DNA标记探针DNA聚合酶I和T4DNA聚合酶用于DNA序列测定TaqDNA聚合酶用于PCR3.逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA模板、引物、dNTPs）主要用途：①构建cDNA文库②填补和标记3’端制备DNA探针③DNA序列测定4、多聚核苷酸激酶5’-HOOH-5’5’-PP-5’ATP(γ-P)或RNAP-5’DNA用途：①放射性标记DNA链的5’端②使缺少5’-磷酸基的DNA磷酸化，用于连接反应。5、碱性磷酸酶5’-PP-5’5’-HOOH-5’用于防止载体的自身连接6、末端脱氧核苷酸转移酶3’5’NNNNNNN5’dNTP为底物ssDNA或dsDNA为模板5’3’5’NNNNNNN三、载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA粘粒DNA病毒DNA载体的选择标准能自主复制，并有较高的拷贝数；容易进入宿主细胞；常具有多个RE的单一酶切位点，称为多克隆位点（外源DNA插入点）；容易从宿主细胞中分离纯化；有容易被识别筛选定标志。载体的结构特点复制起始点单一的限制酶切割位点选择标记三个基本要素（一）质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。一般大小在2~300kb。＜15kb的易分离纯化一般容纳＜10kb外源DNA目录pUC系列的特点pBR322的ampr的抗性基因和复制起始点(ori)E.coli的Lac操纵子的LacI、LacP、

LacO及

LacZ’基因片段，在LacZ’

基因中加入了多克隆位点。互补lacZ基因编码大肠杆菌的－半乳糖苷酶，此酶是乳糖分解过程的重要酶，同时可作用于生色底物X－gal，产生蓝色化合物。载体中的lacZ’基因编码此酶的N端片段，称片段。与之相应，采用的受体大肠杆菌lacZ基因缺陷，只能产生酶的C端片段，称片段。当片段与片段共同存在时具有－半乳糖苷酶活性，而单独存在时无活性。λ噬菌体基因组：约50kb的线性双链DNA分子

cos末端：互补的单链末端2种繁殖方式：溶菌性；溶原性（二）噬菌体(phage)

（三）粘性质粒(cosmid)－粘粒由λ噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，猴空泡病毒，逆转录病毒）（四）病毒及其他四、重组DNA技术的基本原理克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。DNA重组技术（分子克隆技术、基因工程技术）

是指采用分子生物学的方法分离目的基因片段，进行剪切和组合等处理后，与适当的载体DNA分子进行重组，然后将重组体分子引入特定的宿主细胞中进行大量复制和表达的一整套实验技术。五、重组DNA技术的基本过程基本步骤：制备目的基因和相关载体将目的基因与载体连接将重组的DNA导入受体细胞DNA重组体的筛选和鉴定DNA重组体的扩增、表达和其它研究以质粒为载体的DNA

克隆过程目录（一）目的基因的制备1.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)2.制备cDNA文库(cDNAlibrary)3.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)4.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。

组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列（二）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。2.同聚物加尾连接末端转移酶AAAAAAAATTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTT3.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（三）将外源DNA导入宿主细胞（四）目的基因的筛选和鉴定

1.遗传学方法2.分子杂交方法3.免疫学方法(插入失活法)抗药