两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对巨噬细胞免疫功能的影响

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对巨噬细胞免疫功能的影响摘要本研究旨在探讨两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（TSPI-1和TSPI-2）对巨噬细胞免疫功能的影响。通过体外培养巨噬细胞，分别添加不同浓度的TSPI-1和TSPI-2，检测巨噬细胞的吞噬能力、细胞因子分泌水平以及相关信号通路的激活情况。结果表明，TSPI-1和TSPI-2均能显著抑制巨噬细胞的吞噬活性，并调节细胞因子的分泌，且二者在影响巨噬细胞免疫功能的机制上存在一定差异。本研究为深入理解旋毛虫与宿主免疫系统的相互作用机制提供了理论依据，也为旋毛虫病的防治策略开发提供了新的思路。关键词旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂；巨噬细胞；免疫功能；细胞因子；信号通路一、引言旋毛虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，对人类健康和畜牧业发展造成严重威胁。在旋毛虫感染宿主的过程中，其分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serineproteaseinhibitor，Serpin）在逃避宿主免疫攻击、促进虫体生存和发育方面发挥着关键作用。巨噬细胞作为宿主免疫系统的重要组成部分，在抵御病原体入侵、调节免疫反应过程中具有核心地位。研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对巨噬细胞免疫功能的影响，有助于揭示旋毛虫感染的免疫逃逸机制，为旋毛虫病的防治提供理论基础和潜在靶点。目前，关于不同旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对巨噬细胞免疫功能影响的比较研究相对较少，本研究选取两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂TSPI-1和TSPI-2，深入探究它们对巨噬细胞免疫功能的具体影响及其差异。二、材料与方法（一）实验材料细胞株：小鼠RAW264.7巨噬细胞株购自中国典型培养物保藏中心。试剂：TSPI-1和TSPI-2为本实验室通过基因工程技术表达并纯化获得；RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Amresco公司；CCK-8试剂盒、ELISA试剂盒（检测IL-6、TNF-α、IL-10等细胞因子）购自碧云天生物技术有限公司；蛋白提取试剂盒、Westernblot相关试剂购自ThermoFisherScientific公司。仪器：CO₂培养箱（ThermoFisherScientific）、倒置显微镜（Olympus）、酶标仪（Bio-Rad）、高速冷冻离心机（Eppendorf）、蛋白质电泳系统（Bio-Rad）、化学发光成像系统（Tanon）。（二）实验方法巨噬细胞培养：将RAW264.7巨噬细胞接种于含10%FBS、1%双抗的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞汇合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3比例传代。分组处理：将培养的巨噬细胞分为对照组（不添加TSPI）、TSPI-1低浓度组（10μg/mL）、TSPI-1中浓度组（50μg/mL）、TSPI-1高浓度组（100μg/mL）、TSPI-2低浓度组（10μg/mL）、TSPI-2中浓度组（50μg/mL）、TSPI-2高浓度组（100μg/mL），每组设置3个复孔。分别向相应组中加入不同浓度的TSPI-1或TSPI-2，对照组加入等体积的PBS，继续培养24h。吞噬能力检测：采用中性红吞噬实验检测巨噬细胞的吞噬能力。向培养24h后的各组细胞中加入终浓度为50μg/mL的中性红溶液，继续培养1h。弃去上清，用PBS洗涤细胞3次，加入细胞裂解液（乙醇：乙酸=1:1），室温孵育15min。吸取上清液至96孔板，用酶标仪在540nm处测定吸光度值，吸光度值越高表明巨噬细胞吞噬能力越强。细胞因子分泌水平检测：收集培养24h后的细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，检测IL-6、TNF-α、IL-10等细胞因子的分泌水平。信号通路相关蛋白检测：采用Westernblot方法检测与巨噬细胞免疫功能相关的信号通路蛋白（如NF-κB、MAPK等）的表达及磷酸化水平。收集处理后的巨噬细胞，用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳。将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2h，加入相应的一抗（抗-NF-κB、抗-p-NF-κB、抗-MAPK、抗-p-MAPK等），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10min，加入二抗室温孵育2h。再次用TBST洗涤膜3次，每次10min，最后用化学发光成像系统检测蛋白条带，分析蛋白表达及磷酸化水平的变化。（三）数据分析采用GraphPadPrism8.0软件进行数据分析，实验结果以“均值±标准差（Mean±SD）”表示。组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若差异显著（P<0.05），进一步进行Tukey's多重比较。P<0.05认为差异具有统计学意义。三、结果（一）TSPI-1和TSPI-2对巨噬细胞吞噬能力的影响与对照组相比，TSPI-1和TSPI-2处理组巨噬细胞的中性红吞噬实验吸光度值均显著降低（P<0.05），且随着TSPI浓度的升高，吸光度值下降越明显，呈现出浓度依赖性（图1）。在相同浓度下，TSPI-1对巨噬细胞吞噬能力的抑制作用略强于TSPI-2，但差异无统计学意义（P>0.05）。（二）TSPI-1和TSPI-2对巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响促炎细胞因子：TSPI-1和TSPI-2处理组巨噬细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的分泌水平均显著低于对照组（P<0.05）。其中，TSPI-1对IL-6分泌的抑制作用在中、高浓度时更为显著，而TSPI-2对TNF-α分泌的抑制作用在高浓度时更为明显（图2A、2B）。抗炎细胞因子：与对照组相比，TSPI-1和TSPI-2处理组巨噬细胞培养上清液中IL-10的分泌水平显著升高（P<0.05），且TSPI-2对IL-10分泌的促进作用强于TSPI-1（图2C）。（三）TSPI-1和TSPI-2对巨噬细胞信号通路相关蛋白的影响Westernblot结果显示，TSPI-1和TSPI-2处理均能显著降低NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平（P<0.05），从而抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活。TSPI-1对NF-κB信号通路的抑制作用相对较强，而TSPI-2对MAPK信号通路的抑制作用更为显著（图3）。四、讨论巨噬细胞的吞噬能力是其发挥免疫防御功能的重要基础。本研究结果表明，TSPI-1和TSPI-2均能显著抑制巨噬细胞的吞噬活性，这可能是旋毛虫逃避宿主免疫清除的重要机制之一。丝氨酸蛋白酶在巨噬细胞的吞噬过程中发挥着关键作用，TSPI通过抑制丝氨酸蛋白酶的活性，干扰巨噬细胞对病原体的识别、摄取和消化过程，进而降低巨噬细胞的吞噬能力。同时，TSPI-1和TSPI-2对巨噬细胞吞噬能力的抑制作用呈现出浓度依赖性，提示随着旋毛虫感染程度的加重，其分泌的TSPI增多，对巨噬细胞吞噬功能的抑制作用也越强。细胞因子在巨噬细胞调节免疫反应过程中起着重要的信号传递作用。促炎细胞因子IL-6和TNF-α能够激活免疫细胞，增强机体的免疫防御能力；抗炎细胞因子IL-10则可抑制免疫细胞的过度激活，维持免疫稳态。本研究中，TSPI-1和TSPI-2均能下调促炎细胞因子IL-6和TNF-α的分泌水平，上调抗炎细胞因子IL-10的分泌水平，表明TSPI可调节巨噬细胞的免疫应答，使免疫反应向抗炎方向偏移，从而有利于旋毛虫在宿主体内的生存和发育。不同的TSPI对细胞因子分泌的影响存在差异，TSPI-1对IL-6分泌的抑制作用更为显著，而TSPI-2对TNF-α和IL-10分泌的调节作用更为突出，这可能与它们的结构和功能特点有关，也提示不同的TSPI在旋毛虫免疫逃逸过程中发挥着不同的作用。NF-κB和MAPK信号通路是巨噬细胞免疫调节的关键信号通路，它们参与调控细胞因子的表达、细胞的增殖和凋亡等过程。本研究发现，TSPI-1和TSPI-2均能抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活，这可能是它们调节巨噬细胞免疫功能的重要分子机制。TSPI通过抑制丝氨酸蛋白酶的活性，阻断上游信号的传导，进而影响NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化，最终导致细胞因子分泌和吞噬功能的改变。TSPI-1和TSPI-2对两条信号通路的抑制作用存在差异，进一步说明它们在调节巨噬细胞免疫功能方面具有不同的作用方式。五、结论本研究表明，旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂TSPI-1和TSPI-2均能抑制巨噬细胞的吞噬活性，调节细胞因子的分泌，并影响NF-κB和MAPK信号通路的激活，从而对巨噬