CN120204478A 一种胶原蛋白生长因子复合材料及其制备方法和应用

(19)国家知识产权局(71)申请人哈尔滨沛奇隆生物制药有限公司地址150000黑龙江省哈尔滨市双城经济技术开发区娃哈哈路4号(102国道门)(72)发明人张伊骁范立民梁生福林钦婷王晓苗(74)专利代理机构北京牛思巴巴知识产权代理A61L有限公司16203专利代理师刘静荣A61L27/48(2006.01)(54)发明名称一种胶原蛋白生长因子复合材料及其制备方法和应用本发明提供了一种胶原蛋白生长因子复合材料及其制备方法和应用，属于生物材料制备技术领域。本发明提供的制备方法能够优化胶原-bFGF复合材料产品的力学性能、抗降解性能、延长产品中FGF的缓释周期；本发明通过加入抗氧化剂、利用优先与氧化自由基结合的机制，在冻干以及储存过程中提升bFGF稳定性；采用急速预冻方式，减小形成冰晶尺寸，减缓局部pH或离子21.一种胶原蛋白生长因子复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将胶原蛋白溶液与诱导溶液混合，进行纤维化诱导处理，得到纤维化胶原溶液；对所述纤维化胶原溶液进行梯度清洗换液处理，所述梯度清洗换液处理包括第一次清洗换液、第二次清洗换液和第三次清洗换液，所述第一次清洗换液、第二次清洗换液和第三次清洗换液中采用的缓冲溶液用量依次递减，得到清洗后胶原蛋白溶液；将配制溶液进行冷冻干燥处理，得到胶原蛋白生长因子复合材料；所述诱导溶液中含有磷酸盐。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白溶液在进行纤维化诱导处理前还包括进行过滤除菌处理；所述过滤除菌处理包括先采用0.4~0.5μm滤膜进行过滤，再采用0.1~0.3μm滤膜进行过所述胶原蛋白溶液的浓度为1~10mg/ml;所述磷酸盐的浓度为0.1~0.4M;所述磷酸盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾中的一种或几种；所述胶原蛋白溶液与诱导溶液混合的体积比为3~20:1。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述诱导溶液中还含有氯化钠；所述氯化钠的浓度为0.1~2M;所述纤维化诱导处理的pH为6.0~8.0;所述纤维化诱导处理的温度为25~38℃;所述纤维化诱导处理的时间为1~36h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述依次递减的用量递减倍数为0.3~0.8倍；所述梯度清洗换液处理采用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10~25mM,pH值为7.5~8.0;所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为5~10mM,pH值为7.5~9.5;所述第一次清洗换液采用的缓冲溶液用量为胶原溶液重量的8~15倍。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述补加缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液；所述配制溶液中的胶原蛋白浓度为5~10mg/g;所述bFGF的添加量为300~600IU/ml。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂选自甘露醇、抗坏血酸、所述甘露醇的添加终浓度为0.1~0.2M;所述抗坏血酸的添加终浓度为5~20mM;所述甘油的添加终浓度为0.1~0.2M;所述芦丁的添加终浓度为5~20mM;所述表儿茶素的添加浓终度为5~20mM;所述儿茶素的添加终浓度为5~20mM。37.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥处理的上样量为0.3~8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥处理包括以下阶段：冷冻阶段：温度-45~-40℃,维持15~60min;第一干燥阶段：温度-20~-15℃,维持140~220min,真空度0.2bar;第二干燥阶段：温度-15~-10℃,维持280~460min,真空度0.2bar;第三干燥阶段：温度-5~5℃,维持1100~1520min,真空度0.2bar;第四干燥阶段：温度10~20℃,维持240~300min。9.通过权利要求1~8任一项所述的制备方法制得的胶原蛋白生长因子复合材料。10.权利要求9所述的胶原蛋白生长因子复合材料在制备促软组织修复材料中的应用。4一种胶原蛋白生长因子复合材料及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物材料制备技术领域，尤其涉及一种胶原蛋白生长因子复合材料及其制备方法和应用。背景技术[0002]软组织修复是临床医学的重要挑战，涉及创伤愈合、术后修复及慢性溃疡治疗等领域。胶原蛋白作为人体细胞外基质的主要成分，因其良好的生物相容性、可降解性及促细其纤维状结构和力学支撑特性，尤其适合作为软组织修复的支架材料。然而，单纯胶原蛋白的被动修复机制存在局限性，如细胞增殖速率低、血管生成能力不足等，难以满足复杂创面的高效修复需求。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种具有多效性的内源性活性蛋白，可显著促进成纤维细胞增殖、血管新生及细胞外基质合成，是主动调控组织修复的关键因活性调控的双重机制加速修复进程。[0003]中国专利CN101279104A公开了一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法，包括以下步骤：1.用动物的皮或结缔组织生产胶原蛋白酶解液；2.用表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子分别加入胶原蛋白的酶解液中；3.将含有表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子的胶原蛋白酶解液经真空冷冻干燥成海绵状；4.将含有表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的胶原蛋白海绵切割、包装、钴60照射灭菌。[0004]但是上述技术无法避免制备过程中bFGF的失活、从而影响终产品安全有效性的问发明内容[0005]本发明的目的在于提供一种胶原蛋白生长因子复合材料及其制备方法和应用，能[0006]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种胶原蛋白生长因子复合材料的制备方法，包括以下步骤：将胶原蛋白溶液与诱导溶液混合，进行纤维化诱导处理，得到纤维化胶原溶液；对所述纤维化胶原溶液进行梯度清洗换液处理，所述梯度清洗换液处理包括第一次清洗换液、第二次清洗换液和第三次清洗换液，所述第一次清洗换液、第二次清洗换液和第三次清洗换液中采用的缓冲溶液用量依次递减，得到清洗后胶原蛋白溶液；将清洗后胶原溶液与补加缓冲溶液、bFGF和抗氧化剂混合，得到配制溶液；将配制溶液进行冷冻干燥处理，得到胶原蛋白生长因子复合材料；所述诱导溶液中含有磷酸盐。[0007]优选的，所述胶原蛋白溶液在进行纤维化诱导处理前还包括进行过滤除菌处理；所述过滤除菌处理包括先采用0.4~0.5μm滤膜进行过滤，再采用0.1~0.3μm滤膜进5行过滤；所述胶原蛋白溶液的浓度为1~10mg/ml;所述磷酸盐的浓度为0.1~0.4M;所述磷酸盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾中的一种或几种；所述胶原蛋白溶液与诱导溶液混合的体积比为3~20:1。[0008]优选的，所述诱导溶液中还含有氯化钠；所述氯化钠的浓度为0.1~2M;所述纤维化诱导处理的pH为6.0~8.0;所述纤维化诱导处理的温度为25~38℃;所述纤维化诱导处理的时间为1~36h。[0009]优选的，所述依次递减的用量递减倍数为0.3~0.8倍；所述梯度清洗换液处理采用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10~25mM,pH值为7.5~8.0;所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为5~10mM,pH值为7.5~9.5;所述第一次清洗换液采用的缓冲溶液用量为胶原溶液重量的8~15倍。[0010]优选的，所述补加缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液；所述配制溶液中的胶原蛋白浓度为5~10mg/g;所述bFGF的添加量为300~600IU/ml。一种或几种；所述甘露醇的添加终浓度为0.1~0.2M;所述抗坏血酸的添加终浓度为5~20mM;所述甘油的添加终浓度为0.1~0.2M;所述芦丁的添加终浓度为5~20mM;所述表儿茶素的添加浓终度为5~20mM;所述儿茶素的添加终浓度为5~20mM。[0012]优选的，所述冷冻干燥处理的上样量为0.3~0.8ml/cm²。[0013]优选的，所述冷冻干燥处理包括以下阶段：冷冻阶段：温度-45~-40℃,维持15~60min;第一干燥阶段：温度-20~-15℃,维持140~220min,真空度0.2bar;第二干燥阶段：温度-15~-10℃,维持280~460min,真空度0.2bar;第三干燥阶段：温度-5~5℃,维持1100~1520min,真空度0.2bar;第四干燥阶段：温度10~20℃,维持240~300min。[0014]本发明还提供了通过上述制备方法制得的胶原蛋白生长因子复合材料。[0015]本发明还提供了上述胶原蛋白生长因子复合材料在制备促软组织修复材料中的应用。[0016]本发明的有益效果：本发明提供的制备方法能够优化胶原-bFGF复合材料产品的力学性能，使其在使6满足组织再生要求；以及能够加强与bFGF的结合，延长缓释周期。由于过滤除菌后倾向于聚集的胶原纤维更多被去除，得到的都是胶原蛋白分子，通过纤维化诱导，可以加强胶原海绵支架的强度，延长产品降解时间，同时延长FGF缓释周期；本发明胶原纤维化后采用了梯度清洗换液的方法，降低无机盐浓度，调整溶液pH值的纤维状态，最终促进胶原和bFGF的结合延长缓释周期。本发明通过加入抗氧化剂、利用优先与氧化自由基结合的机制，在冻干以及储存过程中提升bFGF稳定性；采用急速预冻方式，减小形成冰晶尺寸，减缓局部pH或离子强度的剧烈变化，进而保护bFGF的活性。在无菌工艺应用场景中，本发明的制备方法采用梯度清洗换液步骤，与常规透析步骤(设备操作繁杂)具体实施方式[0017]下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0018]实施例取浓度为1-10mg/ml的胶原蛋白溶液经0.45μm、0.2μm两级过滤，达到过滤除菌目向胶原蛋白溶液中加入诱导溶液，诱导胶原蛋白自组装成纤维。[0020]诱导溶液包括磷酸盐及氯化钠组成，其中磷酸盐种类包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾，溶液中磷酸盐物质的量浓度为0.1-0.4M,氯化钠物质的量浓度为0-2.0M,胶原与诱导溶液混合的比例为4:1至19:1,混合后调整pH值至6.0-8.0范围内，25-37℃,诱导反应1.0-36.0h。纤维化后的胶原溶液离心去上清，第一次清洗加入10倍重量的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HC1缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液中磷酸盐物质的量浓度为10-25mM,pH值为7.5-8.0,Tris-HCl缓冲溶液物质的量浓度为5-10mM,pH值为7.5-9.5.混合均匀后离心去上清。[0022]第二次清洗加入10倍重量的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液与第一次清洗液相同，含量为第一次清洗液的1/2.混合均匀后离心去上清。[0023]第三次清洗加入10倍重量的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，缓冲溶液与第二次清洗液相同，含量为第二次清洗液的1/2.混合均匀后离心去上清。根据胶原蛋白含量加入一定量的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，至胶原蛋白浓度为8mg/g,缓冲溶液与第三次清洗液相同，含量为第三次清洗液的1/2。[0025]加入bFGF和抗氧化剂，bFGF添加比例为300-600IU/ml(以胶原蛋白溶液用量计)。7按0.5ml/cm²上样进行冷冻干燥，冻干工艺如下。[0028]在以上方案基础上，分别改动以下技术手段，得到实施例和对比例，如下表1~2所表1实施例设置方案8段实施例1实施例2实施例3过滤除菌液浓度纤维化诱导胶原与比例混合后值度反应时间420mM磷酸盐缓冲液15mM磷酸盐缓冲液配制剂0.05M甘油;20℃,时间：200mi冷冻阶段，温度：43℃,时间：60mi20℃,时间：150冷冻阶段，温度：-40℃,时间：20mi18℃,时间：2209;10℃,时间：300mi;5℃,时间：12000min,真空度：0.2b度：15℃,时间：214℃,时间：330度：0℃,时间：1320min,真空度：10℃,时间：400度：2℃,时间：1[0029]表2对比例设置方案对比例1对比例3过滤除菌浓度同实施例1同实施例1同实施例1纤维化诱导调整pH值至7.0,25℃,半小时后同实施例1同实施例1导溶液混合比例混合后调诱导温度反应时间同实施例1导率<300同实施例1配制同实施例1抗氧化剂不添加抗氧化剂5℃,时间：60min;温度：-15℃,时间：60min;温度：-25℃,时间：60min;温度：-35℃,时间：60min;温度：-42℃,时间：60min;20℃,时间：200min,真空度：0.2bar;1110℃,时间：300min,真空度：0.2bar;5℃,时间：12000min,真空度：0.2bar;第四干燥阶段，温度：15℃,时间：240min。参照YY/T0500-2004中8.3.3.1方法，取产品用7.3cm²的圆环夹持器，以100cm³/min的体积增长速度进行检测，记录产品胀破时的胀破压力，测试无样品时膜片的压力两者差即为产品的胀破强度。为2的1%胃蛋白酶溶液中37℃环境下酶解，每1分钟观察一次产品状态，记录产品完全降解的时间，以3个平行样的平均时间记录为产品的降解时间。表3力学性能和降解时间结果组别降解时间min实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2对比例