DB65T 3801-2015 牛环形泰勒虫病防治技术规程

牛环形泰勒虫病防治技术规程2015-12-30实施2015-12-30实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布I本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求编制。本标准由新疆农业大学提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。本标准起草单位：新疆农业大学、伊犁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：巴音查汗·盖力克、郭庆勇、王振宝、张杨、王冰洁、伊春阳、李永畅、朱玉1本标准适用于养牛场(户)、动物诊疗机构和动物防疫防控机构对牛环形泰勒虫病的防控。牛环形泰勒虫病(Bovinetheileriosis),是由泰勒虫属的环形泰勒虫(Theileriaannulata)寄生于动物红细胞和网状内皮系统、器官而引起的一种蜱传血液原虫病。世界动物卫生组织(OIE)将其定为环形泰勒虫(Theileriaannulata),隶属于原生配子体寄生于红细胞，其形态为环形、戒指状(70%～80%)、椭圆形、逗点状、杆状、十字形裂殖体又称石榴体或柯赫氏蓝体(koch'sbluebodies),寄生于巨噬细胞、淋巴细胞等网状内皮细胞细胞的胞浆内或散在于细胞外，呈圆形、肾形或者椭圆形(详见附录E.3)。2而感染(详见附录F)。传播牛梨形虫的硬蜱有3属8种，其中新疆已被证实的媒介蜱为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、残缘璃眼蜱(详见附录G)。在差异，每年5月中旬开始出现，但因当年气温的升高或降低也会出现上下浮动，(6～7)月达高峰， (8～9)月逐渐平息；耐过牛的免疫力可持续(2.5~6)年，长期“带虫”;据报道该病在我区的感染率可达60%,其急性病例死亡率较高。体温升高至39℃~41.8℃,达42℃,呈稽留热，少数病牛呈弛张热或间歇热。淋巴结肿大有痛感，柯赫氏蓝体(石榴体),此期可延续2d～5d。深红色结节状的溢血斑点，趋于死亡征兆，死亡常发生在发病后的(1～2)周；耐过的牛，若能得到良膜有出血点；严重病例粘膜病变面积可占1/2以上；尸僵明显，尸体消瘦，全身皮病原学诊断包括血液型虫体的鉴定和组织型虫体(网状内皮系统内虫体)的鉴定。3经血液涂片染色，在显微镜下检查发现血液型虫体是确诊的主要依据(镜检方法见附录A)。镜下观察到与附录E.1、E.2相同虫体即可确该病的初期，虫体一般侵袭患病宿主的网状内皮系统(淋巴结、脾脏等),检查发现脏器型虫体也集的蜱虫放入相应编号的采集管内，以平均只数/牛个数计算密度(详见附录B)。送回实验室，进行鉴定媒介蜱种类及检测其携带的病原。如发等野外采集蜱虫时常用布旗法、兽皮法采集(详见附录B);在牛体表、周围环境及植被中发现媒介蜱虫(详见附录G)是确诊的主要依据。3.6牛环形泰勒虫病PCR诊断根据PCR检测结果判定(详见附录C)。按(3.5～7)mg/kg,用生理盐水稀释成5%溶液，按(4～6)mg/kg分点深部肌肉注射，每个注射点不应超过1g,每日1次，连用3d;48h后重复用药。按(0.75～1.5)mg/kg,每日口服一次，连用3d。4按(4～8)mg/kg,加水灌服，首次倍量，每隔12h重复1次。每日每头牛2kg～3kg,分两次口服，用法：将青蒿切碎，用冷水浸泡1h～2h,然后连渣灌服，连服3d。对于食欲减退牛灌服促反刍散，每头灌服150g～300g,每天灌服1次；心力衰竭牛肌注10%安钠加；血尿牛注射20mL0:5%的安络血。对于病情较严重的牛，采用输血疗法，取健康奶牛血液300ml～500ml,静脉输入病牛体内，每天在流行区的发病季节，用黄色素(参考4.2.1)和贝尼尔(参考4.2.2)给牛进行药物预防注射。圈(防圈舍蜱)和避开媒介蜱孳生地放牧。每年(3～6)月为我区牛环形泰勒虫病高发季节，每月采集牛血和环境周围的媒介蜱提取DNA后，采用3.6给出的检测方法进行检测，一经发现阳性病例及时治疗；同时每年在发病季节，采用5.2的方55.2.3提高宿主牛的抗病能力对患病牛，改善饲养环境，完善圈舍卫生、防蜱措施和护理；对非疫区、疑似牛采取综合防御措施，加强驱虫保健。6(规范性附录)病原学诊断方法A.1血液型虫体鉴定方法A.1.1主要设备、材料和试剂冰箱、离心机、光学显微镜、体视显微镜、移液器、吸头、离心管、载玻片；无菌注射器或真空采血管、EDTA溶液、抗凝剂、染色液等。A.1.2血液样品采集从疑似牛类动物耳尖或尾根部无菌采血约10ml,分别加入到含有抗凝剂EDTA溶液的抗凝管(用于血液涂片和核酸提取)和不含抗凝剂的采血管内(用于分离血清),-20℃保存待检。A.1.3溶液配制A.1.3.1姬姆萨染液：见附录DA.1.4操作方法A.1.4.1取采集的血液样品1滴，将血液置载玻片一端，另取一张边缘光滑的推片，让推片边缘和血液接触，使血液全部与推片边缘重合散开，推片和载玻片保持30°角，向前平稳均匀推动推片，载玻片上便留下一层薄血膜。A.1.4.2血涂片制成后，待血膜自然干燥后，在血膜表面滴加甲醇进行固定。A.1.4.3待甲醇在空气中干燥后，对血膜进行染色。将姬姆萨染液滴加在血膜上，使血膜被染液覆盖，染色30min。A.1.4.4染色30min后，用清水轻轻洗去载玻片表面的染液，待载玻片表面干燥后用铅笔或标签纸在血膜的另一侧进行编号。A.1.5显微镜下检查在干燥后的血膜表面滴加一滴松柏油，将血膜放在100倍的显微镜下进行观察，当镜下发现与附录E相同的典型血液型虫体即可判定为阳性。A.2组织型虫体鉴定方法A.2.1主要设备、材料和试剂参见A.1.1。A.2.2活体和死亡牛淋巴、组织样品从疑似牛类动物的肩前淋巴结或腹股沟淋巴结进行无菌穿刺，用干燥注射器抽取淋巴内容物；也可无菌采集淋巴结、脾脏等用于制作抹片样品。病死动物采样时，死亡时间不超过24h,采集脑、淋巴结、心、肝、和脾等脏器组织样品，样品在4℃左右条件下迅速送达实验室。A.2.3溶液配制7A.2.4操作方法A.2.4.1将载玻片轻轻触碰脏器切面或轻推淋巴液使淋巴液在玻片上形成一张薄的膜。A.2.4.2涂抹片制成后，待自然干燥后，在涂抹片表面滴加甲醇进行固定。A.2.4.3待甲醇在空气中干燥后，对涂抹片进行染色。将姬姆萨染液滴加在血膜上，使涂抹片被染液覆盖，染色30min。A.2.4.4染色30min后，用清水轻轻洗去载玻片表面的染液，待载玻片表面干燥后用铅笔或标签纸在涂抹片的另一侧进行编号。A.2.5显微镜下检查在干燥后的涂抹片表面滴加一滴松柏油，将血膜放在100倍的显微镜下进行观察，当镜下发现与附录E相同的典型“石榴体”即可判定为阳性。8(规范性附录)牛体重估测法及媒介蜱的采集法B.1体重估测公式=胸围²(m²)×体长(m)×90=体重(kg)(注明：胸围是从肩胛后角围绕胸围一周的长度；90指成年牛系数。)B.2布旗法(人工小时布旗法):用1m²大小的白绒布旗，在有媒介蜱地带进行定时拖蜱。操作时，手持旗杆伸向一侧，使旗子平铺于草丛上，以等速缓步向前行，每步行10m停下观察一次，将附于旗上的蜱捡入采集瓶内。每面旗子整个过程共进行1h。B.3媒介蜱种群组成(优势种群)(Dr)=(Ni/N)×100%(N为家畜体表寄生蜱总个体数，Ni为某种蜱的个体数);B.4兽皮法：用屠宰动物的新鲜皮(牛、羊等动物皮，粘膜面朝上，被毛面朝下)代替布旗，在有媒介蜱地带进行定时拖蜱。拖皮行走每隔50m～100m检查一次兽皮，收集其上黏贴的蜱虫。一般2月下旬开始发病，3月～4月达到高峰，5月逐渐减少，9月可二次流行。南北疆发病时间稍有差异，一般北疆较南疆晚；马泰勒虫病的流行季节较驽巴贝斯虫病稍晚，但两者常呈混合感染。9(规范性附录)从疑似牛类动物耳尖或尾根部无菌采血约10ml,分别加入到含有抗凝剂EDTA溶液的抗凝管(用于血液涂片和核酸提取)和不含抗凝剂的采血管内(用于分离血清),-20℃保存待检。提取核酸(详见附录C),-20℃保存待检。25μL反应体系50μL反应体系10×PCRbuffer(不含Mg²)-5324上游引物F112下游引物R112PCR反应参数：95℃预变性5min;94℃变性30s,退火时间为1min,72℃延伸1min,30个循环；72℃延伸10min,4℃设计阳性对照(牛环形泰勒虫DNA)、阴性对照(健康牛组织DNA)和空白对照(无菌双蒸水)。用1×TAE电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖(含100μl/L荧光染料),在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚好没过胶面，将5μLPCR产物和1μL6×Loadingbuffer混匀后加入样品孔内，电泳时以其PCR诊断用试剂详见附录D。检查到目的条带(电泳斑)作为诊断依据，详见图C.1、C.2。M:DNA分子质量标准；1～10:分别为10个血液样本的PCR扩增结果M:DNA分子质量标准；1-5:璃眼蜱扩增产物；6:阳性对照7:阴性对照(规范性附录)D.1病原学鉴定试剂溶液的配方加800mL生理盐水于55℃~60℃水浴中溶解，冷却后生理盐水定容至1L,121℃高压灭菌15置研钵中，加50ml甘油研磨调成均匀糊状后缓慢加入少量甲醇，研磨片刻将上层液体移入棕色试剂瓶内，再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上层染液，如此连续几次，共用甲醇1000ml。每天震荡棕色试剂瓶内液体(2～3)次，每次2min～3min,一周后使用效果更佳。磷酸二氢钾(无水)0.3g磷酸氢二钠(无水)0.23g置于烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，用磷酸盐缓冲液调PH至(6.5～6.8)后加水至1000ml。1)离心管内加入吸200μL全血、20μL蛋白酶K和200μLBufferAL,振荡混匀15s,56℃孵中，6000g离心1min,小心弃去滤液。3)将QIAampspincolumn与新的collectiontube组合，加500μLBufferAW1,6000g离心1min,4)将QIAampspincolumn与新的collectiontube组合，加500μLBufferAW2,18000g离心3min,小心弃去滤液。12000g离心1min去除残留溶液。5)将QIAampspincolumn与新的1.5mL离心管放置1min,6000g离心1min洗脱DNA。2)加入700μLTris-酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1),涡旋振荡混匀后放置10min,期间颠倒3)转移上清至新的1.5mL离心管中，加入0.6倍4℃预冷的三氯甲烷-异戊醇(24:1),混匀后于-20℃下静置5min,12000r/min离心5min。4)转移上清至新的1.5mL离心管中，加入2倍CTAB沉淀液，室温放置30min,12000r/min离5)弃上清液，加入350μLNaCl(1.2mol/L)溶解沉淀，65℃温育10min,加入350μL三氯甲烷-异戊醇(24:1),混匀，12000r/min离心5min。6)取上清液，加入0.6倍4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃放置30min,4℃下12000r/min离心5min,小心弃去上清。7)加入1mL经4℃预冷的75%乙醇，倾斜离心管，轻轻转动数次，4℃下12000r/min离心5min,小心弃去上清；然后用4℃预冷的75%乙醇按相同的方法重复洗一次。8)室温下或核酸真空干燥系统中干燥液体，干燥后加入50μL去离子水溶解核酸，-20℃保存。混匀后121℃高压灭菌15min,-20℃保存即可。D.2.2.2TE缓冲液加水定容至1L,121℃高压灭菌15min,4℃保存即可。EDTA(0.5mol/LpH8.0)