紫苏叶提取物在体外模拟消化过程中的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力研究

图可知，在测定浓度范围内，没食子酸浓度与吸光值呈线性相关关系，其R2值为0.9984。由REF_Ref3565508\h图2样品的总酚含量注：柱形图上不同字母表示差异显著，P<0.05，下同。Fig.2ThetotalphenolicscontentofsampleNotice:Differentlettersonthecolumnshowsignificantdifferences,P<0.05,thesamebelow.上述结果说明，模拟胃液消化会显著降低样品中总酚，模拟消化结束时的总酚含量是未作处理的46.8%。此外，减少的酚类物质可能是被胃蛋白酶在模拟胃液消化的第1h内分解，而胰蛋白酶对其不起作用。4.2模拟胃肠道消化对紫苏叶提取物中总黄酮含量影响图3总黄酮含量标准曲线Fig.3图3总黄酮含量标准曲线Fig.3Thestandardcarveoftotalflavonoidscontent图4样品的总黄酮含量Fig.4Thetotalflavonoidscontentofsample由图3可知，在测定浓度范围内，芦丁浓度与吸光值呈线性相关关系，其R2值为0.9976。由图4可知，紫苏各处理组的总黄酮含量差异较大，总黄酮含量的大小分别为空白组（652.641±30.691mgGAE/gDW）、胃液消化1h（161.042±24.064mgGAE/gDW）、胃液消化2h（305.61±20.652mgGAE/gDW）、胃肠液消化1h（286.046±37.844mgGAE/gDW）、胃肠液消化2h（280.893±11.757mgGAE/gDW）。紫苏提取物经过模拟胃液消化和肠液消化处理后，其第1h与第2h的总酚含量未发生显著变化（P>0.05），但前者显著低于后者（P<0.05），且均显著低于未做胃肠液处理的空白组（P<0.05）。上述结果说明，模拟胃液消化会使紫苏叶提取物中黄酮类物质含量降低。而且是在模拟胃液消化的第1h内快速下降。在模拟肠道消化处理的第1h内，黄酮类物质出现少量增加，相比模拟胃液消化2h处理后的总黄酮含量升高了87.2%，这说明胰蛋白酶可促进黄酮的释放，与从彦丽等ADDINNE.Ref.{52994842-1E9F-4B1A-B385-8354FD286215}[36]实验结果相一致。此外，总黄酮含量的测定结果与总酚含量的测定结果为极显著相关（P<0.01），相关系数为0.962。4.3抗氧化活性本次研究选取DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP三种反应体系，评估紫苏在模拟胃肠道消化过程中抗氧化能力ADDINNE.Ref.{4FD7CE47-8333-4671-8FDB-047CBC311956}[37,38]。4.3.1DPPH自由基清除能力DPPH自由基是一种以氮为中心的稳定自由基，常用于反映样品抗氧化能力强弱ADDINNE.Ref.{6794462B-0C32-4378-866D-CDA554E6A7F2}[37]。紫苏各不同处理组的DPPH自由基清除能力见图5和表1。图5紫苏样品的DPPH自由基清除能力Fig.5图5紫苏样品的DPPH自由基清除能力Fig.5TheDPPHradicalscavengingabilityofPerillasampleTable1TheIC50ofDPPHradicalofPerillasampleIC50（mg/mL）空白组0.520±0.146a胃液消化1h1.222±0.151c胃液消化2h0.801±0.183ab胃肠液消化1h0.949±0.166bc胃肠液消化2h0.766±0.036abVc0.090±0.008Trolox0.155±0.045注：Vc和Trolox作为阳性对照，下同。紫苏各处理组及粗提取物的DPPH自由基清除能力由半抑制浓度（Halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）表示，IC50越低，表示其清除能力越强。由图5可知，紫苏粗提取物经胃液消化后，其DPPH自由基清除能力显著下降，经肠液消化后无明显变化（P<0.05）。IC50的大小分别为空白组（0.52±0.146mg/mL）、胃液消化1h（1.222±0.151mg/mL）、胃液消化2h（0.801±0.183mg/mL）、胃肠液消化1h（0.949±0.166mg/mL）、胃肠液消化2h（0.766±0.036mg/mL）。由表1可知，各组样品均与阳性对照Vc（0.090±0.008mg/mL）和阳性对照Trolox（0.155±0.045mg/mL）有显著性差异（P<0.05）。上述结果表明，体外模拟消化过程会显著降低紫苏提取物的DPPH自由基清除能力，模拟消化结束后的IC50值升高到0.766±0.036mg/mL，相比空白组的IC50升高了47.3%。DPPH自由基清除能力是抗氧化活性的重要指标之一，化合物对其清除能力主要与化合物的羟基数量多少和结构有关，故推测DPPH自由基清除能力降低可能与酚类、黄酮类物质的降解有关。4.3.2ABTS自由基清除能力图6紫苏样品的ABTS自由基清除能力Fig图6紫苏样品的ABTS自由基清除能力Fig.6TheABTSradicalscavengingabilityofPerillasample表2紫苏样品对ABTS自由基的IC50Table2TheIC50ofABTSradicalofPerillasampleIC50（mg/mL）空白组1.364±0.042a胃液消化1h2.91±0.279c胃液消化2h2.335±0.195bc胃肠液消化1h2.719±0.448bc胃肠液消化2h2.132±0.277bVc0.016±0.001Trolox0.032±0.002紫苏各处理组的ABTS自由基清除能力与DPPH自由基清除能力的变化趋势一致。经胃液消化后，其ABTS自由基清除能力显著下降，经肠液消化后无明显变化（P<0.05）。由图6可知，IC50的大小分别为空白组（1.364±0.042mg/mL）、胃液消化1h（2.91±0.279mg/mL）、胃液消化2h（2.335±0.195mg/mL）、胃肠液消化1h（2.719±0.448mg/mL）、胃肠液消化2h（2.132±0.277mg/mL）。由表2可知，各处理组样品均与阳性对照Vc（0.016±0.001mg/mL）和阳性对照Trolox（0.032±0.002mg/mL）有显著性差异（P<0.05）。上述结果表明，体外模拟消化过程会显著降低紫苏提取物的ABTS自由基清除能力，模拟消化结束后的IC50值升高到2.132±0.277mg/mL，相比空白组的IC50升高了56.3%。各处理组抗氧化能力大小的变化趋势与DPPH基本相同，DPPH法和ABTS法的相关系数为0.947（P<0.05），具有显著相关性。4.3.3铁还原能力（FRAP）FRAP与DPPH法和ABTS法不同，不是针对一种自由基的清除活性，测定的是抗氧化物质氧化还原的潜力ADDINNE.Ref.{8382AB1E-C836-4A02-9BA5-811F5FAFA4CB}[39]。原理为样品中的还原性物质在酸性环境下，将TPTZ与Fe3+复合物（Fe3+—TPTZ）还原为Fe2+而呈明显的蓝色，在593nm处有最大吸收，测定反应体系在593nm处的吸光度值记为FRAP值，且以FeSO4为标准物质，FRAP值越大，则样品的FRAP越强ADDINNE.Ref.{6FFC0DBE-D860-43E5-B94B-CC83CE71DA95}[34]。FRAP标准曲线见图7。紫苏各不同处理组的FRAP见图8。图8样品与对照物的FRAPFig.8TheFRAPofsampleorcontrol图7FRAP标准曲线Fig.7ThestandardcarveofFRAP在测定浓度范围内，FeSO4浓度与吸光值呈线性相关关系，其R2值为0.9984。由图8可知，紫苏各处理组的FRAP经胃液消化后，其FRAP显著下降，经肠液消化后无明显变化（P>0.05）。各组FRAP大小分别为空白组（247.899±9.596mgFeSO4/gDW）、胃液消化1h（102.936±2.168mgFeSO4/gDW）、胃液消化2h（119.502±12.672mgFeSO4/gDW）、胃肠液消化1h（107.568±6.68mgFeSO4/gDW）、胃肠液消化2h（113.159±5.002mgFeSO4/gDW）。阳性对照的FRAP大小分别为Vc（2076.666±28.151mgFeSO4/gDW）、槲皮素（1243.333±33.664图8样品与对照物的FRAPFig.8TheFRAPofsampleorcontrol图7FRAP标准曲线Fig.7ThestandardcarveofFRAP上述结果表明，体外模拟消化过程会显著降低紫苏提取物的铁还原能力，模拟消化结束后的FRAP值降至113.159±5.002mgFeSO4/gDW，相比空白组下降了54.4%。此外，测定样品时FRAP法与DPPH法和ABTS法测得的自由基清除能力的相关系数为0.775和0.898，均具有较好的相关关系。4.4α-葡萄糖苷酶抑制能力糖尿病是一种常伴有并发症的慢性代谢紊乱性疾病，目前已成为危害人类健康的全球第三大疾病。糖尿病有4大类型，其中Ⅱ型糖尿病占90%以上。α-葡萄糖苷酶抑制剂是对Ⅱ型糖尿病有确切疗效的口服降糖药，通过竞争性抑制小肠上α-葡萄糖苷酶的活性，从而阻碍多糖的分解和延缓葡萄糖的吸收，使餐后血糖水平降低ADDINNE.Ref.{47F5DC7B-838F-4A75-9EA8-2B92DEFD434E}[40]。因此，我们通过测定样品抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力来评价紫苏的降血糖和抗糖尿病的潜力，结果如图9和表3。图9紫苏样品的α-葡萄糖苷酶抑制能力Fig.9图9紫苏样品的α-葡萄糖苷酶抑制能力Fig.9Theα-glucosidaserestrainingabilityofPerillasampleTable3TheIC50ofα-glucosidaseofPerillasampleIC50（mg/mL）空白组0.113±0.005a胃液消化1h0.296±0.012b胃液消化2h0.344±0.011b胃肠液消化1h0.466±0.079c胃肠液消化2h0.525±0.067c阿卡波糖1.926±0.086注：阿卡波糖作为阳性对照。本论文选择以4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-MUG）代替常用的p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）作为底物，4-MUG法较pNPG法除底物稳定时间延长2~3倍外，还可测定溶解性弱、易浑浊的样品，结果灵敏、重现性好。由图9可知，紫苏经模拟胃肠道消化处理后，其α-葡萄糖苷酶抑制能力显著下降，各处理组与未进行胃肠液处理的空白组均存在显著性差异（P<0.05）。其中其胃液消化1h和2h之间、胃肠液消化1h和2h之间差异均不显著（P>0.05），说明其抑制能力下降均发生在各阶段消化前期。由表3可知，样品的IC50均显著低于阳性对照阿卡波糖（1.926±0.086mg/mL）。上述结果表明，紫苏的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力在模拟胃肠道消化过程中不断减弱，消化结束时，其IC50值从0.113±0.005mg/mL显著上升至0.525±0.067mg/mL。原因可能是紫苏叶提取物在胃肠道消化时，其总酚、总黄酮等活性物质不断减少，导致α-葡萄糖苷酶活性抑制能力随之变弱。4.5相关性分析表4样品的抗氧化试验结果与总酚含量、总黄酮含量、α-葡萄糖苷酶抑制能力的IC50值的相关性分析Table4ThecorrelationalanalysesofantioxidationexperimentandtotalphenolicscontentandtotalflavonoidscontentandtheIC50valuesofα-glucosidaseinhibitionPerillatotalphenolicstotalflavonoidsDPPHABTSFRAPα-glucosidasetotalphenolics10.962**0.7750.894*0.998**0.779totalflavonoids10.7650.8610.942*0.613DPPH10.947*0.7750.331ABTS10.898*0.536FRAP10.806α-glucosidase1注：**为极显著（P<0.01），*为显著（P<0.05）利用SPSS22.0软件对抗氧化试验结果和总酚含量、总黄酮含量、α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的IC50值进行相关性分析，结果见表4。由表4可知：总酚与总黄酮含量的相关系数为0.962，表示两者高度相关。DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、FRAP三种抗氧化试验结果间的相关系数范围为0.775-0.947，且显著性均小于0.05，表明三种抗氧化试验结果间具有良好的相关关系，可共同作为评价样品抗氧化能力的有效指标。三种抗氧化试验结果与α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的IC50值间呈正相关，其相关系数范围为0.331-0.806，且显著性均小于0.05。总酚与总黄酮含量与三种抗氧化试验结果及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力呈正相关，其相关系数范围为0.613-0.998，且显著性均小于0.05，说明紫苏叶提取物中的酚类与黄酮类物质可能是其产生抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质。5结论本论文首次测定了紫苏叶提取物在体外模拟胃肠道消化过程中的总酚、总黄酮含量，并首次分析了其在该过程中的抗氧化能力以及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力。总酚、总黄酮含量测定结果表明：紫苏叶提取物经体外模拟胃肠道消化后，总酚和总黄酮含量都出现显著下降的现象，且减少的含量都集中出现在模拟胃液消化的第1h内，可能与胃蛋白酶的降解作用，以及体系酸碱度、无机盐等其他因素的影响，其作用机理有待进一步探究。体外抗氧化试验结果表明：紫苏叶提取物经体外模拟胃肠道消化后，其抗氧化活性均出现显著减弱，模拟消化结束后，DPPH自由基清除能力的IC50值升高到0.766±0.036mg/mL，ABTS自由基清除能力的IC50值升高到2.132±0.277mg/mL，相比空白组的IC50分别升高了47.3%、56.3%，FRAP值降至113.159±5.002mgFeSO4/gDW，相比空白组的IC50下降了54.4%。三种抗氧化试验结果间的相关系数范围为0.775-0.947（P<0.05），即三个反应体系具有良好的相关关系，可共同评价样品抗氧化能力的有效指标。采用改良的荧光光谱法（4-MUG法）测定紫苏模拟胃肠道消化过程中的α-葡萄糖苷酶抑制能力，结果显示其α-葡萄糖苷酶抑制能力不断减弱，其IC50值升高到0.525±0.067mg/mL。说明紫苏叶活性物质在胃肠道消化时发生降解，影响了其α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。相关性分析表明，紫苏叶提取物在体外模拟胃肠道消化过程中的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力呈一定相关性，说明紫苏叶提取物中的酚类与黄酮类物质可能是其产生抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质。参考文献ADDINNE.Bib[1]朱双全.紫苏化学成分及药理学研究进展概要[J].生物化工,2018,4(02):148-149.[2] 刘月秀,张卫明.紫苏属植物的分类及资源分布[J].中国野生植物资源,1998(03):3-6.[3] 殷朝洲.紫苏的开发利用[J].上海农业科技,1989(02):17-19.[4] 郭雪红.中药紫苏药理及临床研究新进展[J].天津药学,2016,28(02):70-73.[5] 谭美莲,严明芳,汪磊,等.国内外紫苏研究进展概述[J].中国油料作物学报,2012,34(02):225-231.[6] 张洪,黄建韶,赵东海.紫苏营养成分的研究[J].食品与机械,2006(02):41-43.[7] 刘浏.紫苏叶的研究进展[J].中国医学创新,2012,9(06):162-164.[8] 沈奇,商志伟,杨森,等.紫苏属植物的研究进展及发展潜力[J].贵州农业科学,2017,45(09):93-102.[9] 刘宁,仇农学,田玉霞.超声辅助提取紫苏叶黄酮及其清除自由基作用研究[J].西北林学院学报,2008(01):158-161.[10] 郭晓青,陈晓靓,杨春梅,等.紫苏叶活性成分及抗氧化性研究[J].食品与机械,2014,30(04):179-181.[11] 段江莲,李琴,李为琴,等.紫苏甲醇提取物的体外抗氧化及抑菌活性研究[J].实验室科学,2014,17(02):8-11.[12] 邢颖,雷宏杰,岳珍珍,等.超声波纤维素酶法提取紫苏叶活性物质及其抗氧化活性[J].食品科学,2016,37(10):111-115.[13] AdomKK,SorrellsME,LiuRH.Phytochemicalprofilesandantioxidantactivityofwheatvarieties[J].JournalofAgriculturalAndFoodChemistry,2003,51(26):7825-7834.[14] PengYY,YeJN,KongJL.DeterminationofphenoliccompoundsinPerillafrutescensL.bycapillaryelectrophoresiswithelectrochemicaldetection[J].JOURNALOFAGRICULTURALANDFOODCHEMISTRY,2005,53(21):8141-8147.[15] VersantvoortCH,OomenAG,VanDKE,etal.Applicabilityofaninvitrodigestionmodelinassessingthebioaccessibilityofmycotoxinsfromfood.[J].Food&ChemicalToxicology,2005,43(1):31-40.[16] 杨赟,刘敏,李建,等.药用植物中乙酰胆碱酯酶抑制活性和抗氧化活性的筛选[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(02):213-218.[17] FG,BrownleeM.OxidativeStressandDiabeticComplications[J].CirculationResearch,2010,107(9):1058-1070.[18] SchäferA,HöggerP.OligomericprocyanidinsofFrenchmaritimepinebarkextract(Pycnogenol®;)effectivelyinhibitα-glucosidase[J].DiabetesResClinPract,2007,77(1):41-46.[19] 范莉,王业玲,唐丽.天然来源α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法的研究进展[J].天然产物研究与开发,2016,28(02):313-321.[20] KumarS,NarwalS,KumarV,etal.α-glucosidaseinhibitorsfromplants:Anaturalapproachtotreatdiabetes[J].PharmacognosyReviews,5,9(2011-04-6),2011,5(9):19-29.[21] PCS,CE,Acarbose.Apreliminaryreviewofitspharmacodynamicandpharmacokineticproperties,andtherapeuticpotential.[J].Drugs,1988,35(3):214-243.[22] FujisawaT,IkegamiH,InoueK,etal.Effectoftwoalpha-glucosidaseinhibitors,vogliboseandacarbose,onpostprandialhyperglycemiacorrelateswithsubjectiveabdominalsymptoms.[J].Metabolism-clinical&Experimental,2005,54(3):387-390.[23] 张文婷,方青枝.α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展[J].福建医药杂志,2009,31(02):85-87.[24] 李项辉.紫苏叶提取物的降血糖活性研究[D].杭州:浙江大学,2017.[25] 郑悦.黑果腺肋花楸花色苷分离、体外抗氧化及体外消化模拟研究[D].东北林业大学,2017.[26] RenatoI,JessicaB,PatrickR.CommentonInvitrogastrointestinaldigestionstudyofbroccoliinflorescencephenoliccompounds,glucosinolates,andvitaminC[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2004,52(24):7432-7433.[27] KannerJ,LapidotT.Thestomachasabioreactor:Dietarylipidperoxidationinthegastricfluidandtheeffectsofplant-derivedantioxidants[J].FreeRadicalBiologyandMedicine,2001,31(11):1388-1395.[28] 许芹永.药食两用中药抑制α-葡萄糖苷酶活性及作用机制研究[D].大连:大连工业大学,2012.[29] 李杰,董丽红,苏东晓,等.体外消化对银杏果酚类物质含量及其抗氧化活性的影响[J].食品科技,2018,43(06):98-104.[30] 董丽红,李杰,苏东晓,等.体外消化对银杏果酚类物质含量及其抗氧化活性的影响[J].食品科技,2018,43(06):98-104.[31] 尹冬冬.有机化学（第二版上册）[M].北京:高等教育出版社,2010.[32] 陈树俊,石玥,李乐,等.藜麦芽发酵浓浆模拟体外消化及抗氧化活性研究[J].营养学报,2018,40(01):71-78.[33] 王月华,李斌,孟宪军,等.模拟体外消化对蓝靛果提取物花色苷组成及抗氧化能力的影响[J].食品科学,2016,37(19):100-105.[34] BenzieIFF,StrainJJ.TheFerricReducingAbilityofPlasma(FRAP)asaMeasureof“AntioxidantPower”:TheFRAPAssay[J].AnalyticalBiochemistry,1996