DB22∕T 3353-2022 猪δ冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增(RPA)法

ICS11.220

CCSB41

DB22

吉林省地方标准

DB22/T3353—2022

猪δ冠状病毒检测重组酶聚合酶扩增

（RPA）法

Recombinasepolymeraseamplificationmethodforthedetectionofporcine

deltacoronavirus

2022-01-28发布2022-02-28实施

吉林省市场监督管理厅发布

DB22/T3353—2022

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本文件起草单位：吉林农业大学。

本文件主要起草人：王开、裴志花、胡桂学、孟凡茹、郭衍冰、邵洪泽、王海军、张德文、赵玉龙。

I

DB22/T3353—2022

猪δ冠状病毒检测重组酶聚合酶扩增(RPA)法

1范围

本文件规定了猪δ冠状病毒重组酶聚合酶扩增检测方法的原理、试剂和材料、仪器设备、生物安全、

样品、试验步骤和结果判定。

本文件适用于猪δ冠状病毒的实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

反转录重组酶聚合酶扩增reversetranscription-recombinasepolymeraseamplification

一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增技术。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

cDNA互补脱氧核糖核酸（ComplementaryDeoxyribonucleicAcid）

DEPC焦碳酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate）

DNA脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

MgAc醋酸镁（MagnesiumAcetate）

PBS磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolution）

RT-RPA反转录重组酶聚合酶扩增（ReverseTranscription-recombinasePolymerase

Amplification）

5原理

RPA开始反应后，引物与重组酶组合形成复合物，在模板中寻找同源双链DNA进行定位，完成定

位后发生链交换反应，形成D-环状结构，使DNA结合蛋白与单链DNA链绑定。随后DNA聚合酶识别复

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DB22/T3353—2022

合物中重组酶解离引物后暴露的3′端，进行片段扩增，形成两条新的双链DNA，如此循环，从而完成

对目的片段的扩增。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。

6试剂和材料

6.1试剂

除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。

6.1.1RPA扩增所用的引物序列见表1。

表1引物序列

引物序列（5′→3′）片段大小

PDCoV-RPA-FATGTGCCTGGTGTTCAGGAGATGCTTTTCGCTGGC

185bp

PDCoV-RPA-RAGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCATAGGTCTGGTTA

6.1.2磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol/L，pH7.4）。

6.1.3动物组织RNA提取试剂盒。

6.1.4反转录试剂盒。

6.1.5重组酶聚合酶扩增试剂盒TwistAmpBasicRTKit。

6.1.6DEPC水。

6.1.750×TAEBuffer。

6.1.8琼脂糖。

6.1.9MarkerDL2000bp。

6.1.10阳性对照为人工合成阳性质粒，制备方法见附录A。

6.1.11阴性对照，DEPC水。

6.2材料

6.2.1无菌棉签。

6.2.2钢丝网（300目）。

7仪器设备

7.1电子天平，感量0.01g。

7.2台式低温高速离心机（4℃，12000r/min）。

7.3移液器（0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL、200μL～1000μL）。

7.4恒温水浴锅。

7.5高压蒸汽灭菌器。

7.6冰箱，-20℃。

7.7电泳仪。

7.8垂直板电泳槽。

7.9凝胶成像仪

8生物安全

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8.1样品采集、样品处理应按NY/T541的规定执行。

8.2实验室操作应按GB19489的规定执行。

9样品

9.1肠组织

9.1.1采集肠管组织样品不少于5g（7.1）。做好标识，置于密闭容器内，冷冻或4℃冷藏保存和

运输。

9.1.2加入样品10%体积的PBS（6.1.2）研磨，过300目钢丝网（6.2.2），收集滤液，12000r/min

离心10min（7.2），取上清液待检。

9.1.3如不能立即检测，应保存于-20℃冰箱（7.6）。

9.2粪便

9.2.1使用无菌棉签（6.2.1,7.5），采集肛门粪便不少于5g，样品采集后冷冻或4℃冷藏保存和

运输。

9.2.2加入样品10%体积的PBS研磨，过300目钢丝网（6.2.2），收集滤液，12000r/min离心10min，

取上清液待检。

9.2.3如不能立即检测，应保存于-20℃冰箱。

10试验步骤

10.1RNA提取

按照商品化试剂盒（6.1.3）说明书要求提取相应样品的RNA。或采用等效方法提取RNA。

10.2cDNA合成

按照商品化试剂盒（6.1.4）说明书将10.1提取的样品的RNA反转录成cDNA作为检测模板。

10.3扩增反应体系

猪δ冠状病毒RPA扩增反应（6.1.5）体系见表2。同时设定阴性、阳性样品对照。

表2猪δ冠状病毒RPA扩增反应体系

试剂剂量

Rehydrationbuffer29.5μL

cDNA模板2.0μL

PDCoV-RPA-F2.4μL

PDCoV-RPA-R2.4μL

DEPC水（6.1.6）11.2μL

MgAc2.5μL

总体积50.0μL

10.4反应程序

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10.4.1反应温度

反应体系置于42℃水浴锅中（7.4）。

10.4.2反应时间

反应时间为25min。

10.4.3电泳观察

配置电泳液（6.1.7）和1%琼脂糖（6.1.8）凝胶，将阳性（6.1.10）、阴性（6.1.11）和检测样品

的扩增产物及Marker（6.1.9）分别加入凝胶孔（7.3），5V/min电泳30min（7.7,7.8），再取出

凝胶通过凝胶成像仪观察结果（7.9）。

11结果判定

11.1试验成立条件

阳性对照出现目的185bp扩增条带参见附录B，阴性对照无目的扩增条带，试验成立。如阳性对

照、阴性对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效。

11.2试验结果判定

11.2.1阳性结果

被检样品出现185bp条带，判为核酸阳性。

11.2.2阴性结果

被检样品未出现185bp条带时，判为核酸阴性。

A

4

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BA

附录A

（规范性）

猪δ冠状病毒重组质粒

A.1重组质粒

根据PDCoVNH株（GenBank：KU981062）的N基因序列，获得阳性克隆的基因序列。

A.2PDCoV阳性质粒的基因序列

Atggctgcaccagtagtccctactactgacgcgtcttggtttcaggtgctcaaagctcaaaataaaaaggctactcatcctcagtttcgtggcaatggagttcc

gcttaactccgccatcaaacccgttgaaaaccatggctactggctgcgttacaccagacaaaagccaggtggtactccgattcctccatcctatgccttttattatac

tggcacaggtcccagaggaaatcttaagtatggtgaactccctcctaatgacaccccagcaaccactcgtgttacttgggttaagggttcgggagctgacacttct

attaagcctcatgttgccaaacgcaaccccaacaatcctaaacatcagctgctacctctccgattcccaaccggagatggcccagctcaaggtttcagagttgacc

ccttcaacgctagaggaagacctcaggagcgtggaagtggcccaagatctcaatctgttaactccagaggcacaggcaatcagcccaggaaacgcgaccaat

ctgcacccgctgcggtacgtcgtaagacccaacatcaagctcccaagcggactttacccaagggtaaaaccatttctcaggtatttggcaaccggtctcgcactg

gtgccaatgtcggctctgcagacactgagaagacgggtatggctgatcctcgcatcatggctctagccagacatgtgcctggtgttcaggagatgcttttcgctgg

ccaccttgagagcaactttcaggcgggggcaattacccttaccttctcttactcaatcacagtcaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcgctca

atacggtcgttaaccagacctatgagccacccaccaaaccaactaaggacaagaagcctgacaaacaagaccagtctgctaaacccaaacagcagaagaaac

ctaaaaaggtaactctgccagcagacaaacaggattgggagtgggatgatgcttttgagataaagcaggaatcagcagcgtag

A.3连接

PDCoVN基因与pET-28a连接（生工合成）。

A.4转化

将感受态细胞E.coliDH5α置于冰上，待其融化；在超净工作台中将加入合成质粒1μL〜3μL加

入100μL感受态细胞，混匀，冰浴30min；42℃热激1min〜2min，冰浴1min〜2min；加900μL

LB空培养基，摇菌180rpm，37℃，1h；取摇后培养基200μL，涂布于含抗生素的固体LB培养基，

完全吸收后，37℃倒置培养12h〜16h。

A.5菌落PCR鉴定

PCR反应体系：上/下游引物各1μL、ddH2O8μL、预混Taq酶10μL。

PCR反应程序：95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s，72℃，1min，72℃，10min，35个

循环。

灭菌牙签取单个菌落与PCR体系中搅一下在新板画线，每板挑10个菌，新划板37℃倒置培养

12h〜16h。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，统计含目标条带菌落号备用。

A.6质粒提取

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用10μL枪头挑取PCR检测有目的条带菌落，打入5mL含抗生素液体LB培养基的试管中，37

℃，180rpm,12h〜16h；取3mL〜5mL菌液，室温离心1000g，1min，弃上清。提取步骤参考

质粒提取试剂盒；提取质粒-20℃保