基于代谢组学的大蒜素对补脾益肠丸疗效影响机制的研究

基于代谢组学的大蒜素对补脾益肠丸疗效影响机制的研究摘要目的：探究大蒜素对补脾益肠丸治疗慢性溃疡性结肠炎疗效影响及其机制。方法：采用自由饮用DSS水的方法建立溃疡性结肠炎小鼠模型，模拟患者服药期间饮食大蒜素作为辛辣成分。采用DAI评分、HE染色、ELISA评价大蒜素对补脾益肠丸药效的影响。运用非靶向代谢组学寻找潜在的标志物及差异代谢物，进而揭示大蒜素影响补脾益肠丸疗效的机制。结果：本研究通过DAI评分、HE染色及ELISA检测等药效学评价方法证实大蒜素降低了补脾益肠丸疗效。大蒜素通过调节胆酸、五味子丙素等代谢物以及调控牛磺酸代谢等多条代谢通路，干扰补脾益肠丸的治疗作用。结论：大蒜素与补脾益肠丸联用会削弱补脾益肠丸对慢性溃疡性结肠炎的治疗效果。关键词：大蒜素补脾益肠丸结肠炎AbstractObjective:InvestigatingtheImpactofAllicinontheTherapeuticEfficacyofBupiYichangPillsinTreatingChronicUlcerativeColitisandItsUnderlyingMechanisms.Methods:AmousemodelofulcerativecolitiswasestablishedusingthefreedrinkingDSSwatermethodtosimulatepatientsconsumingallicinasaspicycomponentduringmedication.DAIscoring,HEstaining,andELISAwereemployedtoevaluatetheeffectsofallicinontheefficacyofBupiYichangPills.Untargetedmetabolomicswasutilizedtoidentifypotentialbiomarkersanddifferentialmetabolites,therebyelucidatingthemechanismbywhichallicininfluencesthetherapeuticeffectsofBupiYichangPills.Results:ThisstudyconfirmedthroughpharmacodynamicevaluationmethodssuchasDAIscore,HEstaining,andELISAassaysthatallicinreducedthetherapeuticefficacyofBushenYichangPills.AllicininterferedwiththetherapeuticeffectsofBushenYichangPillsbyregulatingmetabolitessuchasbileacidsandschisandrinC,aswellasmodulatingmultiplemetabolicpathwaysincludingtaurinemetabolism.Conclusion:ThecombineduseofallicinandBupiYichangWanmayweakenthetherapeuticeffectofBupiYichangWanonchroniculcerativecolitis.Keywords：AllicinSpleen-InvigoratingandIntestine-NourishingPillsColitis

目录TOC\o"1-3"\h\u5409摘要 2109191引言 5302922实验部分 68352.1实验动物 637122.2实验材料 684172.3实验方法 821812.4统计学方法 12235973实验结果 1217213.1药效学评价实验结果 12120053.2代谢组学实验结果 16317384小结与讨论 25181364.1药效学评价 25187654.2差异代谢物和通路 26180325.结论 2630837参考文献 27333致谢 291引言慢性溃疡性结肠炎（CUC）是一种慢性、非特异性炎症性肠病，主要影响直肠和结肠的黏膜。其常见症状包括腹泻、黏液脓血便、腹痛等，严重时可引发体重减轻、乏力及肠穿孔等并发症REF_Ref22278\r\h[1]。长期的病程导致患者生活质量下降，且常伴有焦虑、抑郁等心理问题。CUC的发生率全球范围内不断上升，尤其在中国经济发达地区更为显著，已成为不可忽视的公共健康问题REF_Ref6954\r\h[18]。目前，西医主要通过药物干预治疗CUC，如5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等，但这些治疗方法存在一定局限性，尤其是药物的依赖性和昂贵的治疗费用REF_Ref2507\r\h[2]。在中医药治疗方面，中医认为CUC多由脾胃虚弱、湿热内生、情志不调所致，认为其病因可归属为“泄泻”或“肠风”等。补脾益肠丸作为经典中药复方，具有健脾益气、固肠止泻的功效，临床上常用于治疗脾虚型CUC，且研究表明其具有较高的安全性和依从性REF_Ref2657\r\h[3]。然而，由于中医药的成分复杂且其“整体调理”的特性，传统研究方法难以全面阐释其作用机制。现代代谢组学的应用为中药研究提供了新的方向。通过代谢组学技术，可以分析体内的小分子代谢物，揭示疾病与药物干预的动态变化，尤其适用于探讨多成分、多靶点的中药复方作用机制。此外，饮食因素，尤其是辛辣成分，也越来越受到关注。大蒜素作为一种具有抗菌、抗炎、抗氧化等多重生物活性的成分，已经显示出对肠道健康的积极影响REF_Ref2791\r\h[4]REF_Ref2797\r\h[5]。但关于大蒜素与中药复方联合使用的研究仍较为缺乏。因此，本研究拟以大蒜素为代表的辛辣类活性成分为切入点，构建CUC动物模型，分别给予补脾益肠丸单独及联合大蒜素干预，通过采集血液和肠道组织样本，结合代谢组学分析、炎症因子检测及病理观察，从分子层面探索其对肠道微环境的影响机制,旨在揭示饮食活性因子与中药复方协同干预CUC的潜在机制，为中西医结合治疗提供新思路，同时也为中药复方的现代研究提供可量化、可解释的科学依据。2实验部分2.1实验动物70只雄性C57BL/6小鼠，体质量18-22g，特定病原体（SPF级），均购自辽宁长生生物技术股份有限公司（中国辽宁;动物许可证号：SCXK[辽]2020-0001）。所有实验动物程序均按照《实验动物指南及使用指南》进行，并经长春中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准编号2024714）。2.2实验材料2.2.1实验试剂表SEQ表\*ARABIC1实验试剂试剂厂家无水乙醇国药集团化学试剂有限公司二甲苯国药集团化学试剂有限公司苏木素-伊红染液武汉百仟度生物科技有限公司盐酸国药集团化学试剂有限公司氨水国药集团化学试剂有限公司中性树胶国药集团化学试剂有限公司葡聚糖硫酸钠(DSS)MPBiomedicalsInc.CA.USA大蒜素标品成都辰业生物科技有限公司补脾益肠丸白云山药业柳氮磺吡啶上海信谊天平药业有限公司4%多聚甲醛固定液BiosharpIL-1β试剂盒上海酶免生物科技有限公司IL-10试剂盒上海酶免生物科技有限公司甲醇CNWTechnologies乙腈CNWTechnologies甲酸SIGMAL-2-氯苯丙氨酸上海恒柏生物科技有限公司2.2.2实验仪器表SEQ表\*ARABIC2实验仪器名称厂家型号脱水机武汉俊杰电子有限公司Vanquish包埋机武汉俊杰电子有限公司QExactiveFocus病理切片机上海徕卡仪器有限公司HeraeusFresco17冻台武汉俊杰电子有限公司BSA124S-CW组织摊片机浙江省金华市科迪仪器设备有限公司JXFSTPRP-24烤箱上海慧泰仪器制造有限公司明澈D24UV载玻片及盖玻片江苏世泰实验器材有限公司YM-080S正置光学显微镜日本尼康ACQUITYUPLCBEHC181.7μm2.1*100mm成像系统日本尼康NikonDS-U3超高效液相ThermoFisherScientificWatersUPLCAcquityI-ClassPLUS高分辨质谱ThermoFisherScientificWatersUPLCXevoG2-XSQTOF离心机ThermoFisherScientificAcquityUPLCHSST31.8um2.1*100mm天平SartoriusJJ200研磨仪上海净信科技有限公司SnergyHTX纯水仪MerckMillipore——超声仪深圳市方奥微电子有限公司Vanquish色谱柱WatersQExactiveFocus成像系统日本尼康HeraeusFresco17超高效液相WatersBSA124S-CW高分辨质谱WatersJXFSTPRP-24色谱柱Waters明澈D24UV电子天平常熟市双节测试仪器厂YM-080S酶标仪GenecompanylimitedACQUITYUPLCBEHC181.7μm2.1*100mm低温离心机ThermoFisherNikonDS-U32.3实验方法2.3.1小鼠慢性溃疡性结肠炎模型的建立根据先前研究，采用自由饮用2%葡聚糖硫酸钠（DSS）高压灭菌饮用水建立UC模型。具体而言，C57BL/6小鼠适应性饲养7天后，耳标标记所有对照组和实验组小鼠，实验组第2周自由饮用2%DSS高压灭菌水（在笼子里的水瓶里装满大约100ml，每笼4-5只老鼠，持续2天，2天后丢弃剩余的水，并补充新制备的含2%DSS的水），第3周自由饮用不含DSS的高压灭菌水，第4周再换成2%DSS高压灭菌水，第5周自由饮用不含DSS的高压灭菌水，第6周再换成2%DSS高压灭菌水。实验分组和给药方案：将105只SPF级C57BL/6小鼠随机分为空白对照（C）组、模型（M）组、补脾益肠丸-大蒜素低剂量（L）组、大蒜素低剂量（AL）组、补脾益肠丸-大蒜素高剂量（H）组、柳氮磺吡啶（Y）组、补脾益肠丸-模型（D）组每组15只。其中C组给予正常饮水，其余各组按照上述方法建立UC小鼠模型。阳性药（Y）组灌胃柳氮磺吡啶（0.6g/kg）。AL、L和H组分别灌胃大蒜素（20mg/kg、20mg/kg、80mg/kg），同时给予补脾益肠丸（2.73g/kg）。而C和M组灌胃等体积的高压灭菌水。在第4周开始，所有的药物开始以每天的频率干预小鼠。补脾益肠丸的剂量是根据成人的临床剂量折算成小鼠灌胃剂量。2.3.2实验样本采集与处理1.实验动物安乐死与样本采集​实验周期结束时，采用七氟烷吸入麻醉结合颈椎脱臼法对小鼠实施安乐死，全过程遵循《实验动物管理条例》伦理要求。通过眼球摘除法采集全血样本，室温静置30分钟后以3000×g离心15分钟，分离血清分装冻存于-80℃超低温冰箱。2.结肠组织病理处理​解剖后完整分离结肠段，测量长度并记录病理特征（充血、水肿等）。选取典型病变组织经中性甲醛固定24小时，完成梯度脱水及石蜡包埋；其余组织液氮速冻后-80℃保存，用于分子检测。2.3.3大蒜素对补脾益肠丸疗效影响的药效学评价DAI评分在实验周期内，每日定时对各组小鼠进行系统性行为学观察，记录精神状态、自主活动能力和探索行为等特征。结合粪便性状与潜血试纸检测，评估其消化道功能。依据表1所示标准，通过加权积分法计算疾病活动指数（DAI），评分包括体重变化、粪便性状和消化道出血三项指标，最终得分为三者的算术平均值，用于客观反映实验性结肠炎的病程变化，如REF_Ref6125\h表3。表SEQ表\*ARABIC3各组小鼠DAI评分001234*正常：成形且质地均匀的大便；松散：呈糊状或半成形，且不附着于肛门；稀便：质地稀薄、水样，易附着于肛门。结肠长度将获取的完整结肠标本（自回肠末端至肛门）展平置于白板纸上，使用直尺沿肠管精确测量其伸展长度，结果以厘米为单位记录。组织石蜡包埋切片与HE染色实验步骤本研究采用瑞士卷制片技术结合苏木精-伊红（HE）染色分析小鼠结肠全层组织结构，具体流程如下：首先将新鲜结肠沿纵轴剪开后，用预冷PBS轻柔冲洗肠内容物，随后将黏膜面朝上平铺于滤纸，借助眼科镊卷曲成瑞士卷形态并用细线固定，立即浸入4%多聚甲醛溶液中4℃固定12-24小时以稳定细胞结构。固定后组织经梯度酒精脱水（50%乙醇1h→70%乙醇1h→85%乙醇1h→90%乙醇1h→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1h），再通过醇-苯过渡液（5-10min）及二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各1.5h）置换乙醇实现透明化，随后置于56-60℃熔融石蜡中分三次浸渍（每次1h）确保二甲苯完全置换，定向包埋后速冻定型并修整蜡块。切片阶段采用轮转式切片机切取4-5μm连续蜡带，经40℃水浴展平后贴附防脱载玻片，60℃烘烤1小时增强黏附力。HE染色前依次经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡（各10min）及梯度乙醇复水（100%→50%），核染色采用Harris苏木精溶液（5-15min），经1%盐酸酒精分化5-10秒及0.5%氨水返蓝30秒，胞质染色使用伊红（1-3min）后梯度脱水、二甲苯透明化。最终以中性树胶封片，避免气泡产生，显微镜下可清晰观察黏膜层隐窝结构、黏膜下层血管及肌层平滑肌细胞的病理特征。大鼠血清相关生化指标的测定采用双抗体夹心ELISA法检测小鼠血清中IL-10和IL-1β水平。具体实验流程如下：将稀释至1:5的血清样本加入预包被特异性抗体的96孔酶标板中，置于37℃恒温摇床分两阶段温育（首次60分钟，二次30分钟），摇速180rpm以促进抗原-抗体充分结合，温育全程维持湿度＞60%避免液体蒸发。标准品孔采用含0.1%BSA的PBS缓冲液配制4000-62.5pg/mL浓度梯度，样本孔按"40μL稀释液+10μL血清"比例精准加样控制终体积。使用含0.05%Tween-20的预冷PBS缓冲液，通过全自动洗板机完成5次循环洗涤（300μL/孔，每次浸润30秒），末次洗涤后倒置拍板去除残留液滴。分别加入HRP标记检测抗体（IL-10采用生物素-链霉亲和素信号放大系统，IL-1β为直接标记法）进行二次温育。避光条件下每孔加入TMB显色剂A/B液（1:1混合）反应15分钟，期间每5分钟监测显色均匀性，及时终止边缘效应显影。采用2M硫酸溶液终止反应后，立即使用酶标仪于450nm波长测定吸光度（OD值）。依据标准品浓度梯度建立四参数拟合曲线方程，计算目标因子浓度，实验全程通过空白孔本底扣除、标准品双复孔测定及显色阶段实时质控确保数据可靠性。2.3.4非靶向代谢组学机制研究2.3.4样本处理与LC-MS分析样本处理取100 μL血清样本，加入500 μL含20 mg/L内标的甲醇-乙腈（1:1）提取液，混合后涡旋30秒。样品经冰水浴超声10分钟后，在-20 °C静置1小时，再于4 °C下以12000 rpm离心15分钟。收集500 μL上清液，真空干燥后加入160 μL乙腈-水（1:1）复溶，重复涡旋与超声步骤，并再次离心，取120 μL上清转入进样瓶。所有样本各取10 μL混合制备质量控制（QC）样本。LC-MS分析液相色谱-质谱分析中，正负离子模式使用相同流动相体系（A：0.1%甲酸水，B：0.1%甲酸乙腈），色谱柱温度50 °C，进样体积1 μL。质谱参数包括低/高碰撞能量2–40 V，扫描频率0.2秒，ESI源电压正负分别为2500V和-2000V，源温度100 °C，脱溶剂温度500 °C，气体流速分别为800 L/h和50 L/h，扫描范围m/z为50–1200。数据预处理与注释数据经MassLynxV4.2初步处理，后续使用ProgenesisQI进行峰提取与对齐。化合物鉴定结合METLIN数据库、Biomark自建库及理论碎片分析，误差控制在100 ppm以内。数据分析在数据分析阶段，我们首先对原始数据的峰面积进行归一化处理，采用总峰面积法进行标准化。随后，通过主成分分析（PCA）和Spearman相关分析来评估样本组内的重复性，从而确保对照组与实验组之间的一致性与可靠性。在KEGG、HMDB和LipidMaps等数据库中，我们进一步检索已鉴定的化合物，以获得其分类和相关代谢通路的信息。根据样本的分组，我们计算并比较各化合物的差异倍数，并通过T检验评估每个化合物的显著性，得到相应的P值。为进一步验证模型的可靠性，我们使用R语言包ropls进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。同时，通过200次排列测试对模型进行验证。模型的VIP（变量重要性投影）值通过多重交叉验证计算得到。在OPLS-DA模型中，我们结合差异倍数（FC）、P值和VIP值来筛选显著的差异代谢物。筛选的标准为FC>1，P值<0.05和VIP>1。最后，我们使用超几何分布检验方法来计算KEGG通路中差异代谢物的富集显著性。2.4统计学方法本研究采用SPSS23.0及GraphPadPrism9.5进行数据分析。正态分布数据以均数±标准差表示，非正态数据以中位数和四分位数[M(Q₁,Q₃)]表示，并通过Shapiro-Wilk检验判断正态性。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐用LSD-t检验，方差不齐或非正态数据则用Kruskal-WallisH及Mann-WhitneyU检验。两组比较采用独立样本t检验。3实验结果3.1药效学评价实验结果3.1.1体重变化和DAI评分与C组相比，M组小鼠DAI评分显著增加；与M组相比，D、AL组DAI评分显著降低；与D组相比，L、H组显著增加，如REF_Ref6265\h图1。图SEQ图\*ARABIC1体重变化和DAI评分3.1.2结肠长度与C组相比，M组小鼠结肠长度显著缩短；与M组相比，D组小鼠结肠长度显著增加；与D组相比，L、H组小鼠结肠长度显著缩短如REF_Ref6367\h图2。图SEQ图\*ARABIC2结肠长度3.1.3HE染色C组织完整，包括粘膜层、肌层，其隐窝和杯状细胞规则排列，未见病理改变；M组粘膜层大片变性坏死、溃疡固有层内肠腺消失，伴大量炎性细胞浸润，隐窝扭曲、萎缩；D组减少了DSS诱导的UC小鼠的炎症细胞，但是隐窝扭曲和萎缩仍然存在，表明炎性细胞浸润造成的结肠损伤尚未完全愈合；AL组减少了DSS诱导的UC小鼠的炎症细胞。与D组相比，L，H组小鼠结肠组织病理损伤加重，杯状细胞减少，伴炎性细胞浸润。Y组小鼠结肠组织局部黏膜层轻微变性坏死，杯状细胞减少，黏膜下层未见水肿，肌层及外膜未见病理改变。见REF_Ref6432\h图3ABCDEFG图SEQ图\*ARABIC3各组小鼠结肠组织HE染色结果（A正常组B模型组C大蒜素低剂量组D补脾益肠丸E补脾益肠丸+大蒜素低剂量组F补脾益肠丸+大蒜素高剂量组G阳性药组）3.1.4大鼠结肠组织中IL-1β活力测定IL-1β即肿瘤坏死因子α是参与炎症的主要炎性细胞因子之一，在各种慢性炎症性疾病中高表达。在IL-1β因子测定中，结果如图1-5所示，与空白组相比，模型组大鼠血清中IL-1β含量明显增多，差异有显著性（P<0.05）。阳性药组与补脾益肠丸大蒜素组均能显著降低IL-1β的因子水平（P<0.05），而补脾益肠丸加大蒜素低剂量以及补脾益肠丸加大蒜素高剂量随着大蒜素的加入IL-10水平相较补脾益肠丸组显著增加。如REF_Ref6628\h图4图SEQ图\*ARABIC4各组小鼠血清中IL-1β含量测定结果3.1.5大鼠结肠组织中IL-10活力测定IL-10是抗炎因子，是免疫应答的重要调节剂。在IL-10因子测定中，结果如图1-7所示，结果如图所示与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-10水平明显降低，差异有显著性（P<0.05）。阳性药组与补脾益肠丸以及大蒜素组均能显著增加IL-10的因子水平（P<0.05），而补脾益肠丸加大蒜素低剂量以及补脾益肠丸加大蒜素高剂量随着大蒜素的加入IL-10水平相较补脾益肠丸组显著降低。如REF_Ref6726\h图5图SEQ图\*ARABIC5各组小鼠血清中IL-10含量测定结果3.2代谢组学实验结果3.2.1总体样本PCA分析将所有实验样本与QC样本提取得到的峰进行PCA分析，如图3-1所示实验结果表明QC样本紧密聚集在一起，说明实验的重复性良好。如REF_Ref6847\h图6AB图SEQ图\*ARABIC6样本主成分分析（PCA）得分图（A二维散点图B三维空间分图）3.2.2QC样本相关性对QC样本进行相关性分析，结果如图3-2所示，QC样本间的相关性系数都在0.9以上，说明实验的重复性良好。如REF_Ref6925\h图7图SEQ图\*ARABIC7QC样本的相关性分析图3.2.3多元数据分析在进行差异代谢物分析之前，我们首先对不同处理组进行了无监督主成分分析（PCA），以观察各组之间及组内样本的变异情况。结果显示，同一组的样本在图中基本聚集在一起，并位于95%的椭圆置信区间内，说明组内样本稳定性较好，且差异具有生物学意义。进一步，通过OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析）对空白组、模型组、补脾益肠丸组以及补脾益肠丸联合大蒜素低剂量组和高剂量组进行分析，结果如图3-3所示。分析发现，各组之间的样本在空间上的聚集和分离更加明显，表明这些处理之间存在较显著的代谢差异。此外，四组模型的Q2Y值均大于0.9，说明模型拟合度和预测能力较强，可以进一步用于筛选差异代谢物和潜在生物标志物。如REF_Ref7023\h图8ABCD图SEQ图\*ARABIC8各组之间的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）评分图（A模型组与空白组B模型组与补脾益肠丸组C补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素低剂量组D补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素高剂量组）为了评估OPLS-DA模型可靠性水平，我们进行了200次排列测试，（评价模型准确性的预测参数有R2X，R2Y和Q2Y，当R2Y和Q2Y越接近于1时表示模型越稳定，且Q2Y大于0.5时可认为是有效的模型），结果如图3-4显示，R2Y，Q2Y的值均接近于1，Q2Y回归线的截距均小于零，且均大于0.5，这表明模型可靠且未过度拟合，因此，我们可以将这些数据用于后续分析。如REF_Ref7124\h图9ABCD图SEQ图\*ARABIC9各组之间排列测试图（A模型组与空白组B模型组与补脾益肠丸组C补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素低剂量组D补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素高剂量组）3.2.4差异代谢物筛选差异筛选结果利用OPLS-DA模型中的VIP≥1，以及单变量分析中的P<0.01和FC>1的标准，可以进一步筛选差异代谢物。共鉴定出种差异代谢物，见REF_Ref7245\h表4。表SEQ表\*ARABIC4差异代谢物列表序号CAS1Taurolithocholicacidsulfate2CholicAcid3SeneginII4Loganate5Ascorbylglucoside6Casticin7Hirsutidin8Tetrahydropteroyltri-L-glutamicacid9P-COUMARYLALCOHOL4-GLUCOSIDE10SchisandrinC1118-β-Glycyrrhetinicacid12Methylglucosinolate13Trilobine14Hirsuteine15PalmidinA163-Methoxy-φ,φ-carotene173-(Sulfooxy)butanoicacid18Deazaflavin19Gyrophoricacid20Diclofenacglucuronide21Taurolidine22Corbiculaxanthin-3′-acetate234-(2-Carboxyethyl)-2-methoxyphenylβ-D-glucopyranosiduronicacid差异代谢物火山图在本研究中，为了更直观地展示代谢物在不同实验组之间的差异表达情况，我们采用了火山图对代谢组学分析中得到的P值、VIP值以及平均表达量的倍数变化（FoldChange,FC值）进行了综合可视化。图3-5为绘制出的火山图结果，从中可以清晰地观察到各代谢物在不同处理条件下的表达变化情况。在该图中，每一个散点代表一个被检测到的代谢物。图的横坐标表示各代谢物在实验组与对照组之间的表达倍数变化，具体以2为底进行对数转换（log₂FC），以便更好地对称展示上下调情况；纵坐标则代表代谢物通过t检验所得到的显著性水平P值，同样取以10为底的负对数（-log₁₀P-value），数值越大，代表差异越显著。值得一提的是，我们还将OPLS-DA模型中的VIP值引入火山图中，用散点的大小来体现每个代谢物在模型中的重要性。具体来说，VIP值越大，代表该代谢物在区分不同组别起到的作用越关键，对应的散点也就越大。为了增强图像的可读性和表达效果，火山图中对散点颜色也进行了标注：红色散点表示在实验组中显著上调的代谢物，蓝色散点表示显著下调的代谢物，而灰色散点则表示虽有检测但未达到显著差异标准的代谢物。如REF_Ref7369\h图10ABCD图SEQ图\*ARABIC10基于OPLS-DA模型的多组差异代谢物火山图（A模型组与空白组B模型组与补脾益肠丸组C补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素低剂量组D补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素高剂量组）注：FC：平均表达量的比值；VIP：V变量投影重要性差异代谢物聚类热图对所有显著差异代谢物的表达量分别进行层次聚类。结果如图3-6所示，分析显示，补脾益肠丸治疗后加入大蒜素几种代谢物有显著的逆转趋势，如胆酸、五味子丙素、三叶木防己碱、双氯芬酸葡糖苷酸、掌叶大黄二蒽酮A等。这些发现提示大蒜素可能通过调节这些代谢物的表达来影响补脾益肠丸疗效。见REF_Ref7477\h图11ABCD图SEQ图\*ARABIC11图3-6各组之间差异代谢物的聚类热图（A模型组与空白组B模型组与补脾益肠丸组C补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素低剂量组D补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素高剂量组）差异代谢物代谢途径分析对鉴定出的差异代谢物进行KEGG通路富集分析，选择包含差异代谢物信息注释最多的前20个条目，构建代谢物丰度评分如图3-7和KEGG富集因子气泡图如图3-8。结果表明，与大蒜素影响补脾益肠丸治疗CUC疗效机制相关的代谢途径主要涉及牛磺酸代谢、类固醇激素生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、神经活性配体-受体相互作用、抗生素生物合成、蛋白质消化吸收、酪氨酸代谢，共包括7种代谢途径。进一步分析各组中已鉴定的差异代谢物的水平和趋势。见REF_Ref7601\h图12REF_Ref7604\h图13ABCD图SEQ图\*ARABIC12各组之间差异代谢物的富集分析柱状图（A模型组与空白组B模型组与补脾益肠丸组C补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素低剂量组D补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素高剂量组）ABCD图SEQ图\*ARABIC13各组之间差异代谢物KEGG富集气泡图（A模型组与空白组B模型组与补脾益肠丸组C补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素低剂量组D补脾益肠丸组与补脾益肠丸组+大蒜素高剂量组）4小结与讨论4.1药效学评价本研究采用自由饮用2%葡聚糖硫酸钠（DSS）的方法，成功建立了小鼠慢性溃疡性结肠炎（UC）模型。DSS作为常用的炎症性肠病造模药物，能诱发类似UC的病理表现REF_Ref2987\r\h[6]。在连续饮用DSS第15天起，我们分别给予小鼠补脾益肠丸单药（D组）及其联合不同剂量大蒜素的处理（L组、H组），以观察其干预效果。实验过程中，小鼠逐渐出现体毛暗淡、体重下降、蜷缩不动等典型结肠炎表现，提示炎症正在持续加重。解剖显示，模型组小鼠结肠明显缩短，证实了炎症对肠道结构的破坏。而补脾益肠丸高剂量组的结肠长度较模型组有所恢复，提示其可能具备一定的修复作用。然而，联合大蒜素后的组别却未显示类似改善，反而出现结肠进一步缩短，暗示大蒜素可能干扰了补脾益肠丸的作用。疾病活动指数（DAI）评分进一步支持了这一发现。模型组小鼠的DAI评分显著升高，补脾益肠丸能有效降低该评分，反映其抗炎潜力。但当其与大蒜素合用时，DAI评分再度上升，说明疗效受到削弱。组织学观察结果也一致：模型组小鼠肠道结构严重受损，而补脾益肠丸处理后炎症明显缓解，尽管仍有隐窝结构紊乱。联合大蒜素的组别则表现出更多的炎性细胞浸润和杯状细胞减少，表明病变程度加重。相比之下，阳性对照组仅有轻度病理改变。在炎症因子水平检测中，补脾益肠丸显著降低了TNF-α、IL-1β等促炎因子，并提升了IL-10等抗炎因子的表达。然而，与大蒜素联用后，这一趋势逆转，促炎因子升高，抗炎因子降低。综上，补脾益肠丸在慢性UC小鼠模型中展现出一定的抗炎及组织修复能力，而大蒜素的联合使用可能削弱其疗效。研究结果为后续机制探究与临床应用提供了基础支持。4.2差异代谢物和通路1.抗氧化与抗炎通路的双重抑制​补脾益肠丸的核心成分五味子丙素通过抑制NF-κB通路和清除自由基发挥抗炎/抗氧化作用REF_Ref3059\r\h[7]，而大蒜素可能通过激活Nrf2通路产生竞争性氧化应激调控，干扰五味子丙素的自由基清除效率。此外，大蒜素的高浓度硫化物可能抑制三叶木防己碱对T淋巴细胞免疫调节的功能，导致Th1/Th2失衡，加剧肠道炎症REF_Ref3137\r\h[8]。2.黏膜屏障与胆汁酸代谢失衡​18-β-甘草次酸通过增强紧密连接蛋白ZO-1维持肠道屏障REF_Ref27817\r\h[17]，但大蒜素的抗菌作用可能破坏肠道菌群平衡REF_Ref3209\r\h[9-REF_Ref3294\r\h12]，促使牛磺酸代谢异常，导致次级胆汁酸硫酸牛磺胆酸生成增加，激活FXR受体并加重黏膜炎症。同时，大蒜素对不饱和脂肪酸生物合成通路的抑制，可能削弱抗炎脂介质的合成，进一步削弱黏膜修复能力。3.神经-免疫调控网络紊乱​补脾益肠丸依赖神经活性配体-受体相互作用REF_Ref3643\n\h[13]，而大蒜素通过干扰胆碱能信号和钙离子通道，可能加剧肠痉挛。此外，去氢毛钩藤碱的氧化应激调控失效可能与大蒜素诱导的ROS-MAPK通路激活有关REF_Ref3761\n\h[14]，导致线粒体功能障碍和细胞凋亡增加。4.菌群-代谢协同作用破坏​大蒜素的广谱抗菌性虽抑制病原菌REF_Ref25371\r\h[16]，但也可能清除益生菌REF_Ref3829\n\h[15]，干扰补脾益肠丸依赖的菌群-代谢轴功能。例如，蛋白质消化吸收和酪氨酸代谢异常可能减少短链脂肪酸生成，降低肠道pH值调节能力，削弱抗炎微环境。5.结论本研究采用DAI评分、结肠长度、HE染色、ELISA试剂盒证明了大蒜素和补脾益肠丸联用会降低补脾益肠丸治疗慢性溃疡性结肠炎的疗效。大蒜素通过调节胆酸、五味子丙素、三叶木防己碱、掌叶大黄二蒽酮A等代谢物干扰抗氧化、黏膜修复、神经免疫调节及菌群代谢网络，与补脾益肠丸产生多通路拮抗作用,并从代谢层面揭示了中医“忌辛辣”理论的科学内涵。

参考文献史瑞，李军祥，沈洪，等.溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识（2023年）[J].中华中医药杂志，2024，39(1):288-296.WanP，ChenH，GuoY，etal.Advancesintreatmentofulcerativecolitiswithherbs：frombenchtobedside[J].WorldJGastroenterol，2014，20（39）：14099-14104.王浩,丁佳丽,孙光军,等.中医药干预溃疡性结肠炎相关信号通路的研究进展[J/OL].中国实验方剂学杂志,1-18[2025-05-12]./10.13422/ki.syfjx.20251695.毛旭文,李新霞,刘印天,等.16SrDNA实时荧光定量PCR检测大蒜提取物对小鼠肠道菌群的调节作用[J].中国微生态学杂志,2022,34(07):751-758.DOI:10.13381/ki.cjm.202207002.贾世栋,杨浩,宋百灵,等.大蒜提取物对小鼠肠道菌群调节作用研究[J].新疆医科大学学报,2