患者来源的类器官模型在尿路上皮癌相关研究中的应用进展2025

患者来源的类器官模型在尿路上皮癌相关研究中的应用进展2025尿路上皮癌是泌尿恶性肿瘤最常见的组织学类型。根据起源的解剖学位置，可分为膀胱上皮癌（urinarybladderurothelialcarcinoma，BLCA）和上尿路上皮癌（uppertracturothelialcarcinoma，UTUC）。其中膀胱癌占尿路上皮癌患者的90%以上，UTUC仅占5%~10%［1］。UTUC可进一步分为肾盂癌和输尿管癌。尽管均起源于尿路上皮细胞，BLCA和UTUC仍存在分子差异。例如，UTUC患者中FGFR3和HRAS突变率高于BLCA［2］。此外，UTUC作为一种与Lynch综合征相关的恶性肿瘤，约8.7%的患者携带Lynch综合征相关基因突变，而在膀胱上皮癌患者中，携带此类突变的比例则不足1%［3］。尿路上皮癌的体外研究常用BLCA来源的J82和UMUC3等细胞系［45］。细胞系的体外共培养体系难以模拟体内微环境，导致其在模拟肿瘤细胞体内行为及评估患者预后反应方面表现不佳。且细胞系在多次传代后易出现遗传漂变，进一步偏离患者体内肿瘤细胞的实际状态。此外，由于缺乏源于UTUC的商业化细胞系，细胞系模型模拟UTUC的效果较差，导致UTUC的细胞系研究临床转化成果较为有限，转化效率较低。为克服细胞系研究的局限，精准模拟患者体内肿瘤状态及相互作用，患者来源的类器官（patientderivedorganoid，PDO）模型应运而生，已较好地应用于肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤领域研究［68］。与患者来源的肿瘤异种移植（patientderivedxenograft，PDX）模型类似，PDO模型的肿瘤细胞直接取自患者，遗传漂变少，与真实肿瘤细胞基因组和分子特征高度相似。异种移植模型和类器官模型还可有效模拟肿瘤微环境和组织学构成，补充了细胞系研究的不足（表1）。近年来，膀胱上皮癌的PDO模型已被广泛应用。然而，UTUC的PDO模型研究仍处于起步阶段，未来有广阔的研究空间。一、尿路上皮癌PDO模型的构建PDO模型通过分离患者源性肿瘤组织细胞，并在特制的培养基中培养以形成类器官。与传统的细胞系相比，类器官能够形成与真实组织高度相似的三维结构，从而更准确地模拟体内组织的生长状态。目前膀胱癌和UTUC的PDO模型均已被成功构建。尿路上皮癌常用基质为Matrigel基质或细胞外基质提取物，也有部分UTUC类器官研究选择使用胶原蛋白作为基质。尿路上皮癌PDO培养基成分一般包括：（1）营养物质，常用DMEM培养基或牛胎血清；（2）肿瘤关键信号通路因子，包括Wnt通路激活剂、EGF通路激活因子、TGFβ抑制剂和BMP抑制剂等；（3）尿路上皮特异因子，其中BLCA常见的特异因子包括PGE2、烟酰胺等，UTUC常见的特异因子包括FGF10、肝细胞生长因子HGF等［911］。此外，目前研究报道了多种创新的细胞培养方法，例如琼脂涂层培养、气液界面培养、基质嵌入培养、细胞悬浮培养、聚集培养、球状体培养以及组装体培养等［12］。这些方法能够有效模拟不同细胞类型及胞外基质与肿瘤细胞之间的复杂相互作用，为体外观察和定量研究提供了有利平台［6］。除了天然胞外基质，细胞外基质去除培养技术的发展也为类器官共培养模型带来了重大突破。例如，新型复合水凝胶等材料允许PDO与基质细胞共培养，且可调控生化信号和独立调整机械性能，从而实现对PDO生长、发育和形态的精准控制［13］。与PDX模型相比，PDO模型的构建成功率与成本具有明显优势，使得PDO模型在肿瘤的前临床研究中得到了更广泛的应用［6，

14］。二、PDO模型对尿路上皮癌生物学行为的模拟为确保PDO模型在转化医学前临床实验中的有效性，其组织学特征、基因表达谱及基因组突变特征需与患者肿瘤细胞高度相似［9］。具体而言，可通过HE染色等病理学方法评估模型与原肿瘤的组织学相似性，包括细胞大小、边界特征、胞质嗜酸性及核仁形态等。BLCA的PDO形态学多样，球形至不规则形均有；组织结构可表现为实性或含有腔隙；边界特征既存在平滑型，亦可呈不规则型。HE染色与亲本肿瘤高度相似，连续传代后均无良性组织［15］。Li等［9］通过HE染色证实，UTUC的PDO模型呈现密集且实心的结构，具有细胞排列紊乱等典型癌组织特征。而源自癌旁组织的正常类器官则呈腺泡状和囊性结构，细胞排列规则。由于微环境缺失等原因，以细胞系为平台的研究存在遗传漂变的局限。与细胞系相比，PDO能够更好地保持亲本肿瘤基因组的突变。既往研究通常使用第二代测序对比PDO与亲本肿瘤的基因组特征。如在Li等［9］建立的UTUC的PDO模型中，基因组的点突变和拷贝数变异等均与亲本肿瘤保持高度一致。此外，研究者还对高频突变基因进行了富集分析，富集通路包括RTK通路、TP53通路和表观遗传学通路（如KDM6A）等［9］，与既往关于UTUC基因组的队列研究报道结果一致［16］。BLCA的PDO模型体细胞突变谱和染色体畸变与亲本肿瘤的相同突变比例为80%以上，且在连续传代后，包括FGFR3、STAG2、ERBB2、EGFR、TP53和RB1等基因的突变基因型大部分得以保留［15，

1718］。与基因组特征的高度保守不同，PDO对转录水平特征保持效果相对较差。尽管如此，与传统的细胞系模型相比，PDO在保持转录组特征方面仍具有明显优势。snRNAseq和scRNAseq的分析结果显示，BLCA的PDO模型与亲本肿瘤组织具有较高相似度。此外，PDO模型能够保持对化疗抵抗和免疫抑制微环境等表型［19］。Li等［9］的研究发现，PDO模型的转录组数据和TCGA数据库中UTUC患者存在较高的相似性，如FGFR3、ERBB2、HRAS、PIK3CA和TSC1等基因高表达。PDO模型对蛋白组学特征的保持效果较转录组特征稳定性更差。短期培养的来自BLCA的PDO模型对亲代肿瘤的蛋白组学特征保持效果较好，而随着传代次数增加，蛋白组的不稳定性逐渐增加。目前暂无比较UTUC的PDO和亲代肿瘤的蛋白质组学特征的相关研究。Li等［9］通过免疫组化证实PDO模型的免疫标志物浓度和分布特征与亲本肿瘤一致。免疫微环境在肿瘤的生长、侵袭和转移等生物学行为中扮演着关键角色，因此，在体外准确模拟肿瘤免疫微环境对于深入研究肿瘤免疫治疗具有重要意义。肿瘤免疫微环境主要由肿瘤浸润的免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞以及细胞外基质等组成。为了更好地模拟免疫微环境，研究者开发了肿瘤细胞与免疫微环境成分共培养的PDO模型，可实现肿瘤微环境相互作用的体外模拟。BLCA的PDO共培养模型已被成功建立，而UTUC领域尚未见报道。肿瘤微环境成分包括免疫细胞、间质细胞等。2020年，Neal等［20］采用气液界面培养法建立了包括BLCA在内的19种不同肿瘤的PDO模型，共培养的免疫细胞包括T细胞、自然杀伤细胞等。而在间质细胞中，癌相关成纤维细胞（cancerassociatedfibroblasts，CAF）最为重要。CAF具有多样性和可塑性，在肿瘤生长，促进炎症，上皮间质转化等生物学行为中起到关键作用［21］。将CAF与上皮肿瘤PDO共培养形成cPDO，可增强肿瘤细胞侵袭能力，在体外模拟肿瘤细胞的侵袭行为［22］。Kim等［23］的研究通过组装体平台建立了BLCA的多层PDO模型，包含了CAF、肌层等间质细胞，研究结果显示CAF与肿瘤细胞的FOXA1BMPhedgehog信号通路对肿瘤组织学形态具有重要影响，进而证明间质共培养对肿瘤PDO模型的重要意义。三、PDO模型在尿路上皮癌领域的应用（一）在基础研究领域的应用在尿路上皮癌领域，PDO已被系统应用于阐明化疗耐药机制、发现可指导治疗的分子标志物等多项基础研究中。1.肌层浸润性膀胱癌（muscleinvasivebladdercancer，MIBC）：顺铂是MIBC的一线化疗药物，Wang等［24］发现了铂类化疗导致的MIBC半鳞状化和耐药现象，并借助PDO模型联合多组学技术，揭示了组织蛋白酶H（cathepsinH，CTSH）在其中的关键作用，最终验证了抑制CTSH活性可抑制化疗耐药MIBC生长。吉西他滨也是MIBC的重要化疗药物，Zhan等［19］运用免疫组化等技术，在PDO模型中证实外泌体传递的LUCAT1通过结合IGF2BP2，上调HMGA1表达，进而增强BLCA细胞的干细胞特性和吉西他滨耐药性。尽管以FGFR为靶点的治疗是目前BLCA较成功的靶向治疗方法［25］，然而目前暂无基础研究利用PDO模型探索FGFR靶向治疗的耐药性和低应答率机制。免疫治疗适用于不适合接受顺铂治疗或发生转移的MIBC患者，目前抗PD1/PDL1治疗已成为MIBC免疫治疗的一线选择［26］。Wang等［27］收集了38例MIBC组织样本构建PDO模型，鉴定出PDL1+的癌干细胞样亚群，并借助多组学联合分析，揭示了该癌干细胞样亚群中的IGF2BP3/SPHK1信号可上调PDL1、CTLA4、LAG3、FOXP3、TIGIT等免疫抑制标志物的表达，进而促进MIBC免疫抑制微环境的形成。Yu等［28］通过体外和体内实验，发现M2型肿瘤相关巨噬细胞通过分泌TGFβ促进PKM2STAT3复合物的核转位，上调PDL1的表达，介导免疫逃逸。基于该研究结果构建的BLCA的PDO模型，验证了使用TGFβ受体阻断剂（SB431542）和PKM2抑制剂可显著降低PDL1表达，从而增强抗肿瘤免疫反应。2.UTUC：吉西他滨是UTUC化疗的常用药物，同样存在无应答和耐药性的问题。Li等［9］构建了UTUC患者的队列PDO模型，利用单细胞转录组测序，分析耐药组和敏感组PDO模型在吉西他滨处理前后状态，发现吉西他滨耐药性源于原有耐药细胞的增殖扩张，该细胞群呈现出上皮间质转化基因激活（VIM、ZEB2和COL1A2显著上调），吉西他滨代谢通路下调，凋亡相关通路下调等分子特征，较好地解释了耐药性的分子机制。此外，该研究发现p53、KRAS以及通过NFκB介导的TNFA等多条通路与吉西他滨耐药性的产生高度相关。尽管靶向PD1/PDL1的免疫治疗是UTUC的一线免疫疗法，但目前尚未有研究利用PDO模型探究UTUC免疫治疗的应答机制。（二）在前临床研究中的应用PDO在肿瘤研究领域的可应用于药物及新兴疗法的临床前评估。此类研究可模拟2期临床试验，为2、3期试验设计提供参考，并补充药物、疗法安全性与有效性证据［29］。在多种肿瘤的新辅助治疗与联合疗法的评估中，PDO应用广泛且成果显著。在尿路上皮癌领域，PDO模型主要用于新组合疗法和新药物的前临床探究。1.新组合疗法的开发：由于顺铂在MIBC患者中普遍存在耐药性和不良反应，而开发顺铂的联合疗法有助于解决上述问题。Xu等［30］利用来自4例MIBC患者的PDO模型证明螺内酯可抑制ERCC2介导的核苷酸切除修复，进而放大顺铂DNA损伤效应，为“顺铂+DNA修复抑制剂”组合奠定了机制基础。Jones等［31］通过多组学研究，证明了嘌呤霉素敏感氨基肽酶（NPEPPS）在铂类耐药的关键作用，并构建了来自7例患者的PDO模型，验证了NPEPPS抑制剂托塞普联合顺铂治疗对缓解顺铂耐药的有效性。顺铂是UTUC的一线化疗药物，但亦存在客观应答率低、患者普遍存在原发或获得性耐药等问题，且UTUC术后肾功能不全进一步限制了其足剂量应用［34］。鉴于此，研究人员利用PDO模型开展了多项UTUC顺铂联合疗法的研究。Luo等［35］通过构建来自6例UTUC患者的PDO模型，设计了体外冲击波疗法与顺铂联合治疗UTUC的实验方案，结果显示5例患者的PDO模型中冲击波疗法可增强患者对顺铂化疗的敏感性。在另一项研究中，针对UTUC患者出现DPP4表达高频上调的现象，PDO研究显示DPP4抑制剂西格列汀可促进UTUC细胞凋亡标志物上调，且与顺铂联合后疗效不劣于顺铂单药［36］。针对UTUC的吉西他滨耐药性问题，已有部分研究开发了一些吉西他滨的组合疗法。UTUC的PDO模型的单细胞转录组数据显示，cMET基因在吉西他滨耐药的患者肿瘤细胞中显著上调，研究者利用PDO来源的UTUC细胞系，证实了卡博替尼与吉西他滨的联合用药方案能够有效克服耐药性，增强治疗效果［9］。2.新药物的前临床探究：受制于免疫逃逸现象，MIBC患者接受抗PD1/PDL1治疗的总体应答率相对较低。基于此，以CART疗法为代表的免疫疗法在BLCA治疗领域重新获得关注。Yu等［18］构建了BLCA的PDO与CART细胞共培养模型，以探索CART疗法在BLCA中的应用。该研究发现了一种在亲本肿瘤和PDO表面均高表达的抗原MUC1，并且制备了针对MUC1的CART细胞，验证了其在MUC1+PDO和亲本肿瘤组织中均有特异性杀伤能力。非肌层侵袭性膀胱癌（nonmuscleinvasivebladdercancer，NMIBC）的化疗效果较差，膀胱灌注BCG疗法是首选疗法。然而，20%~40%的患者在BCG治疗后仍会出现疾病复发或进展，被定义为“BCG无反应性NMIBC”［33］。抗体偶联的靶向药物（antibodydrugconjugate，ADC）的出现为NMIBC的治疗提供了新思路。Hong等［11］开发了一种靶向HER2的ADC药物RC48ADC，并在来自6例NMIBC患者的PDO模型中验证了其疗效，并提出RC48ADC的抗肿瘤效应与肿瘤HER2表达水平正相关。（三）在个体化治疗中的应用除在研究领域发挥作用外，PDO还可直接应用于患者的精准治疗。将患者的肿瘤组织培养形成PDO，可直接应用于化疗药物的筛选。Merrill等［32］收集了97例MIBC患者的106个肿瘤样本，构造了PDO模型。通过多组学分析，发现了与吉西他滨反应相关的多组学标志物体系，例如TP53和RB1的变异与对吉西他滨更敏感有关，而KDM6A的变异则与反应较差相关。该研究为MIBC患者的化疗预后预测及精准药物选择提供了新的工具支持，推动了精准医学在临床实践中的应用。在一项暂未完成的单臂2期临床试验中，研究者将利用来自中危NMIBC患者的PDO进行4种药物灌注（表柔比星、丝裂霉素C、吉西他滨和多西他赛）的体外筛选，将体外抑制效果最好的药物用于患者治疗，预期PDO药物筛选能成功预测药物效果的比例超过65%［37］。Liu等［38］报告了2例高级别MIBC病例资料，活检组织培养出的PDO模型均对吉西他滨和顺铂联合用药敏感。在使用吉西他滨和顺铂进行联合化疗后，患者反应良好，并成功实施了根治性膀胱切除术。术后6个月内未发现复发或转移。此外，PDO模型是高通量筛选药物的有力工具，凭借自动化设备可同步操作多个样本并监测细胞状态，从而显著提升药物筛选效率。有研究者在BLCA的PDO模型中开展了高通量药物筛选探索，对来源于2例肉瘤样BLCA患者的PDO模型进行基因组和转录组数据分析，利用包含1110种美国食品药品监督管理局批准药物及457种临床试验药物的NEXUSPersonalizedHealthTechnologies化合物库，筛选出147种可抑制间质化BLCA细胞生长的化合物、53种可抑制上皮样BLCA细胞生长的化合物，以及70种对两种细胞均具抑制作用的化合物，并证实了糖皮质激素治疗对逆转尿路上皮癌细胞上皮间质转化具有重要作用［39］。然而在UTUC领域，尚无研究开展PDO模型的高通量药物筛选。四、PDO模型在尿路上皮癌领域应用的局限性PDO模型能够在体外更好地模拟体内的条件和亲代肿瘤的分子特征，模拟患者的异质性，相比体内的PDX模型，PDO模型培养时间短，成本低，且不存在人和模型动物种属差异。然而，现阶段应用于尿路上皮癌的PDO模型仍存在一些技术局限。首先，PDO模型的药物以相对均一的浓度直接浸润肿瘤细胞，而在实际情况中，药物往往在体内分布不均，甚至难以到达肿瘤部位。因此，PDO模型难以模拟实际情况下药物的分布。其次，PDO模型中药物暴露通常不随时间变化，而体内药物浓度会因代谢随时间波动，呈现峰谷效应，同样会显著影响疗效。有学者通过质谱等实验方法验证，PDX模型在药物的时间波动和空间分布方面表现优于PDO模型［40］。现有尿路上皮癌的PDO模型均为静态模型，较难以模拟肿瘤的侵袭和转移等生物学行为［9，

35］。在血管模拟方面，尿路上皮癌现有的PDO模型均为无血管模型［9，

35］，既缺失了内皮细胞和肿瘤细胞的相互作用，又造成了药物扩散与体内肿瘤组织的差异。更为重要的是，PDO模型还存在功能性免疫记忆缺失问题，记忆T细胞仅能在体内维持表型，因此，PDO模型不适宜研究免疫治疗的长期效果。而且，静态PDO模型难以模拟肿瘤内的缺氧状态，而缺氧状态对于肿瘤的转移、免疫抑制等生物学行为有着重要的作用［41］。然而，目前已有多种技术路线在其他肿瘤领域为解决上述问题提供思路，如可应用三维微流控芯片形成动态微环境装置，以克服肿瘤细胞侵袭的空间限制。将乳腺癌类器官暴露于不同浓度梯度的表皮生长因子后，细胞沿浓度梯度迁移，侵袭速度较静态培养时显著提高，并形成类似体内转移的“侵袭前沿”［42］。此外，Chen等［43］开发的微流控芯片Transwell集成器官oidsonachip平台（TOP）可应用于PDO模型，实现对肿瘤细胞向不同器官转移的体外模拟与监测。在血管模拟方面，其他肿瘤领域也有微流控器官芯片系统［44］