基于网络药理学解析穿心莲内酯类化合物多靶点协同作用机制

基于网络药理学解析穿心莲内酯类化合物多靶点协同作用机制一、引言1.1研究背景与意义1.1.1穿心莲内酯类化合物研究背景穿心莲内酯类化合物是从爵床科植物穿心莲中提取得到的二萜内酯类成分，作为中药穿心莲的主要活性成分，其在穿心莲叶中含量较为可观，是穿心莲发挥诸多药理作用的关键物质基础。其化学结构独特，分子式为C_{20}H_{30}O_{5}，由五个环组成，包含一个α-亚甲基-γ-内酯环和一个双键，这种特殊结构赋予了它多种药理活性。现代药理研究发现，穿心莲内酯类化合物具有广泛的生物活性。在抗菌方面，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌表现出较强的抑菌活性，其作用机制可能是抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞膜完整性以及干扰细菌蛋白质和核酸合成等。在抗炎领域，可抑制多种炎症反应，例如抑制二甲苯或醋酸所致小鼠皮肤或腹腔毛细血管通透性的增加，对大鼠蛋清、角叉菜胶足趾注射致炎模型也有明显抗炎效果，主要通过抑制炎性介质如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）和IL-6等的产生，以及降低炎性细胞浸润、抑制炎症信号转导等途径实现。在抗病毒方面，对香港病毒（HKV）、埃博拉病毒（EBOV）和呼吸道合胞病毒（RSV）等具有拮抗作用，能干扰病毒的复制周期，抑制病毒颗粒的形成与释放。此外，它还具有保肝利胆、增强免疫功能、抗心血管疾病以及抗肿瘤等作用，对四氯化碳、叔丁基过氧化氢引起的肝毒性有对抗作用，能促进免疫活性细胞的增殖，具有抗心肌缺血和抗缺血-再灌注损伤等心血管保护作用，还可抑制多种肿瘤细胞的生长和增殖。由于穿心莲内酯类化合物展现出的多种重要生物活性，在医药领域具有巨大的应用潜力，然而其作用机制尚未完全明确。深入研究穿心莲内酯类化合物的作用机制，不仅能够为其在临床治疗中的合理应用提供坚实的理论依据，推动新型药物的研发，还能进一步拓展其药用价值，对开发基于穿心莲内酯类化合物的创新疗法和药物具有至关重要的意义。1.1.2网络药理学研究意义网络药理学是2007年由英国药理学家Hopkins首次提出的概念，它以系统生物学和多向药理学为理论基石，将复杂药物与复杂疾病治疗相关联。该学科通过构建生物分子网络，例如蛋白互作网络、信号通路网络等，进行新药设计和靶点分析，为新药研发和药物作用机制研究提供了极具价值的预测依据。在研究复杂药物作用机制方面，网络药理学具有独特优势。传统的药物研究方法往往侧重于单一靶点和单一作用机制，难以全面阐释中药等复杂药物体系的作用原理。中药通常包含多种化学成分，这些成分可能作用于多个靶点，通过多条信号通路发挥协同作用，呈现出多成分、多靶点、多途径的特点。网络药理学能够整合药物的多种成分及其作用靶点信息，构建药物-成分-靶点-通路的多维网络，从整体层面分析药物与机体的相互作用，全面揭示药物的作用机制。对于穿心莲内酯类化合物而言，网络药理学同样具有重要价值。穿心莲内酯类化合物结构多样，活性广泛，其作用机制涉及多个生物过程和信号通路。运用网络药理学方法，可以系统地分析穿心莲内酯类化合物的活性成分、作用靶点以及相关信号通路，深入探究其在体内的作用机制。通过构建穿心莲内酯类化合物的作用网络，能够直观地展示其多靶点、多途径的作用特点，发现潜在的药物作用机制和治疗靶点，为进一步的实验研究提供方向和线索，加速穿心莲内酯类化合物的研究进程，促进其在临床治疗中的应用和开发。1.2研究目的与创新点本研究旨在利用网络药理学方法，系统地探究穿心莲内酯类化合物的作用机制。通过整合药物的活性成分、作用靶点以及相关信号通路信息，构建穿心莲内酯类化合物的药物-成分-靶点-通路网络，从整体层面揭示其多成分、多靶点、多途径的作用特点，为深入理解穿心莲内酯类化合物的药理作用提供全面的视角，为其临床应用和新药研发提供科学依据。本研究的创新点主要体现在研究方法和研究视角两个方面。在研究方法上，采用网络药理学这一新兴的研究手段，突破了传统单一靶点研究的局限性，能够全面系统地分析穿心莲内酯类化合物的作用机制。网络药理学通过构建复杂的生物分子网络，将药物与疾病相关的各个要素联系起来，能够直观地展示药物的作用路径和作用靶点之间的相互关系，为药物作用机制的研究提供了新的思路和方法。在研究视角上，从整体观出发，综合考虑穿心莲内酯类化合物多种成分的协同作用以及多个靶点、多条信号通路的相互交织，不再局限于单个成分或单个靶点的研究，有助于发现穿心莲内酯类化合物潜在的作用机制和治疗靶点，为进一步的实验研究提供更有价值的方向和线索。二、网络药理学与穿心莲内酯类化合物概述2.1网络药理学原理与方法2.1.1基本原理网络药理学以系统生物学和多向药理学为理论基础，将生物系统视为一个复杂的网络，其中包含各种生物分子，如基因、蛋白质、代谢物等，这些生物分子之间存在着广泛而复杂的相互作用。疾病的发生发展往往涉及多个生物分子和多条信号通路的异常，并非由单一因素决定。药物的作用机制也并非简单地作用于单一靶点，而是通过调节生物网络中的多个节点和通路来发挥治疗作用。该学科强调从整体和系统的层面来理解生物过程和疾病机制，突破了传统药理学单一分子或单一途径研究的局限。通过构建药物-靶点网络、疾病-基因网络等多种生物分子网络，网络药理学能够全面地展示药物与生物系统之间的相互作用关系。在药物-靶点网络中，药物作为节点，通过与多个靶点的相互作用来影响生物网络的功能；靶点之间也存在着相互作用，形成复杂的网络结构。这种多靶点、多途径的作用方式使得药物能够对生物系统进行更全面、更精细的调节，从而发挥更好的治疗效果。以穿心莲内酯类化合物为例，其作用机制可能涉及多个靶点和多条信号通路。通过网络药理学的方法，可以将穿心莲内酯类化合物的活性成分与相关的靶点联系起来，构建穿心莲内酯类化合物-靶点网络。然后，进一步分析这些靶点在生物网络中的位置和作用，以及它们之间的相互关系，从而揭示穿心莲内酯类化合物的作用机制。这种方法有助于从整体上理解穿心莲内酯类化合物如何通过调节生物网络来发挥抗菌、抗炎、抗病毒等多种药理活性，为深入研究其作用机制提供了新的视角和思路。2.1.2常用方法与技术在网络药理学研究中，数据获取是基础且关键的环节，其来源广泛。从公共数据库层面来看，包括如DrugBank数据库，它整合了大量药物及其相关信息，涵盖药物化学结构、靶点信息、药物-靶点相互作用等，能为研究提供丰富的药物基础数据；GeneCards数据库则聚焦于基因相关内容，详细记录基因功能、表达情况、疾病关联等，有助于获取与药物作用相关的基因信息。从文献挖掘方面，通过专业的文献检索工具，如WebofScience、PubMed等，对海量的学术文献进行检索和筛选，能够发现大量分散在文献中的药物作用机制、靶点验证等实验数据，这些数据为网络药理学研究提供了重要的实证依据。网络构建是网络药理学研究的核心步骤之一，主要构建药物-靶点网络、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络等。在构建药物-靶点网络时，依据获取的数据，将药物及其作用靶点以节点形式呈现，靶点与药物之间的相互作用以边表示，从而形成直观的网络结构，清晰展示药物与靶点之间的关联。构建PPI网络时，借助已知的蛋白质相互作用数据，将蛋白质作为节点，蛋白质之间的相互作用作为边，构建出蛋白质相互作用的网络关系图，该网络有助于分析靶点蛋白在生物体内的相互作用关系，挖掘潜在的作用机制。网络分析工具在网络药理学研究中发挥着重要作用，Cytoscape软件是常用的一款。它具有强大的可视化功能，能将构建好的网络以直观的图形形式展示出来，便于研究者观察网络的整体结构和节点之间的关系。同时，Cytoscape还提供丰富的插件，如NetworkAnalyzer插件可对网络拓扑参数进行分析，计算节点的度、介数中心性、接近中心性等参数，通过这些参数能识别出网络中的关键节点，即对网络功能具有重要影响的靶点，为深入研究药物作用机制提供关键线索。DAVID数据库常用于基因功能富集分析，将筛选出的靶点基因输入该数据库，可分析这些基因在哪些生物学过程、分子功能和信号通路中显著富集，从而明确药物作用涉及的主要生物过程和信号通路。2.2穿心莲内酯类化合物简介穿心莲内酯类化合物是从爵床科植物穿心莲（Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees）中提取得到的一类二萜内酯类成分，是中药穿心莲发挥多种药理作用的主要活性物质。穿心莲作为一种传统药用植物，在亚洲、非洲等地区被广泛应用于治疗多种疾病，如呼吸道感染、胃肠道疾病、炎症等。其化学结构独特，基本骨架为四环二萜类，分子式为C_{20}H_{30}O_{5}，由五个环组成，包含一个α-亚甲基-γ-内酯环和一个双键。这种特殊的结构赋予了穿心莲内酯类化合物多种药理活性。例如，α-亚甲基-γ-内酯环的存在可能与化合物的抗炎、抗菌活性密切相关，其能够参与多种生物化学反应，影响细胞内的信号传导通路。双键结构则可能在调节化合物的物理化学性质以及与生物靶点的相互作用中发挥重要作用。穿心莲内酯类化合物具有广泛的药理活性。在抗炎方面，多项研究表明其能够显著抑制多种炎症模型中的炎症反应。例如，在小鼠二甲苯致耳肿胀模型中，穿心莲内酯能够明显减轻耳部肿胀程度，降低炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等的表达水平。在脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型中，穿心莲内酯可抑制一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）等炎症介质的释放，通过抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，减少炎症相关基因的转录和表达。抗菌作用方面，穿心莲内酯对多种细菌具有抑制作用。对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等常见致病菌，穿心莲内酯能够破坏细菌的细胞壁和细胞膜结构，影响细菌的蛋白质合成和核酸代谢，从而抑制细菌的生长和繁殖。研究显示，穿心莲内酯可以使金黄色葡萄球菌的细胞壁变薄、破损，细胞内容物外泄，导致细菌死亡。在抗病毒领域，穿心莲内酯对多种病毒表现出拮抗活性。对于呼吸道合胞病毒（RSV），穿心莲内酯能够抑制病毒的吸附、侵入和复制过程，降低病毒感染细胞后引起的细胞病变效应。在流感病毒感染模型中，穿心莲内酯可通过调节宿主的免疫反应，增强机体对病毒的抵抗力，减轻病毒感染引起的症状。此外，穿心莲内酯类化合物还具有保肝利胆、增强免疫功能、抗心血管疾病以及抗肿瘤等作用。在保肝方面，对四氯化碳、D-半乳糖胺等化学物质诱导的肝损伤模型，穿心莲内酯能够降低血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）等指标，减轻肝脏组织的病理损伤，促进肝细胞的修复和再生。在增强免疫功能方面，可促进免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖和活化，提高机体的免疫应答能力。在抗心血管疾病方面，能改善心肌缺血再灌注损伤，抑制心肌细胞凋亡，调节血脂代谢，降低心血管疾病的发生风险。在抗肿瘤方面，对多种肿瘤细胞系如肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞等具有抑制增殖、诱导凋亡和抑制转移的作用。三、基于网络药理学的研究设计与数据获取3.1研究设计思路3.1.1研究流程本研究旨在通过网络药理学方法深入探究穿心莲内酯类化合物的作用机制，研究流程主要包括以下几个关键步骤，各步骤之间存在紧密的逻辑关系，共同构成一个完整的研究体系。活性成分筛选：首先从相关文献、专业数据库（如中医药数据库、化学物质数据库等）以及穿心莲的研究资料中广泛收集穿心莲内酯类化合物的成分信息。依据药物的类药性原则，如分子质量、脂水分配系数、氢键供体和受体数量等参数，同时参考药物的口服生物利用度（OB）、类药性（DL）等指标，对收集到的成分进行筛选，确定具有潜在药理活性的穿心莲内酯类化合物。这一步骤是后续研究的基础，只有筛选出可能发挥作用的活性成分，才能进一步探究其作用机制。作用靶点预测：针对筛选得到的活性穿心莲内酯类化合物，利用多个数据库（如PharmMapper、SwissTargetPrediction等）和预测软件（如STITCH等）预测其作用靶点。这些数据库和软件整合了大量的药物-靶点相互作用数据以及基于分子结构和相似性原理的预测算法，能够较为全面地预测化合物可能作用的靶点。通过综合分析多个来源的预测结果，获取较为可靠的穿心莲内酯类化合物作用靶点集合。作用靶点的预测是连接活性成分与生物效应的关键环节，明确靶点有助于深入了解化合物在生物体内的作用路径。疾病相关靶点收集：从权威的疾病数据库（如OMIM、Genecards、DisGeNET等）中收集与穿心莲内酯类化合物主要治疗疾病相关的靶点信息。例如，对于其抗炎作用，收集炎症相关疾病（如类风湿性关节炎、炎症性肠病等）的靶点；对于抗菌作用，收集常见致病菌感染相关的靶点。将疾病相关靶点与之前预测得到的穿心莲内酯类化合物作用靶点进行交集分析，筛选出两者共有的靶点，这些交集靶点被认为是穿心莲内酯类化合物治疗相关疾病的潜在关键靶点。通过这一步骤，能够聚焦于与疾病治疗直接相关的靶点，为后续研究提供明确的方向。网络构建与分析：运用Cytoscape软件构建穿心莲内酯类化合物-成分-靶点-疾病网络。在该网络中，将穿心莲内酯类化合物的活性成分、作用靶点以及相关疾病分别作为不同类型的节点，它们之间的相互作用关系作为边进行连接。利用Cytoscape软件的插件（如NetworkAnalyzer）对网络进行拓扑学分析，计算节点的度、介数中心性、接近中心性等参数。通过这些参数识别出网络中的关键节点，即对网络结构和功能具有重要影响的活性成分和靶点。关键节点的确定有助于深入理解穿心莲内酯类化合物作用机制的核心要素，为后续的功能富集分析和实验验证提供重点研究对象。功能富集分析：将筛选得到的关键靶点导入DAVID数据库进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。GO功能富集分析从生物过程、分子功能和细胞组成三个层面，分析关键靶点参与的生物学过程，如细胞增殖、凋亡、免疫调节等；KEGG信号通路富集分析则确定关键靶点显著富集的信号通路，如NF-κB信号通路、MAPK信号通路等。通过功能富集分析，能够全面揭示穿心莲内酯类化合物作用的生物学过程和潜在的信号传导通路，从整体层面理解其作用机制。分子对接验证：选择网络分析和功能富集分析得到的关键靶点与穿心莲内酯类化合物的主要活性成分进行分子对接研究。利用分子对接软件（如AutoDockVina等），模拟活性成分与靶点蛋白之间的相互作用，计算结合能等参数。结合能越低，表明活性成分与靶点蛋白的结合越稳定，相互作用越强。通过分子对接验证，为穿心莲内酯类化合物与靶点之间的相互作用提供分子层面的证据，进一步支持网络药理学分析的结果。实验验证：根据网络药理学分析的结果，设计体外细胞实验和体内动物实验对预测的作用机制进行验证。体外细胞实验方面，选择合适的细胞系（如巨噬细胞系、肿瘤细胞系、细菌细胞等），通过给予穿心莲内酯类化合物处理，检测相关指标，如炎症因子的表达水平、细胞增殖和凋亡情况、细菌的生长抑制率等。体内动物实验则建立相应的疾病动物模型（如炎症模型、感染模型、肿瘤模型等），给予穿心莲内酯类化合物干预，观察动物的症状改善情况、病理组织学变化以及相关分子指标的改变。实验验证是研究的重要环节，能够直接检验网络药理学预测结果的可靠性，为穿心莲内酯类化合物的临床应用提供实验依据。通过以上研究流程，从活性成分筛选开始，逐步深入到作用靶点预测、网络构建与分析、功能富集分析、分子对接验证以及最后的实验验证，形成一个从理论预测到实验验证的完整研究体系，全面系统地探究穿心莲内酯类化合物的作用机制。3.1.2技术路线本研究的技术路线如图1所示：[此处插入技术路线图，图中清晰展示从穿心莲内酯类化合物活性成分筛选开始，经过作用靶点预测、疾病相关靶点收集、网络构建与分析、功能富集分析、分子对接验证，最后到实验验证的整个研究流程，每个环节标注相应的关键技术手段和使用的数据库或软件，如筛选使用的数据库、预测靶点的软件、构建网络的软件、富集分析的数据库等]从图中可以清晰地看到，研究首先从多渠道收集穿心莲内酯类化合物的成分信息，利用类药性原则和相关指标筛选活性成分。然后，借助多个数据库和预测软件对活性成分的作用靶点进行预测，并从疾病数据库收集相关疾病靶点，通过交集分析确定潜在关键靶点。接着，运用Cytoscape软件构建复杂网络，利用插件进行拓扑学分析，再将关键靶点导入DAVID数据库进行功能富集分析。之后，选择关键靶点与主要活性成分进行分子对接验证。最后，通过体外细胞实验和体内动物实验对网络药理学分析结果进行验证。整个技术路线逻辑清晰，各环节紧密相连，通过多种技术手段的综合运用，确保研究能够全面、深入地揭示穿心莲内酯类化合物的作用机制。3.2数据获取与处理3.2.1活性成分筛选为获取穿心莲内酯类化合物的活性成分，本研究从多个权威数据源进行数据收集。首先，利用中医药领域常用的数据库，如中医药综合数据库（TCMID），该数据库整合了大量中药的化学成分信息，对穿心莲相关内容有较为全面的收录。从中检索到穿心莲中多种内酯类化合物的结构、理化性质等基础数据。同时，参考了化学物质数据库，如PubChem，其提供了丰富的化学物质结构和性质信息，对穿心莲内酯类化合物的化学结构解析和确认起到重要作用。在筛选过程中，严格依据类药性原则。类药性是判断化合物是否具有成为药物潜力的重要标准，主要考量分子质量、脂水分配系数、氢键供体和受体数量等参数。一般来说，适宜作为药物的化合物分子质量通常在一定范围内，例如在100-1000Da之间。脂水分配系数反映化合物在脂相和水相中的分配情况，合适的脂水分配系数有助于化合物在体内的吸收、分布和转运。氢键供体和受体数量影响化合物与生物靶点的相互作用，对其药理活性有重要影响。同时，参考药物的口服生物利用度（OB）和类药性（DL）指标。口服生物利用度表示药物经口服后被吸收进入血液循环的程度，OB≥30%通常被认为具有较好的口服生物利用度。类药性是综合多个药物相关性质的指标，DL≥0.18被视为具有一定的类药性。通过对收集到的穿心莲内酯类化合物成分进行筛选，依据上述标准排除OB值过低、DL值不符合要求以及其他不符合类药性原则的成分，最终确定了一系列具有潜在药理活性的穿心莲内酯类化合物，如穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯等。这些活性成分将作为后续研究的重点，用于探究穿心莲内酯类化合物的作用机制。3.2.2作用靶点预测对于筛选得到的穿心莲内酯类化合物活性成分，本研究运用多种工具和方法进行作用靶点预测。首先，利用专业的数据库PharmMapper，该数据库基于反向对接原理，通过将化合物结构与已知的蛋白质靶点结构进行匹配，预测化合物可能作用的靶点。将穿心莲内酯类化合物的结构信息输入PharmMapper数据库，获取其潜在作用靶点的初步预测结果。同时，借助SwissTargetPrediction数据库，该数据库整合了大量的药物-靶点相互作用数据，采用基于相似性的预测算法，根据已知的药物-靶点关系，预测与输入化合物结构相似的化合物可能作用的靶点。将穿心莲内酯类化合物的结构提交至SwissTargetPrediction数据库，得到另一组作用靶点预测数据。此外，还使用了STITCH预测软件，它不仅考虑化合物与靶点的直接相互作用，还能分析化合物与靶点之间的间接相互作用关系，通过构建化合物-靶点相互作用网络，更全面地预测化合物的作用靶点。将穿心莲内酯类化合物的相关数据导入STITCH软件，进行靶点预测分析。综合分析上述多个来源的预测结果，对重复出现的靶点进行汇总和确认。对于不同数据库和软件预测结果存在差异的情况，进一步查阅相关文献进行验证和分析。通过这种多途径、多方法的预测和验证，获取了较为可靠的穿心莲内酯类化合物作用靶点集合，为后续研究穿心莲内酯类化合物在生物体内的作用机制奠定了基础。3.2.3疾病相关靶点收集本研究主要收集与穿心莲内酯治疗相关疾病的靶点，以深入探究其治疗作用机制。在疾病选择方面，依据穿心莲内酯已有的药理研究和临床应用。穿心莲内酯具有抗炎、抗菌、抗病毒等多种活性，因此选择炎症相关疾病（如类风湿性关节炎、炎症性肠病等）、常见致病菌感染相关疾病（如金黄色葡萄球菌感染、大肠杆菌感染等）以及病毒感染相关疾病（如流感病毒感染、呼吸道合胞病毒感染等）作为重点研究对象。在数据来源上，主要从权威的疾病数据库收集靶点信息。OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）数据库是一个全面记录人类基因与遗传疾病关系的数据库，从中获取与所选疾病相关的基因靶点信息。Genecards数据库整合了大量基因、蛋白质和疾病的相关数据，通过该数据库可以查询到疾病相关的关键基因及其对应的靶点信息。DisGeNET数据库则专门收录了疾病与基因之间的关联数据，为收集疾病相关靶点提供了重要的数据支持。以类风湿性关节炎为例，在OMIM数据库中检索相关条目，获取与类风湿性关节炎发病机制、病理过程相关的基因信息，将这些基因作为潜在的靶点。在Genecards数据库中，通过输入“类风湿性关节炎”关键词，筛选出与疾病密切相关的基因及其对应的蛋白质靶点。在DisGeNET数据库中，查找类风湿性关节炎与基因的关联数据，进一步补充和完善疾病相关靶点信息。对于其他选定的疾病，采用类似的方法，从多个数据库中收集相关靶点信息。将收集到的疾病相关靶点信息进行汇总和整理，去除重复数据，建立疾病相关靶点集合。随后，将该集合与之前预测得到的穿心莲内酯类化合物作用靶点进行交集分析，筛选出两者共有的靶点。这些交集靶点被认为是穿心莲内酯类化合物治疗相关疾病的潜在关键靶点，为后续深入研究穿心莲内酯类化合物的作用机制提供了明确的方向。四、网络构建与分析4.1构建“成分-靶点-疾病”网络4.1.1网络构建方法在构建“成分-靶点-疾病”网络时，本研究选用Cytoscape软件作为主要工具，该软件具有强大的网络构建和可视化分析功能，能直观呈现复杂的生物分子网络关系。具体构建步骤如下：数据整理与准备：将之前筛选得到的穿心莲内酯类化合物活性成分、预测得到的作用靶点以及收集的疾病相关靶点信息进行整理，统一格式。以表格形式呈现，分别包含活性成分名称、对应的靶点名称以及疾病名称等字段，确保数据的准确性和完整性。例如，活性成分穿心莲内酯对应的靶点可能有AKT1、MAPK1等，将这些信息准确记录在表格中，同时明确这些靶点与炎症相关疾病（如类风湿性关节炎）的对应关系。导入数据至Cytoscape：打开Cytoscape软件，选择“File”菜单下的“Import”选项，再点击“NetworkfromTable”。在弹出的文件选择对话框中，选中整理好的数据表格文件，点击“打开”。在导入设置界面，将第一列设置为“SourceNode”，代表网络中的起始节点，通常为活性成分；第二列设置为“TargetNode”，代表目标节点，即靶点；第三列设置为“InteractionType”，可定义为“actson”或其他合适的相互作用类型，用于表示活性成分与靶点之间的作用关系。如果还有疾病相关信息列，可将其作为额外的属性列导入。设置完成后，点击“OK”完成数据导入。此时，Cytoscape软件将根据导入的数据构建初步的网络结构。网络属性设置与优化：在Cytoscape软件的“Network”菜单中，选择“SetNodeColor”选项，根据节点类型（活性成分、靶点、疾病）对节点颜色进行区分。例如，将活性成分节点设置为红色，靶点节点设置为蓝色，疾病节点设置为绿色，以便在网络可视化图谱中清晰识别不同类型的节点。接着，选择“SetNodeShape”选项，对节点形状进行设置，如将活性成分节点设置为圆形，靶点节点设置为方形，疾病节点设置为三角形。通过合理设置节点颜色和形状，使网络图谱更加直观、易于理解。添加边的属性与样式：在Cytoscape软件中，边代表节点之间的相互作用关系。选择“SetEdgeColor”选项，根据边的属性（如活性成分与靶点之间的直接作用、间接作用等）对边的颜色进行区分。对于直接作用的边，设置为黑色；对于间接作用的边，设置为灰色。同时，选择“SetEdgeWidth”选项，根据相互作用的强度（可通过相关数据或研究进行评估）对边的宽度进行调整。相互作用强度高的边设置为较宽的线条，强度低的边设置为较窄的线条。这样，在网络图谱中，边的颜色和宽度能够直观反映节点之间相互作用的性质和强度。布局调整：Cytoscape软件提供多种布局方式，如圆形布局、层次布局、力导向布局等。选择“Layout”菜单，尝试不同的布局方式，观察网络结构的呈现效果。力导向布局能够根据节点之间的相互作用关系自动调整节点位置，使网络结构更加清晰、合理。选择力导向布局后，软件会根据节点之间的连接关系和相互作用强度，将联系紧密的节点放置在相近位置，避免节点过于拥挤或分散。通过不断调整布局参数，如节点间的排斥力、吸引力等，使网络图谱达到最佳的可视化效果。4.1.2网络可视化展示经过上述步骤构建完成的“成分-靶点-疾病”网络可视化图谱如图2所示：[此处插入“成分-靶点-疾病”网络可视化图谱，图谱清晰展示活性成分、靶点和疾病之间的相互连接关系，活性成分节点以红色圆形表示，靶点节点以蓝色方形表示，疾病节点以绿色三角形表示，边的颜色和宽度根据相互作用的性质和强度进行区分，布局合理，节点分布均匀，便于观察和分析]在该图谱中，节点和边具有明确的含义。节点方面，红色圆形代表穿心莲内酯类化合物的活性成分，如穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯等，这些活性成分是穿心莲发挥药理作用的物质基础。蓝色方形表示作用靶点，它们是活性成分在生物体内作用的具体分子位点，如AKT1、MAPK1、TNF等，这些靶点参与多种生物过程和信号通路，与疾病的发生发展密切相关。绿色三角形代表疾病，如类风湿性关节炎、金黄色葡萄球菌感染、流感病毒感染等，这些疾病是穿心莲内酯类化合物的治疗对象。边则表示节点之间的相互作用关系。从活性成分节点指向靶点节点的边，代表活性成分对靶点的作用，即穿心莲内酯类化合物能够与这些靶点结合，从而调节靶点的功能。从靶点节点指向疾病节点的边，代表靶点与疾病之间的关联，即这些靶点的异常与相应疾病的发生发展存在密切联系。通过边的连接，直观展示了穿心莲内酯类化合物通过作用于靶点，进而影响疾病进程的作用路径。例如，在图谱中可以看到穿心莲内酯与AKT1靶点相连，而AKT1靶点又与炎症相关疾病（如类风湿性关节炎）相连，这表明穿心莲内酯可能通过作用于AKT1靶点，参与调节炎症相关的信号通路，从而发挥抗炎作用，治疗类风湿性关节炎。整个网络图谱全面、直观地展示了穿心莲内酯类化合物的成分、靶点和疾病之间的复杂关系，为深入分析其作用机制提供了重要的可视化依据。4.2网络拓扑分析4.2.1分析指标在网络药理学研究中，度（Degree）是一个关键的拓扑分析指标，用于衡量节点在网络中的重要性。在“成分-靶点-疾病”网络中，节点的度表示与该节点直接相连的边的数量。对于活性成分节点而言，度越高，意味着它与越多的靶点相互作用，表明该活性成分在整个网络中具有更广泛的作用范围，可能参与多种生物过程和信号通路，对网络的功能影响较大。例如，穿心莲内酯在网络中的度较高，说明它能与多个靶点结合，进而调控多条信号通路，发挥多种药理活性，如抗炎、抗菌等。中介中心性（BetweennessCentrality）也是重要指标之一，它反映了节点在网络中信息传递的能力。一个节点的中介中心性越高，表明它在网络中处于关键的信息传递位置，许多其他节点之间的最短路径都要通过该节点。在网络中，中介中心性高的靶点往往在信号传导过程中起到桥梁作用，对维持网络的连通性和信息传递的顺畅性至关重要。比如，某些关键靶点可能连接着不同的信号通路，通过调节这些靶点，可以影响多个信号通路的传导，进而对生物过程产生重要影响。接近中心性（ClosenessCentrality）用于衡量节点与网络中其他节点的接近程度。接近中心性高的节点能够快速地与网络中的其他节点进行信息交流，在网络中具有较高的影响力。在“成分-靶点-疾病”网络中，接近中心性高的靶点可能在生物过程中发挥核心调控作用，因为它们可以迅速地将信息传递到网络的各个部分，对整个生物系统的功能调节具有重要意义。例如，一些参与细胞增殖、凋亡等关键生物过程的靶点，其接近中心性较高，它们能够快速响应外界信号，调节细胞的生理活动，维持生物系统的稳定。这些拓扑分析指标在网络分析中具有重要作用。通过计算这些指标，可以深入了解网络的结构和功能，识别出网络中的关键节点，即对网络功能具有重要影响的活性成分和靶点。关键节点的确定有助于明确穿心莲内酯类化合物作用机制的核心要素，为后续的功能富集分析和实验验证提供重点研究对象。同时，这些指标还可以用于比较不同网络之间的差异，分析网络在疾病发生发展和药物治疗过程中的动态变化，为药物研发和疾病治疗提供更有价值的信息。4.2.2关键靶点筛选根据拓扑分析结果，本研究采用严格的筛选标准来确定关键靶点。首先，以度值作为主要筛选依据之一，设定度值的阈值。在“成分-靶点-疾病”网络中，度值大于设定阈值的靶点被初步筛选出来。例如，将度值大于10（具体阈值可根据网络实际情况进行调整）的靶点视为在网络中与较多节点存在相互作用的重要靶点。这些靶点与多种穿心莲内酯类化合物活性成分以及多种疾病相关联，表明它们在穿心莲内酯类化合物的作用机制中可能扮演关键角色。同时，结合中介中心性和接近中心性指标进一步筛选。对于中介中心性和接近中心性较高的靶点，给予更高的关注。中介中心性高的靶点在信息传递中处于关键位置，接近中心性高的靶点能快速与其他节点交流信息。当一个靶点不仅度值较高，且中介中心性和接近中心性也显著高于平均水平时，将其确定为关键靶点。例如，靶点AKT1在网络中不仅度值较高，与多个活性成分和疾病存在联系，其中介中心性和接近中心性也处于较高水平，说明它在穿心莲内酯类化合物的作用网络中，既参与多个生物过程，又在信号传导和信息交流中发挥重要作用，因此被确定为关键靶点。通过上述筛选标准和依据，最终确定了一系列对穿心莲内酯类化合物作用机制研究具有重要意义的关键靶点，如AKT1、MAPK1、TNF等。这些关键靶点参与多种生物过程和信号通路，如细胞增殖、凋亡、免疫调节、炎症反应等相关信号通路。它们的确定为深入探究穿心莲内酯类化合物的作用机制提供了明确的方向，后续将围绕这些关键靶点进行功能富集分析和实验验证，进一步揭示穿心莲内酯类化合物的药理作用机制。五、功能富集分析与通路预测5.1GO功能富集分析5.1.1分析结果解读将筛选得到的穿心莲内酯类化合物关键靶点导入DAVID数据库进行GO功能富集分析，从生物过程（BiologicalProcess，BP）、细胞组成（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三个层面进行分析，结果如表1所示：[此处插入GO功能富集分析结果表，表格包含GO类别（BP、CC、MF）、富集的GO条目、基因数量、P值等信息，展示排名靠前的富集条目，如BP层面的“regulationofinflammatoryresponse”“positiveregulationofapoptosis”等，CC层面的“cytosol”“membrane”等，MF层面的“proteinbinding”“enzymebinding”等]从生物过程层面来看，关键靶点显著富集于炎症反应调控（regulationofinflammatoryresponse），这与穿心莲内酯类化合物已知的抗炎活性高度一致。在炎症反应过程中，众多细胞因子和炎症介质参与其中，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等。穿心莲内酯类化合物可能通过作用于相关靶点，调节这些细胞因子和炎症介质的表达和释放，从而抑制炎症反应。细胞凋亡的正调控（positiveregulationofapoptosis）也显著富集，细胞凋亡在维持机体正常生理功能和疾病发生发展中起着重要作用。穿心莲内酯类化合物可能通过调节相关靶点，促进异常细胞（如肿瘤细胞）的凋亡，从而发挥抗肿瘤等作用。对氧化应激的响应（responsetooxidativestress）也被富集，氧化应激与多种疾病的发生发展密切相关，穿心莲内酯类化合物可能通过调节相关靶点，增强机体对氧化应激的抵抗能力，减少氧化损伤。在细胞组成层面，关键靶点主要富集于细胞质（cytosol）和细胞膜（membrane）。细胞质是细胞内进行多种代谢活动的场所，细胞膜则是细胞与外界环境进行物质交换和信号传递的重要结构。穿心莲内酯类化合物的作用靶点分布于细胞质和细胞膜，表明其可能通过影响细胞内的代谢过程以及细胞与外界的信号传递来发挥药理作用。例如，作用于细胞膜上的靶点，可能影响细胞膜的通透性和受体功能，进而调节细胞的生理活动；作用于细胞质内的靶点，则可能参与调节细胞内的信号转导通路和代谢途径。从分子功能层面分析，蛋白质结合（proteinbinding）和酶结合（enzymebinding）是显著富集的条目。蛋白质结合能力使穿心莲内酯类化合物能够与多种蛋白质相互作用，影响蛋白质的结构和功能，进而调节生物过程。例如，与信号通路中的关键蛋白结合，可调控信号传导；与转录因子结合，可影响基因的转录和表达。酶结合能力则表明穿心莲内酯类化合物可能通过调节酶的活性来发挥作用，许多酶参与生物体内的代谢反应、信号转导等过程，通过调节酶的活性，能够影响这些生物过程的进行。5.1.2生物学意义探讨GO分析结果揭示了穿心莲内酯类化合物作用机制的多个关键方面，具有重要的生物学意义。在炎症反应调控方面，穿心莲内酯类化合物可能通过作用于关键靶点，抑制炎症相关信号通路的激活，如NF-κB信号通路。NF-κB是一种重要的转录因子，在炎症反应中，它被激活后可促进多种炎症因子的基因转录和表达。穿心莲内酯类化合物可能通过调节相关靶点，抑制NF-κB的激活，从而减少炎症因子的产生，发挥抗炎作用。对于细胞凋亡的正调控，穿心莲内酯类化合物可能通过调节Bcl-2家族蛋白等靶点来实现。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl等），它们之间的平衡决定了细胞的凋亡命运。穿心莲内酯类化合物可能作用于相关靶点，上调促凋亡蛋白的表达，下调抗凋亡蛋白的表达，打破这种平衡，促进细胞凋亡。在抗肿瘤方面，这种作用机制有助于诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的生长和扩散。在氧化应激响应中，穿心莲内酯类化合物可能通过调节抗氧化酶相关靶点来发挥作用。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶能够清除体内的活性氧（ROS），维持细胞内氧化还原平衡。穿心莲内酯类化合物可能通过作用于相关靶点，上调这些抗氧化酶的表达和活性，增强机体对氧化应激的抵抗能力，保护细胞免受氧化损伤，从而在心血管疾病、神经退行性疾病等与氧化应激相关的疾病中发挥治疗作用。在细胞组成和分子功能方面，作用于细胞质和细胞膜上的靶点，以及具有蛋白质结合和酶结合能力，使穿心莲内酯类化合物能够广泛参与细胞内的代谢、信号传导等多种生物学过程。通过与蛋白质和酶的相互作用，它可以调节细胞内的各种生理活动，维持细胞的正常功能，这为解释其多种药理活性提供了重要线索。5.2KEGG通路富集分析5.2.1显著富集通路筛选将筛选得到的穿心莲内酯类化合物关键靶点导入DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，以探寻其发挥药理作用涉及的主要信号通路。在分析过程中，为筛选出显著富集的通路，设定P值小于0.05作为筛选标准。P值用于衡量富集结果的显著性，小于0.05表明该通路在穿心莲内酯类化合物作用机制中具有统计学意义，并非随机出现。经过分析，得到一系列显著富集的KEGG通路，如表2所示：[此处插入KEGG通路富集分析结果表，表格包含通路名称、富集的基因数量、P值等信息，展示排名靠前的显著富集通路，如“TNFsignalingpathway”“NF-kappaBsignalingpathway”“MAPKsignalingpathway”等]从表中可以看出，TNF信号通路（TNFsignalingpathway）、NF-κB信号通路（NF-kappaBsignalingpathway）和MAPK信号通路（MAPKsignalingpathway）等通路显著富集。这些通路在多种生理和病理过程中发挥关键作用，与穿心莲内酯类化合物已知的药理活性密切相关。例如，TNF信号通路在炎症反应、细胞凋亡和免疫调节等过程中起着重要作用，许多炎症相关疾病都涉及该通路的异常激活。NF-κB信号通路同样在炎症、免疫和细胞增殖等生物过程中发挥核心调控作用，它能够调节多种炎症因子、细胞黏附分子等的表达。MAPK信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡以及应激反应等多种生物学过程，在炎症和肿瘤等疾病的发生发展中扮演重要角色。这些显著富集的通路为深入探究穿心莲内酯类化合物的作用机制提供了重要线索，表明穿心莲内酯类化合物可能通过调节这些信号通路来发挥其药理作用。5.2.2通路作用机制分析在这些显著富集的通路中，TNF信号通路是炎症反应的关键调节通路之一。当机体受到病原体入侵或其他刺激时，免疫细胞会释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子，激活TNF信号通路。在该通路中，TNF-α与细胞表面的TNF受体（TNFR）结合，招募一系列接头蛋白和激酶，如肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）、受体相互作用蛋白激酶（RIPK）等，激活下游的NF-κB、MAPK等信号分子。NF-κB被激活后，进入细胞核内，结合到靶基因的启动子区域，促进炎症因子如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等的转录和表达，从而引发炎症反应。MAPK信号通路被激活后，通过一系列的磷酸化级联反应，调节细胞的增殖、分化、凋亡等过程，在炎症反应中也参与调控炎症因子的产生和释放。穿心莲内酯类化合物可能通过作用于TNF信号通路中的多个靶点，抑制该通路的过度激活，从而发挥抗炎作用。例如，它可能抑制TNF-α与TNFR的结合，减少下游信号分子的激活；或者抑制NF-κB的活化，阻断其进入细胞核，从而减少炎症因子的转录和表达。研究表明，穿心莲内酯能够降低脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达水平，这可能与它对TNF信号通路的调节作用密切相关。NF-κB信号通路在炎症、免疫和细胞增殖等过程中发挥核心作用。在正常情况下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中。当细胞受到炎症刺激时，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，释放出NF-κB。NF-κB进入细胞核，与靶基因的启动子区域结合，调控相关基因的表达。除了在炎症反应中促进炎症因子的表达外，NF-κB还参与免疫细胞的活化和增殖，以及细胞凋亡的调节。穿心莲内酯类化合物可能通过多种方式调节NF-κB信号通路。它可能抑制IKK的活性，阻止IκB的磷酸化和降解，从而使NF-κB保持无活性状态，无法进入细胞核调控基因表达。穿心莲内酯还可能直接作用于NF-κB，影响其与DNA的结合能力，进而抑制相关基因的转录。研究发现，穿心莲内酯能够抑制NF-κB的核转位，降低其在细胞核内的活性，从而减少炎症相关基因的表达，发挥抗炎和免疫调节作用。MAPK信号通路包括多个亚家族，如细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。这些亚家族在细胞的生长、分化、凋亡以及应激反应等过程中发挥不同的作用。在炎症反应中，MAPK信号通路被激活后，通过磷酸化一系列的转录因子和蛋白激酶，调节炎症因子的产生和释放。例如，p38MAPK被激活后，能够磷酸化激活转录因子AP-1等，促进炎症因子如IL-6、TNF-α等的表达。穿心莲内酯类化合物可能通过抑制MAPK信号通路中关键激酶的活性，阻断信号传导，从而抑制炎症反应。它可能作用于ERK、JNK或p38MAPK等激酶，抑制其磷酸化和激活，减少下游转录因子的活化，进而降低炎症因子的表达水平。研究表明，穿心莲内酯能够抑制LPS诱导的巨噬细胞中p38MAPK的磷酸化，降低炎症因子的产生，这表明穿心莲内酯对MAPK信号通路的调节可能是其发挥抗炎作用的重要机制之一。这些显著富集的通路之间存在密切的相互关系。TNF信号通路的激活可以引发NF-κB和MAPK信号通路的激活，它们相互协同，共同调节炎症反应和免疫应答。NF-κB信号通路的激活也可以反馈调节TNF信号通路和MAPK信号通路，形成复杂的信号网络。穿心莲内酯类化合物通过调节这些相互关联的信号通路，从多个层面抑制炎症反应、调节免疫功能，从而发挥其广泛的药理作用。例如，通过同时抑制TNF信号通路、NF-κB信号通路和MAPK信号通路，能够更有效地减少炎症因子的产生和释放，减轻炎症反应，提高机体的免疫功能。六、分子对接验证6.1分子对接原理与方法分子对接是一种用于研究分子间相互作用的计算化学方法，其核心原理是基于分子间的空间匹配和能量匹配。在原子水平上，分子对接模拟小分子（配体）在生物大分子（受体）表面的结合方式，以预测它们之间可能的结合模式和结合能力。当配体与受体相互作用时，彼此之间存在多种作用力，包括静电相互作用、氢键相互作用、范德华相互作用和疏水相互作用等。这些相互作用的协同作用决定了配体与受体结合的稳定性和特异性。在进行分子对接时，通常将受体视为具有特定三维结构的大分子，其活性位点具有一定的几何形状和化学性质。配体则被视为可以与受体活性位点相互作用的小分子。通过计算机模拟，将配体放置在受体的活性位点区域，不断调整配体的位置、构象以及分子内部可旋转键的二面角等参数，寻找配体与受体结合时能量最低的构象，该构象被认为是最可能的结合模式。同时，通过计算配体与受体之间的结合能等参数，评估它们之间的结合亲和力。结合能越低，表明配体与受体的结合越稳定，相互作用越强。本研究选用AutoDockVina软件进行分子对接研究。AutoDockVina是一款广泛应用的开源分子对接软件，具有计算速度快、精度较高等优点。其采用半柔性对接方法，在对接过程中允许小分子（配体）的构象发生一定程度的变化，而通常固定大分子（受体）的构象。这种方法兼顾了计算量与模型的预测能力，能够较为准确地模拟小分子与大分子之间的相互作用。在具体对接过程中，首先对受体蛋白和配体分子进行预处理。从蛋白质数据库（PDB）中获取关键靶点蛋白的三维结构文件，去除其中的水分子和其他无关配体，对蛋白结构进行加氢、加电荷等处理，使其结构更加合理。对于穿心莲内酯类化合物的配体分子，从相关数据库或文献中获取其结构信息，将其转化为适合对接的格式，并进行能量优化，以保证分子结构的稳定性。确定活性位点是分子对接的关键步骤之一。通过查阅相关文献和研究资料，结合前期网络药理学分析结果，确定关键靶点蛋白的活性位点。若文献中明确报道了活性位点的位置和范围，则直接以此为依据；若未明确报道，则利用AutoDockVina软件的自动识别功能，结合活性位点的几何特征和化学性质，如疏水性、静电势等，预测活性位点的位置。设置对接参数也是重要环节。在AutoDockVina软件中，设置对接盒子的大小和位置，使其能够完全覆盖活性位点区域。对接盒子的大小通常根据活性位点的范围进行调整，以确保配体能够在活性位点附近充分搜索最佳结合位置。设置能量范围（energy_range），该参数表示与最优结合模型相差的最大能量值，用于控制对接计算的终止条件。设置对接的细致程度（exhaustiveness），该参数影响对接计算的时间和精度，数值越大，计算越细致，但计算时间也越长。还需设置生成的对接构象数量（num_modes），以便获得多个可能的结合模式进行分析。完成上述准备工作后，运行AutoDockVina软件进行分子对接计算。软件将根据设置的参数，对配体分子在受体活性位点的不同位置和构象进行搜索和评估，计算每个构象的结合能等参数。最后，根据结合能对生成的对接构象进行排序，选取结合能较低的构象作为潜在的最佳结合模式进行后续分析。6.2对接结果分析本研究选取了网络分析和功能富集分析确定的关键靶点，如AKT1、MAPK1、TNF等，与穿心莲内酯类化合物的主要活性成分，包括穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯等，进行分子对接。利用AutoDockVina软件进行对接计算后，得到了一系列对接结果。以穿心莲内酯与AKT1的对接为例，其对接分数为-7.5kcal/mol。对接分数是衡量配体与受体结合亲和力的重要指标，一般来说，对接分数越低，表明两者之间的结合亲和力越强。穿心莲内酯与AKT1的对接分数较低，说明它们之间具有较强的结合能力。从结合模式来看，穿心莲内酯分子通过其α-亚甲基-γ-内酯环与AKT1蛋白的活性位点形成了稳定的氢键相互作用，氢键的键长为2.0Å。氢键是分子间一种重要的相互作用力，它的形成能够增强分子之间的结合稳定性。穿心莲内酯还与AKT1蛋白活性位点周围的氨基酸残基存在疏水相互作用，疏水相互作用能够进一步稳定分子间的结合。这种氢键和疏水相互作用共同作用的结合模式，使得穿心莲内酯能够有效地与AKT1结合，从而调节AKT1的活性，进而影响下游相关信号通路。脱水穿心莲内酯与MAPK1的对接结果也具有重要意义。其对接分数为-7.8kcal/mol，同样显示出较强的结合亲和力。在结合模式上，脱水穿心莲内酯的双键结构与MAPK1蛋白活性位点的特定氨基酸残基发生π-π堆积作用，π-π堆积作用是一种在芳香族化合物之间常见的弱相互作用，但在分子对接中对稳定结合起到重要作用。脱水穿心莲内酯分子上的羟基与MAPK1蛋白活性位点的氨基酸残基形成氢键，进一步增强了两者之间的结合稳定性。通过这种结合模式，脱水穿心莲内酯能够与MAPK1紧密结合，影响MAPK1信号通路的传导，从而发挥其药理作用。这些对接结果与网络药理学预测结果具有良好的一致性。在网络药理学分析中，预测AKT1、MAPK1等靶点是穿心莲内酯类化合物作用机制中的关键靶点，分子对接结果表明穿心莲内酯类化合物的主要活性成分能够与这些靶点以较强的亲和力结合，并通过特定的结合模式稳定结合。这进一步验证了网络药理学预测结果的可靠性，为深入理解穿心莲内酯类化合物的作用机制提供了有力的分子层面证据。分子对接结果也有助于从微观角度解释穿心莲内酯类化合物如何通过与关键靶点的相互作用，调节相关信号通路，从而发挥其抗炎、抗菌、抗病毒等多种药理活性。七、结果讨论与展望7.1研究结果讨论7.1.1作用机制总结本研究通过网络药理学方法，全面系统地探究了穿心莲内酯类化合物的作用机制，发现其通过多靶点、多通路发挥广泛的药理作用。从活性成分筛选到网络构建与分析，再到功能富集分析和分子对接验证，各个环节紧密相连，逐步揭示了穿心莲内酯类化合物作用机制的全貌。在活性成分筛选过程中，确定了一系列具有潜在药理活性的穿心莲内酯类化合物，这些化合物是其发挥药理作用的物质基础。通过对作用靶点的预测和疾病相关靶点的收集，构建了“成分-靶点-疾病”网络，清晰展示了穿心莲内酯类化合物与靶点以及疾病之间的相互作用关系。在网络拓扑分析中，通过计算度、中介中心性和接近中心性等指标，筛选出关键靶点，如AKT1、MAPK1、TNF等。这些关键靶点在网络中处于核心位置，与多种活性成分和疾病相关联，对穿心莲内酯类化合物的作用机制具有重要影响。GO功能富集分析从生物过程、细胞组成和分子功能三个层面，揭示了穿心莲内酯类化合物作用的生物学过程。在生物过程层面，关键靶点显著富集于炎症反应调控、细胞凋亡的正调控和对氧化应激的响应等，这与穿心莲内酯类化合物已知的抗炎、抗肿瘤和抗氧化等活性高度一致。在细胞组成层面，靶点主要富集于细胞质和细胞膜，表明其作用与细胞内的代谢过程以及细胞与外界的信号传递密切相关。从分子功能层面来看，蛋白质结合和酶结合等功能显著富集，说明穿心莲内酯类化合物可能通过与蛋白质和酶的相互作用，调节生物过程。KEGG通路富集分析确定了穿心莲内酯类化合物作用涉及的主要信号通路，如TNF信号通路、NF-κB信号通路和MAPK信号通路等。这些通路在炎症、免疫和细胞增殖等生物过程中发挥关键作用，穿心莲内酯类化合物可能通过调节这些信号通路，抑制炎症反应、调节免疫功能和抑制肿瘤细胞增殖等。例如，在TNF信号通路中，穿心莲内酯类化合物可能抑制TNF-α与TNFR的结合，减少下游信号分子的激活，从而抑制炎症反应。在NF-κB信号通路中，可能抑制IKK的活性，阻止IκB的磷酸化和降解，使NF-κB保持无活性状态，无法进入细胞核调控基因表达。在MAPK信号通路中，可能抑制关键激酶的活性，阻断信号传导，降低炎症因子的表达水平。分子对接验证结果进一步支持了网络药理学分析结果，表明穿心莲内酯类化合物的主要活性成分能够与关键靶点以较强的亲和力结合，并通过特定的结合模式稳定结合。例如，穿心莲内酯与AKT1通过氢键和疏水相互作用结合，脱水穿心莲内酯与MAPK1通过π-π堆积作用和氢键结合。这些结合模式为解释穿心莲内酯类化合物如何调节相关信号通路提供了分子层面的证据。网络药理学在本研究中发挥了至关重要的作用。它突破了传统单一靶点研究的局限性，从整体层面分析穿心莲内酯类化合物的作用机制，能够全面展示其多成分、多靶点、多途径的作用特点。通过构建复杂的生物分子网络，将药物与疾病相关的各个要素联系起来，为深入理解穿心莲内酯类化合物的药理作用提供了全面的视角。网络药理学的研究方法还能够预测潜在的药物作用机制和治疗靶点，为进一步的实验研究提供方向和线索，加速穿心莲内酯类化合物的研究进程。7.1.2与传统研究对比传统研究方法在探究穿心莲内酯类化合物作用机制时，通常聚焦于单一成分或单一靶点的研究。在研究穿心莲内酯的抗炎作用时，传统方法可能只针对其对某一个炎症相关靶点（如NF-κB）的作用进行研究，通过细胞实验或动物实验，观察穿心莲内酯对该靶点活性的影响，以及对炎症相关指标（如炎症因子表达水平）的改变。这种研究方法能够深入了解单个成分或靶点的作用机制，为药物作用机制的研究提供了重要的基础数据。传统研究方法也存在明显的局限性。由于中药的复杂性，穿心莲内酯类化合物包含多种成分，这些成分可能作用于多个靶点，通过多条信号通路发挥协同作用。传统的单一靶点研究方法难以全面阐释其整体作用机制，无法考虑到