5年（2021-2025）山东高考生物真题分类汇编：专题17 基因工程（原卷版）

专题17基因工程

五年考情考情分析

基因工程2025年山东卷第25题近五年山东高考生物试卷，基因工程考点

2024年山东卷第13题考查频繁。重点考查基因工程的基本工具，如

2024年山东卷第25题限制酶、DNA连接酶；基本操作程序，像目

2023年山东卷第25题的基因获取、表达载体构建等，常结合实际案

2022年山东卷第13题例，考查学生知识运用与分析能力。题目难度

2022年山东卷第25题系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、

2021年山东卷第13题报告基因的表达等都需要学生有很强的理解

2021年山东卷第25题信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解

决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因

工程考查学生的结构与功能观。

一、单选题

1．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（）

A．整个提取过程中可以不使用离心机

B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中

C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变

D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰

2．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（）

A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解

B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀

C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色

D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质

3．（2021·山东·高考真题）粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，

过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出

DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（）

A．加入适量的木瓜蛋白酶

B．37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟

C．加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精

D．加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0．14mol/L

二、解答题

4．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用

农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基

因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息

已知。

(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为。选用图甲中的SmaI对抗除草

剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端

补平，补平时使用的酶是。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段

与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取

质粒后再选用限制酶进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较

短的条带长度近似为bp，则一定为正向重组质粒。

(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组

DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR

难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，

且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段，才能利用引物P1和P2

成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片

段的未知序列是否属于同一个基因的操作为（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比

对”）。

(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生

型基因，（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。

5．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。

利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插

入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性

结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图

所示。

(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越

（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI

酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有种。载体信息如图甲所示，

经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'--3'和5'--3'。

(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素筛选到具有该抗生素抗性的植株

①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标

基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如

图丙所示。据图可判断选用的限制酶是，其中纯合的突变植株是（填序号）。

(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细

胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯

合且对抗生素敏感的植株所占比例为，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。

6．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，

该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。

(1)与图甲中启动子结合的酶是。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还

需具备的结构有（答出2个结构即可）。

(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若

仅用一对引物，应选择图甲中的引物。已知J基因转录的模板链位于b链，由

此可知引物F1与图甲中J基因的（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。

(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否

表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了，条

带2所检出的蛋白（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。

7．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识

别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机

理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，

FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，

但不影响P或P△的功能。

(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物

需满足的条件是、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识

别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的（填“3'端”或“5'端”）。

(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，

如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合

基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因

对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是。修改扩增P基因

时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是。

(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式

分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用

UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③

组结果的差异推测，药物A的作用是；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的

特定序列的作用是。

(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是。

8．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，

该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ

基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长

度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结

合位点的具体位置。相关信息如图所示。

（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识

别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是，在R末端添加的

序列所对应的限制酶是。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要

种酶。

（2）将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩

增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。

含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是。

（3）向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而

含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应

的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位

于，理由是。

一、单选题

1．（2025·山东潍坊·三模）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR

产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。

下列说法错误的是（）

A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA

B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系

C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物

D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4

2．（2025·山东临沂·三模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”

实验的叙述，错误的是（）

A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能

B．提取到的白色丝状物直接与一定浓度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后变蓝

C．电泳实验中待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳

D．琼脂糖凝胶中加入核酸染料，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物

3．（2025·山东济南·二模）毕赤酵母是一种能直接利用甲醇的微生物，其含有的醇氧化酶基

因(AOX1)强效启动子在甲醇存在时被激活，可以驱动外源基因的高效表达。人体蛋白

MT1-MMP定位在细胞膜上，并在多种肿瘤中被高表达出，MT1-MMP能促进肿瘤转移。为

进一步研究肿瘤转移机制，科研人员将MT1-MMP基因转化至毕赤酵母，先将转基因个体

进行低密度发酵，然后再进行高密度发酵，最终获得目标蛋白。下列相关说法正确的是（）

A．转基因毕赤酵母和大肠杆菌作为发酵菌种都具有发酵周期短的优点

B．目标蛋白的产量受发酵培养基成分、甲醇、温度、pH的影响

C．可将MT1-MMP基因插入AOX1中以便通过甲醇调控基因表达

D．甲醇的作用是作为碳源和氮源以及诱导目标蛋白的表达

4．（2025·山东青岛·二模）CRISPR/Cas9系统包含向导RNA（gRNA）和核酸酶Cas9，可以

对哺乳动物细胞进行基因组编辑。编辑时，Cas9蛋白在gRNA的引导下，结合基因组的特

定位点并进行切割。科研人员利用图中gRNA和Cas9共表达质粒，对体外培养的小鼠细胞

中A基因的表达进行调控。下列说法错误的是（）

A．可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码gRNA序列

B．编码gRNA的序列需要整合到受体细胞基因组DNA上才能发挥作用

C．导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞

D．用抗原—抗体杂交技术检测结果为部分细胞A蛋白表达量降低

5．（2025·山东济南·二模）单亲二体(UPD)是指体细胞中某对同源染色体来自同一亲本，其

它染色体组成正常的个体，其染色体组成是2n。微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，

重复次数和分布个数因染色体而异，可以随染色体稳定地遗传给下一代。可使用STR检测

技术对UPD进行诊断：先在各条染色体上找到STR区域，在STR区域的两侧设计PCR引

物，每对引物当中有一条是带荧光标记的，在同一体系中进行PCR得到带有不同荧光标记

的扩增产物，经电泳后被检测到，然后进行比对、确认。下列说法错误的是（）

A．同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同

B．用含有核酸染料的载样缓冲液来鉴定扩增得到的PCR产物

C．UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递

D．检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD

6．（2025·山东青岛·二模）为能快速找到特定抗原的高亲和力抗体，研究者构建抗体文库。

从免疫后动物的特定细胞中提取总mRNA，反转录成cDNA，经PCR扩增后，构建重组载

体，再把重组载体转化到宿主细胞，形成含不同抗体基因的细胞集合，即抗体文库。下列说

法错误的是（）

A．“特定细胞”是B淋巴细胞

B．反转录出的cDNA全部是抗体基因

C．基因需要定向插入启动子和终止子中间才能表达

D．抗体分布在宿主细胞表面有利于进行抗体筛选

7．（2025·山东青岛·二模）DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以

超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；

开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是

（）

A．电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物

B．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔

C．电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈蓝色

D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同

8．（2025·山东青岛·二模）微生物底盘细胞是指经过基因工程改造、用于高效表达目标蛋白

的宿主细胞系统。利用合成生物学相关技术对底盘细胞进行遗传及代谢途径改造，可以构建

出较为理想的细胞工厂，具体流程见图。研究者已用毕赤酵母作为底盘细胞来生产次生代谢

产物萜类物质。下列说法错误的是（）

A．毕赤酵母生产的萜类物质是酵母生长所必需的物质

B．某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因

C．去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达

D．选择大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性

9．（2025·山东济南·二模）农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后，会开启其侵染过程，胞

内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列，切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通

道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白(VIP1-P)激活抗病相

关基因的表达。同时，农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化

且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备。下列说法正确的是（）

A．V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程主要由线粒体供能

B．VF降低了植物的抗菌能力并促进了T-DNA与染色体DNA的整合

C．T-DNA与VF借助细胞膜上的蛋白质通过胞吞进入细胞

D．农杆菌侵染进入植物细胞的过程未涉及氢键、磷酸二酯键的断裂与形成

10．（2025·山东泰安·三模）关于“DNA的粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实

验，下列说法正确的是（）

A．将过滤的洋葱研磨液低温放置几分钟，取沉淀物备用

B．在白色丝状物中加入二苯胺试剂即可出现蓝色

C．根据待分离DNA片段的大小，用扩增缓冲液配制成琼脂糖溶液

D．加样孔要留出一个孔加入指示分子大小的标准参照物

11．（2025·山东菏泽·二模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴

定”实验的叙述，错误的是（）

A．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl溶液

B．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液

中

C．在凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关

D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子的结合，便于在紫外灯下观察

12．（2025·山东日照·二模）PCR和琼脂糖凝胶电泳是基因工程中常用的两种技术，下列对

其中所用试剂和操作的说法正确的是（）

A．PCR所用微量离心管、微量移液器、枪头都要进行高压蒸汽灭菌

B．PCR扩增前，应根据待扩增DNA片段的长度设置合适的延伸温度

C．需将扩增得到的PCR产物与内含核酸染料的缓冲液混合后进行加样

D．DNA分子较大时，可适当降低凝胶浓度来提高DNA分子的迁移速率

13．（2025·山东泰安·二模）染色体上的端粒DNA由短的串联重复序列组成，同种生物的该

序列相同。少数缺乏端粒酶活性的肿瘤细胞可通过端粒延长替代机制（ALT）维持端粒长度。

ALT机制如下：第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延

伸；随后①链脱离，在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形

式。这个过程可被重复数十次，使得序列信息从一个端粒传递到另一端粒上。下列说法错误

的是（）

A．①链的延伸过程以②链作为模板，该过程不需要合成引物

B．DNA聚合酶只能从核酸片段3′端延伸，这导致端粒DNA5′端比3′端短

C．进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高

D．非同源染色体间通过ALT机制实现了基因重组，增加了遗传的多样性

14．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，

研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（）

A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板

B．为连入GUS基因，需用SalI和SphI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒

C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞

D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果

15．（2025·山东潍坊·一模）提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性，拟核

DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留

在上清液中。下列说法错误的是（）

A．DNA变性过程中会发生氢键的断裂

B．提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶

C．将提取液中的质粒加乙醇析出后，可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中

D．通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度越高

16．（2025·山东枣庄·二模）采用焦磷酸光化测序法进行DNA测序的原理是：将待测DNA

链固定到一个磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴（乳滴）中，在该乳滴里进行独立的

DNA复制，四种脱氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的顺序一个一个进入该乳滴，如果发生

碱基配对，就会释放一个焦磷酸（PPi），PPi经过一系列酶促反应后发出荧光。下列说法错

误的是（）

A．脱氧核苷三磷酸通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端

B．PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能

C．当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G

D．若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，可大大提高DNA测序的效率

17．（2025·山东枣庄·二模）下列与DNA有关的实验，说法正确的是（）

A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后不能用离心法收集

B．PCR缓冲液中Mg2+作用是激活DNA聚合酶，浓度越高，酶活性越大

C．DNA电泳指示剂需要加入到熔化之后凝固之前的琼脂糖中

D．DNA电泳指示剂的作用主要用来指示何时停止电泳

18．（2025·山东济南·一模）依赖解旋酶DNA等温（65℃）扩增技术可实现体外扩增DNA

分子。利用解旋酶将DNA双链在恒温下解开，在DNA聚合酶的作用下形成子链的过程如

图所示。下列说法错误的是（）

A．推测图中1为DNA聚合酶，2为解旋酶

B．DNA单链结合蛋白的直接作用是使复制双向进行

C．解旋酶的作用是破坏氢键

D．该技术中每次循环包括解旋、复性、延伸三个过程

19．（2025·山东青岛·一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐

敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将野生大豆的SAMS基因转入水稻细

胞内，从而培养出转基因水稻株系，具体过程如图。下列说法错误的是（）

A．图示过程中发生了两次转化

B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基

C．Ⅰ中的筛选可使用PCR技术

D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力

20．（2025·山东青岛·一模）我国科学家敲除猪的糖抗原合成基因（β4GalNT2），转入相应的

调节基因后，将基因编辑猪的单个肾移植给猕猴，同时切除猕猴的自体双肾，最终移植肾存

活184天。在移植成功5个月内，猕猴的移植肾功能完全正常，之后出现逐渐加重的蛋白尿。

下列说法正确的是（）

A．基因编辑猪的成功体现了动物细胞的全能性

B．出现蛋白尿的原因主要是肾小管细胞凋亡导致

C．猪和猕猴肾脏的差异体现了基因的选择性表达

D．敲除β4GalNT2能改变膜蛋白种类，降低免疫排斥反应

21．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（）

A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶

B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链

C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加

D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物

22．（2025·山东青岛·一模）已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合

形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传

稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复

活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损

伤单链并重新合成。下列说法正确的是（）

A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开

B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物

C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常

D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传

二、多选题

23．（2025·山东临沂·三模）某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该

重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（）

注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物

A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达

B．仅用F2和R1一对引物无法确定ACTA1基因插入方向是否正确

C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同

D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子

24．（2025·山东济南·二模）进行性脊柱性肌萎缩症(SMA)与假肥大型进行性肌营养不良症

(DMD)两种遗传病症状相似，均会导致肌肉力量不足，临床上较难区分。SMA由等位基因

A、a控制，DMD由等位基因B、b控制，A、a和B、b不位于Y染色体上。图1为两种遗

传病的系谱图，图2为家系中部分个体两种病相关基因PCR扩增后获得的电泳（可分离不

同基因，M为标准样品）图，不考虑突变和互换。下列说法错误的是（）

A．Ⅲ₁的DMD致病基因来自I₂

B．Ⅱ₂和Ⅱ₃再生一个患病男孩的概率为5/16

C．可调查Ⅰ₂父亲是否患病来判断I₂的患病类型

D．a基因可能由A基因发生碱基对的增添突变而来

25．（2025·山东泰安·二模）某遗传病家系的系谱图如图甲所示，已知该遗传病由正常基因A

突变成A1或A2引起，且A1对A和A2为显性、A对A2为显性。为确定家系中某些个体的

基因型，分别根据A1和A2两种基因的序列，设计鉴定该遗传病基因的引物进行PCR扩增，

电泳结果如图乙所示。下列说法正确的是（）

A．表型相同的个体电泳结果不一定相同，电泳结果相同的个体表型一定相同

B．若Ⅱ3的电泳结果有2条条带，则Ⅱ2和Ⅲ3基因型相同的概率为1/3

C．若Ⅲ5的电泳结果仅有1条条带，则Ⅱ6的基因型只有1种可能

D．若Ⅲ1与正常女子结婚，生育后代患病的概率为1/2

26．（2025·山东枣庄·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验1）和“DNA的粗提

取与鉴定”（实验2）的实验操作，下列相关叙述错误的是（）

A．实验1中，DNA电泳时需要在琼脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料

B．实验1中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源

C．实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为70%的冷酒精后析出

DNA

D．实验2中，需先将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行

沸水浴，用于鉴定DNA

三、解答题

27．（2025·山东临沂·三模）荧光素酶（Luc蛋白）由550个氨基酸组成，分为N端和C端

2个功能片段，即NLuc蛋白（2-416氨基酸）和CLuc蛋白（398—550氨基酸），两部

分不能自动重组并发挥作用；将目标蛋白OsBIK1蛋白和OsXLG2蛋白分别与NLuc蛋白和

CLuc蛋白融合，若2个目标蛋白相互作用，则NLuc蛋白和CLuc蛋白能成功组装为荧光素

酶并分解荧光素发出荧光。科研人员构建了可表达OsBIK1-HA-NLuc融合蛋白的表达载体1

和可表达CLuc-OsXLG2融合蛋白的表达载体2并进行了检测，如图1所示，图中HA为标

签蛋白（用于目的蛋白的检测、示踪等）的编码序列。

(1)构建重组质粒1时，需要把OsBIK1基因的对应终止密码子的3个碱基去除，原因

是；图中HA编码序列插入OsBIK1基因编码链的（填“5'端”或“3'

端”），编码链为转录时所用模板链的互补链。

(2)如果用抗Luc蛋白抗体分别检测表达载体1和2融合蛋白表达情况，结果如图2，可优先

选用抗蛋白抗体进一步区分条带1为融合蛋白。

(3)为了满足应用常需要在载体中构建诱导型启动子，当诱导物存在时可以激活或抑制目的

基因的表达。双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员已

经构建了下图所示的基因表达载体，以检测双向启动子作用效果。试分析：为连入GUS基

因，需用酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，若观察到则

可确认双向启动子起作用。

28．（2025·山东济南·二模）研究发现水稻MEL2基因等位突变体mel2会导致个体不能产生

雌配子，个体的花粉育性保持完全正常，其他农艺性状均不受影响。科研人员将野生型MEL2

基因经PCR扩增后接入图甲中含有杀花粉基因ZM-AA1和糊粉层特异性表达的红色荧光基

因DsRed2的双T-DNA载体中，以获得新的品系，构建过程如图所示。

(1)通过PCR扩增水稻MEL2基因并正确连入图甲载体中，使用的F引物5'端需要添加的序

列为5'CACTGC3'（写出15bp序列）。

(2)使用Bb.Bts1对图甲载体插入位点可得到个缺口，推测图中94℃处理的目的

是；使用LacZ作为菌落筛选基因时，重组转化后的阳性菌落呈

色（填“蓝”或“白”）。

(3)将重组载体导入mel2纯合突变体，可在阳性转化苗（两T-DNA均可检测到）的后代中

挑选出只含第二个T-DNA插入的株系A，原因是；假设株系A只有一个

T-DNA插入且不影响其他基因功能，该株系自交后产生的种子中红色荧光种子的比例

为。

29．（2025·山东潍坊·三模）科研人员通过CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的PPP2R3A基因，研

究该基因对小鼠心脏功能的影响。其过程为：构建含sgRNA基因和Cas9酶基因的表达载体，

通过显微注射将该表达载体导入小鼠的卵细胞中，利用CRISPR/Cas9系统敲除PPP2R3A基

因构建模型小鼠。图1为Cas9酶基因的DNA片段且转录方向从左到右；图2为所用质粒

及质粒上有关限制酶的识别序列和酶切位点示意图，Ampr为氨苄青霉素抗性基因、Tetr为四

环素抗性基因。

(1)研究表明，Cas9酶基因两侧没有限制酶切位点，在构建表达载体的过程中，可借助PCR

技术在引物的（填“5′”或“3′”）端添加限制酶切序列；引物1序列区由5′→3′的碱基序

列为，引物2序列区应含有限制酶的识别序列。

(2)研究发现，实际操作时，只需敲除PPP2R3A基因的部分碱基序列，即可使其失去功能。

科研小组用PPP2R3A基因敲除的模型小鼠（KO组）与未做处理的小鼠（WT组）进行杂交，

获得子代小鼠（F1组）。三组小鼠PPP2R3A基因的电泳图谱如下图所示。

据图分析，PPP2R3A基因的长度为；敲除掉的碱基序列长度为；4、5、6、12、

14是组小鼠的电泳图。

(3)该科研小组检测了小鼠心脏组织中相关基因的表达情况，结果如下表所示（RGS19为参

与心脏发育的蛋白信号转导调控因子）。

PPP2R3A

组别PPP2R3A蛋白RGS19

mRNA

WT组1.310.240.87

KO组0.760.141.21

据表分析可知，与WT组相比，KO组。由此可以得出结论是。

30．（2025·山东泰安·三模）科研人员尝试利用鸡新城疫病毒（HB1）基因和传染性支气管炎

病毒（H120）基因，采用基因工程技术培育转基因工程菌，以制备二联体疫苗，所需要的

限制酶的识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。

限制酶BclIPvitⅡXbaISau3AI

识别序列和切割位点（5′-3'）T↓GATCACAG↓CTGT↓CTAGA↓GATC

(1)根据图示信息，应选用限制酶切割质粒，不选用其他限制酶的原因

是。

(2)为保证融合基因与质粒的正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的（填“3'”

或“5′”）端添加限制酶（填种类）的识别序列。根据图表信息，写出该引物的12

个碱基序列5′--3′。

(3)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加（填“四环素”

或“青霉素”）,培养基乙中应添加（填“四环素”或“青霉素”）,菌落（填图

中数字）中的大肠杆菌可用来制备疫苗。

31．（2025·山东青岛·二模）转录因子是一类在基因表达调控中起关键作用的蛋白质，主要

功能是通过结合DNA特定序列，控制基因转录的起始和强度。WRKY基因表达的转录因子

在植物的抗逆方面发挥着重要的作用。为提高菠萝的抗干旱能力，研究人员利用Gateway

克隆技术构建WRKY基因的过表达载体，培育出抗干旱的转基因菠萝。Gateway克隆技术

包含BP反应和LR反应两个阶段。

(1)为得到两端含attB的WRKY基因，可采用技术，完成该技术需要提供的物质

有。

(2)BP反应中，带有attB序列的WRKY基因与pENTR载体混合，加入BP克隆酶，attB和

attP位点之间会发生互换，形成。这种技术与传统的构建方法相比，区别

是。

(3)LR反应中，pENTR载体上的attL位点和pGWB605载体上的attR位点在LR克隆酶的催

化下发生互换，从而将WRKY基因转移到pGWB605载体上。转化大肠杆菌后，在培养基

上存活的一定是含WRKY基因的pGWB605载体，而不是pGWB605载体，理由是。

(4)pGWB605载体含植物强启动子，能。将重组载体导入菠萝愈伤组织后，通过

技术获得转基因菠萝植株。除了比较转基因菠萝和非转基因菠萝细胞中的WRKY转录因子

的含量外，还需要从水平来检测转基因菠萝是否培育成功。

32．（2025·山东日照·二模）研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维

素薄膜。蛋白T7RNAP是一种噬菌体RNA聚合酶(T7RNAP的N端或C端单独存在时不能

发挥作用，二者结合可形成完整的T7RNAP)，nMag和pMag是在蓝光环境下能够相互结合

的两种光敏蛋白。研究人员通过PCR技术获融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因

连接，构建成基因表达载体，然后将其导入受体菌，获得了所需的工程菌。

(1)研究人员利用PCR技术实现编码T7RNAPN端的基因下游序列与编码nMag的基因上游

序列的无缝连接，获得编码T7RNAPN端-nMag的融合基因，由图1可知，引物2的5＇端

9个碱基序列为5＇3＇，如此设计引物2的目的是。用同样的方法

获得编码pMag-T7RNAPC端的融合基因。

(2)通用型启动子能够被纤维素生产菌的RNA聚合酶识别，结构完整的T7RNAP对T7启动

子表现出高度的特异性。为获得蓝光诱导着色的纤维素生产工程菌，构建了下图所示的基因

表达载体，图中3个启动子中，表示通用型启动子的是(填序号)，表示T7启动

子的是(填序号)。

(3)将构建好的载体导入纤维素生产菌前，通常用处理受体细胞。为筛选出能够

生产黑色纤维素薄膜的工程菌，培养基中应添加。

33．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原

（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，

科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功

培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光

素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、

BsrGI为限制酶，→表示转录方向。

注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列

(1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶切割Luc基因载体可

降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测

引物1包含的碱基序列为5′3′。（写出已知的所有碱基序列）

(2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在

含的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因

是。

(3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用。

(4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知

vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将

启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连

接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的，

待发育成熟后，往水体中添加进行检测。

34．（2025·山东潍坊·一模）利用基因编辑技术CRISPR/Cas12a开发出的核酸检测技术，可

更加精确快速的进行核酸检测。该系统由crRNA与Cas12a蛋白组成，利用crRNA介导Cas12a

蛋白能准确切割靶标DNA，Cas12a蛋白切割靶标DNA的同时切割荧光底物使其发出荧光，

通过检测荧光强度确定靶标DNA含量。现利用工程菌制备CRISPR/Cas12a复合体来检测自

来水中的大肠杆菌，如图所示。

(1)PCR获取目的基因时，缓冲液中Mg2+的作用是，crRNA序列应符合的条件

是。

(2)为实现Cas12a蛋白基因、crRNA编码序列与质粒的准确连接，质粒中两处BsaⅠ酶切后的

黏性末端应（填“相同”或“不同”）。为使重组质粒中不出现BsaⅠ识别序列，需在

F和R引物5'端添加的序列是（填标号）。

①F5'-NNNNNGAGACC-3'R5'-NNNNNGAGACC-3'

②F5'-GGTCTCNNNNN-3'R5'-GGTCTCNNNNN-3'

③F5'-GGTCTCNNNNN-3'R5'-NNNNNGAGACC-3'

④F5'-NNNNNGAGACC-3'R5'-GGTCTCNNNNN-3'

(3)若要筛选到含有基因表达载体的工程菌，培养基中除细菌生长的必需条件外还应加

入，从菌落分别挑取少许菌体，接种到含的平板上，若，

则对应菌落中细菌含有基因表达载体。

(4)下图为利用CRISPR/Cas12a复合体检测自来水中大肠杆菌DNA含量时绘制的曲线，实验

中设置不含大肠杆菌对照组的作用是。一段时间后，荧光信号强度不再升高，

原因是。

35．（2025·山东枣庄·二模）无缝克隆技术首先对质粒PCR1获得线性化载体，然后通过PCR2

在目的基因片段的两端插入与线性化载体两端相同的碱基序列。再将上述两类PCR产物混

合，在In-Fusion酶的作用下，凭借其3′→5′外切核酸酶活性，从线性化DNA的3′端起始切

除15个核苷酸，进而暴露出部分单链区域，最终在某些酶的作用下促使插入片段与载体实

现连接。Gata基因是哺乳动物体内重要的转录调控因子，与多种疾病的发生发展密切相关，

研究者利用无缝克隆技术将Gata基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建融合蛋白以

研究Gata基因的作用机理，相关流程如下图所示。

(1)PCR过程中引物与模板结合发生在阶段。对质粒进行PCR1扩增时，引物应

选。

A．5'TAGATCTCAGTCGATC3'B．5'GATCGACTGAGATCTA3'

C．5'AGGATCAGTCCGCTA3'D．5'TAGCGGACTGATCCCT3'

(2)进行PCR2过程中，为了在GFP基因两端分别增加Ⅰ、Ⅱ片段，应该从引物①②③④中选

择引物，并且还要在引物的（填“5'”或“3'”）端添加Ⅰ、Ⅱ片段对应序列。PCR2

进行第四轮扩增结束时，PCR反应体系中含个需要的双链GFP基因片段。将线性化

载体与目的GFP基因相连构建重组质粒阶段除了需要InFusion酶之外，还需要酶。

(3)将实验得到的常染色体上转入一个Gata-GFP融合基因的1只雄性小鼠，与野生型雌鼠杂

交，得到F1小鼠若干，F1雌雄小鼠相互交配得到F2，其中Gata-GFP基因纯合子小鼠的比例

为。

36．（2025·山东枣庄·一模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基

因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究

人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1

表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号~表示引物。然后将获取的目的基因连接在大

肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp①表示④碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部

分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。

(1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在酶的作用下先合

cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程

中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是。

(2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物

是，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添

加限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有

（答出2点）。

(3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然

后对产物进行电泳，结果如图3，样品最可能是插入了目的基因的重组质粒，

判断的理由是。

四、实验题

37．（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。

菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2

基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了

更高效的酶。

(1)交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、

LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是。已知过程①

起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循

环扩增条件为：变性30s，复性15s，延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产

物。第二轮循环后所得重组型子链长度为个核苷酸。

(2)获得的重组LA基因中，同时具有LA1和LA2基因序列的原因

是。

(3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-

突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的

主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目

的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5′端需引入酶的识别序列。

为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因的受体菌。从含有PM质粒、

重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路

为。

38．（2025·山东菏泽·二模）抗菌肽以其快速杀菌活性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜

力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCC）替换成

苏氨酸（密码子为ACG）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技

术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。请回答下列问题：

(1)若将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，则基因转录模板链对应碱基的变化是，

据图分析，写出第51位氨基酸对应的密码子是。

(2)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择________。

A．5'…ATAGCAGGC…3'B．5'…ATAACGGGC…3'

C．5'…GCCTGCTAT…3'D．5'GCCCGTTAT3'

(3)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因，需要进行两次PCR（PCR1和PCR2），

产物1最早出现在PCR1的第轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还

有；若考虑1个改良的抗菌肽基因通过PCR3快速扩增，则第n次循环共