2025年纳米材料生物活性测试试题及答案

2025年纳米材料生物活性测试试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.以下哪种技术最适合用于表征纳米材料在生理盐水中的动态粒径分布？A.透射电子显微镜（TEM）B.动态光散射（DLS）C.X射线衍射（XRD）D.原子力显微镜（AFM）答案：B2.在MTT法检测纳米材料细胞毒性实验中，MTT被活细胞线粒体中的哪种酶还原为甲瓒？A.乳酸脱氢酶（LDH）B.琥珀酸脱氢酶C.过氧化物酶D.碱性磷酸酶答案：B3.评价纳米材料血液相容性时，溶血试验的阳性对照通常使用：A.生理盐水B.0.9%NaCl溶液C.去离子水D.10%胎牛血清答案：C4.用于检测纳米材料诱导细胞内活性氧（ROS）水平的常用荧光探针是：A.DAPIB.DCFH-DAC.AnnexinV-FITCD.PI答案：B5.以下哪种纳米材料表面性质对其与生物膜的相互作用影响最小？A.表面电荷（Zeta电位）B.表面亲疏水性C.表面元素组成D.表面粗糙度（<10nm）答案：D6.体内生物分布实验中，若需定量检测纳米材料在各器官中的蓄积量，最常用的方法是：A.生物发光成像（BLI）B.荧光成像（FLI）C.电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）D.磁共振成像（MRI）答案：C7.急性毒性试验中，小鼠的最大非致死剂量（MNLD）通常通过以下哪种方式确定？A.观察72小时内无死亡的最高剂量B.观察14天内无死亡的最高剂量C.计算半数致死量（LD50）后推导D.依据细胞实验IC50值换算答案：B8.评价纳米材料对免疫细胞的影响时，流式细胞术检测的关键指标不包括：A.细胞表面标志物（如CD45）B.细胞周期分布C.细胞内细胞因子（如TNF-α）D.细胞凋亡率（AnnexinV/PI双染）答案：B9.以下哪种纳米材料的生物降解性评价需重点关注溶酶体微环境？A.金纳米颗粒（AuNPs）B.聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒C.二氧化硅纳米颗粒（SiO2NPs）D.碳纳米管（CNTs）答案：B10.纳米材料诱导的线粒体损伤通常表现为：A.线粒体膜电位（ΔΨm）升高B.线粒体DNA（mtDNA）拷贝数增加C.线粒体ROS生成减少D.线粒体肿胀及细胞色素c释放答案：D11.用于评估纳米材料对血管内皮细胞功能影响的关键指标是：A.细胞增殖率B.一氧化氮（NO）分泌量C.细胞迁移能力D.碱性磷酸酶活性答案：B12.以下哪种实验设计不符合“3R原则”（替代、减少、优化）？A.用3D细胞球代替2D单层细胞B.每组实验使用10只小鼠（n=10）C.通过计算机模拟预测毒性D.优化给药途径减少动物痛苦答案：B13.纳米材料与血浆蛋白结合形成“蛋白冠”后，其生物活性主要取决于：A.原始纳米材料的表面性质B.蛋白冠的组成和结构C.纳米材料的核心成分D.蛋白冠的分子量分布答案：B14.慢性毒性试验的观察周期通常为实验动物寿命的：A.1/10B.1/5C.1/3D.1/2答案：C15.以下哪种技术可同时分析纳米材料的粒径分布、表面电荷及蛋白吸附量？A.纳米颗粒追踪分析（NTA）B.多角度光散射（MALS）C.表面等离子体共振（SPR）D.激光多普勒电泳（LDE）答案：A二、填空题（每空1分，共20分）1.纳米材料的生物活性测试需综合评估其物理化学性质、生物相互作用及毒性效应三方面。2.细胞实验中，常用的阳性对照物为顺铂（或H2O2），阴性对照物为无血清培养基（或PBS）。3.流式细胞术检测细胞凋亡时，AnnexinV标记的是细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸，PI标记的是膜受损细胞的DNA。4.溶血试验中，溶血率计算公式为：（样品吸光度-阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度-阴性对照吸光度）×100%，一般认为溶血率<5%为无溶血反应。5.体内急性毒性试验的观察指标包括一般状态（活动、摄食）、体重变化、器官系数（器官重量/体重）及组织病理学检查。6.纳米材料诱导的氧化应激可通过检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量及丙二醛（MDA）水平等指标评估。7.生物分布实验中，若纳米材料标记放射性核素（如99mTc），可通过单光子发射计算机断层扫描（SPECT）实现活体动态成像。8.评价纳米材料对成骨细胞的生物活性时，关键检测指标包括碱性磷酸酶（ALP）活性、矿化结节形成及骨钙素（OCN）分泌量。9.纳米材料的表面修饰（如PEG化）可通过Zeta电位变化、动态光散射粒径增大及蛋白吸附量减少等表征手段验证效果。10.慢性毒性试验中，需定期检测的生化指标包括肝功能（ALT、AST）、肾功能（BUN、Cr）及血常规（WBC、RBC、PLT）。三、简答题（每题6分，共30分）1.简述MTT法检测纳米材料细胞毒性的基本原理及操作步骤。答案：原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色甲瓒结晶，死细胞无此酶活性，因此甲瓒生成量与活细胞数量呈正相关。操作步骤：①细胞接种（96孔板，每孔5000-10000个细胞，培养24小时贴壁）；②加入不同浓度纳米材料（设阴性、阳性对照），共孵育24-72小时；③弃培养基，每孔加入MTT溶液（5mg/mL，无血清培养基稀释），37℃孵育4小时；④弃MTT，加入DMSO溶解甲瓒，震荡10分钟；⑤酶标仪检测570nm（参考630nm）吸光度，计算细胞存活率（样品组吸光度/阴性对照组吸光度×100%）。2.分析纳米材料表面电荷对其生物活性的影响机制。答案：表面电荷通过以下途径影响生物活性：①与细胞膜相互作用：正电荷纳米材料易与带负电的细胞膜（含磷脂酰丝氨酸）静电结合，促进内吞；负电荷材料则可能被排斥，降低细胞摄取；②蛋白冠形成：正电荷表面易吸附血清中带负电的白蛋白、纤维蛋白原，形成厚蛋白冠；负电荷表面可能吸附免疫球蛋白（如IgG），影响生物分布；③毒性差异：正电荷纳米材料因强细胞膜亲和力，易破坏膜完整性（如孔道形成），导致LDH释放；负电荷材料通常毒性较低，但高浓度时可能通过聚集引发物理损伤；④靶向性：通过表面电荷修饰（如阳离子化）可增强对肿瘤细胞（表面负电荷更强）的靶向性。3.简述溶血试验的操作流程及结果判定标准。答案：操作流程：①采集新鲜抗凝全血（如兔血），离心去血浆，生理盐水洗涤3次，配成2%红细胞悬液；②设置三组：阴性对照（生理盐水）、阳性对照（去离子水）、样品组（纳米材料溶液，37℃预孵育）；③每管加入等体积红细胞悬液，37℃孵育3小时；④4℃离心（1000rpm，5分钟），取上清测540nm吸光度；⑤计算溶血率=（A样品-A阴性）/（A阳性-A阴性）×100%。结果判定：溶血率<5%为无溶血；5%-10%为轻微溶血；≥10%为明显溶血，不符合血液相容性要求。4.说明体内生物分布实验中，ICP-MS与荧光成像技术的优缺点。答案：ICP-MS优点：可准确定量（ng/g级），不受生物自发荧光干扰，适用于金属基纳米材料（如Au、Ag、TiO2）；缺点：需破坏组织（牺牲动物），无法动态观察分布过程。荧光成像优点：活体动态成像（实时观察分布），操作简便（标记荧光探针如Cy5）；缺点：受组织穿透深度限制（仅适用于皮下或浅层器官），存在自发荧光干扰，定量准确性较低（荧光淬灭、散射）。5.设计急性毒性试验时，需考虑哪些关键因素？答案：关键因素包括：①实验动物选择：通常用SPF级小鼠（6-8周，雌雄各半），体重差异≤10%；②剂量设计：预实验确定剂量范围（如10、50、250、1000mg/kg），至少设3个剂量组+阴性对照组；③给药途径：根据应用场景选择（静脉注射、腹腔注射、灌胃等），需与实际暴露途径一致；④观察周期：14天，记录每日死亡数、体重变化、临床症状（如活动减少、毛发蓬松、腹泻）；⑤终点指标：LD50（半数致死量）、MNLD（最大非致死剂量）、组织病理学检查（心、肝、脾、肺、肾）；⑥数据处理：用Bliss法或概率单位法计算LD50，进行统计学分析（如t检验）。四、实验设计题（20分）请设计一个完整的实验方案，评价新型聚多巴胺包覆氧化铁纳米颗粒（PDA@Fe3O4NPs）的生物活性，需包含实验目的、材料与方法、检测指标及预期结果。答案：实验目的系统评价PDA@Fe3O4NPs的体外细胞毒性、血液相容性及体内急性毒性，为其生物医学应用（如磁共振成像造影剂）提供安全性依据。材料与方法1.纳米材料表征：-物理性质：TEM观察形貌及粒径（目标50±10nm）；DLS检测水合粒径及Zeta电位（目标-20±5mV）；XRD分析晶体结构（确认Fe3O4晶型）；-化学性质：XPS检测表面元素（C、N、O、Fe），验证PDA包覆；FTIR检测特征峰（多巴胺的酚羟基、氨基）；-稳定性：检测在PBS（pH7.4）、细胞培养基（含10%FBS）中72小时内的粒径变化（DLS）及Zeta电位波动。2.体外实验：-细胞毒性：选取人脐静脉内皮细胞（HUVEC，血管接触模型）、小鼠巨噬细胞（RAW264.7，免疫细胞模型）；实验分组：阴性对照（培养基）、阳性对照（顺铂，5μg/mL）、PDA@Fe3O4NPs（浓度梯度：1、10、50、100、200μg/mL）；检测方法：MTT法（24、48、72小时）测细胞存活率；LDH法检测膜损伤；DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平；流式细胞术（AnnexinV/PI）分析凋亡率；-血液相容性：溶血试验（2%兔红细胞悬液，37℃孵育3小时，测540nm吸光度）；血小板活化检测（流式细胞术，CD62P阳性率）。3.体内实验：-急性毒性：ICR小鼠（18-22g，雌雄各半，n=6/组）；剂量设置：低剂量（50mg/kg）、中剂量（200mg/kg）、高剂量（800mg/kg）、阴性对照（生理盐水）；给药方式：尾静脉注射（模拟临床给药途径）；观察指标：14天内死亡数、体重变化（隔日称重）、临床症状（活动、饮食、毛色）；终点检测：剖检主要器官（心、肝、脾、肺、肾），计算器官系数（器官重量/体重）；HE染色观察组织病理学变化；-生物分布：采用59Fe同位素标记PDA@Fe3O4NPs，给药后2、6、24、72小时取血及主要器官，γ计数器检测放射性活度，计算各器官蓄积百分比（%ID/g）。检测指标-体外：细胞存活率（MTT）、LDH释放率、ROS水平、凋亡率（早期/晚期）、溶血率、血小板活化率；-体内：LD50、体重变化率、器官系数、组织病理学评分（炎症、坏死程度）、各器官生物分布百分比。预期结果-表征结果：PDA@Fe3O4NPs呈球形，水合粒径约60nm，Zeta电位-18mV，在含血清培养基中72小时内粒径无显著变化（<10%），表明稳定性良好；-体外实验：低浓度（≤100μg/mL）下，HUVEC和RAW264.7细胞存活率>80%，LDH释放率<10%，ROS水平与阴性对照无显著差异（p>0.05），溶血率<5%，血小板活化率<15%（正常范围<20%）；高浓度（200μg/mL）时，细胞存活率降至70%左右，可能与纳米颗粒聚集引发的物理损伤有关；-体内实验：高剂量组（800mg/kg）小鼠无死亡，体重增长正常（与阴性对照相比p>0.05），器官系数无显著差异；组织切片未见明显炎症或坏死；生物分布显示主要蓄积于肝脏（24小时达35%ID/g）和脾脏（15%ID/g），72小时后部分通过肾脏排泄（尿液中检测到5%ID）。综上，PDA@Fe3O4NPs在合理浓度下表现出良好的生物活性，有望进一步开展临床前研究。五、综合分析题（20分）某课题组合成了两种新型纳米颗粒：A（粒径20nm，表面带正电，未修饰）和B（粒径100nm，表面PEG修饰，负电）。体外细胞实验显示，A对HeLa细胞的IC50（半数抑制浓度）为15μg/mL，B的IC50为200μg/mL。请从纳米材料性质、细胞相互作用机制及实验设计角度分析可能的原因。答案：一、纳米材料性质差异1.粒径：A（20nm）小于B（100nm）。小粒径纳米颗粒比表面积更大，表面活性位点更多，易与细胞成分（如膜蛋白、DNA）发生相互作用；同时，20nm颗粒更易通过网格蛋白介导的内吞或穿膜进入细胞，增加胞内累积量，导致更高毒性。2.表面电荷：A带正电，B带负电。细胞膜表面因磷脂酰丝氨酸和糖蛋白呈负电性，正电纳米颗粒通过静电吸引与膜紧密结合，可能破坏膜完整性（如形成孔道），导致LDH释放和细胞死亡；负电颗粒因静电排斥，与膜结合能力弱，内吞效率低，毒性降低。3.表面修饰：B表面PEG化，A未修饰。PEG链可形成空间位阻，减少纳米颗粒与血清蛋白的非特异性吸附（蛋白冠厚度降低），避免被巨噬细胞识别清除，同时降低与细胞膜的直接接触；未修饰的A表面易吸附纤维蛋白原、免疫球蛋白等，形成厚蛋白冠，可能通过补体激活或受体介导的内吞增加细胞摄取，引发更强的炎症反应和毒性。二、细胞相互作用机制差异1.内吞途径：A（20nm，正电）可能通过网格蛋白/小窝蛋白介导的内吞或直接穿膜进入细胞，快速累积于胞质或溶酶体，导致溶酶体破裂（释放水解酶）或线粒体损伤（ROS爆发）；B（100nm，负电，PEG化）主要通过巨胞饮作用内吞，速度较慢，且PEG修饰减少溶酶体靶向，降低胞内