2026届新高考生物冲刺复习基因表达载体的构建

2026届新高考生物冲刺复习

基因表达载体的构建(☆2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图所示。

一、创设情境二、夯实基础1.基因工程的基本操作程序中，核心步骤是_________________,其目的是______________________________________________________。2.基因表达载体的组成:___________________________________________。3.启动子的功能:__________________,标记基因的作用:_______________。4.构建重组质粒的传统方法中会用到__________酶和_________________酶。5.PCR的过程中，引物设计的依据是:_______________________________,引物会与DNA模板链的______端结合，DNA新链延伸的方向为____________，通常会在引物的________端添加限制酶识别序列。6.据图叙述传统构建表达载体的过程？例1：某真菌的w基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中w基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。

限制酶BamHⅠEcoRⅠMfeⅠKpnⅠHindⅢ识别序列和切割位点G↓GATTCG↓AATTCC↓AATTGGGTAC↓CA↓AGCTT限制酶主要是从

中分离纯化出来的。应使用限制酶

切割图中质粒，使用限制酶

切割图中含w基因的DNA片段，以获得能正确表达w基因的重组质粒。原核生物

MfeⅠ、HindⅢ

EcoRⅠ、HindⅢ7.尝试总结限制酶的选择原则？(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类

应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类

要与切割目的基因的限制酶产生相同的末端；如果是2种限制酶则是保证目的基因的正向连接、避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的自身连接。

一定不能破坏启动子、终止子和复制原点，当质粒具有2个或多个标记基因时，一定要根据信息确定不能破坏的标记基因，必须保证重组的质粒至少有一个标记基因。

在构建一个重组质粒的过程，要经过：PCR、酶切、T4DNALigase连接、转化，中间任一环节出了问题，都要N次重来，最后结果阳性率往往还是很低。

而且由于挑选的酶切位点不能存在于插入片段中间，有时候我们会发现质粒载体上可用的酶切位点很少。如果用单酶切的话，一方面不太容易切开，另一方面单酶切的载体在连接片段时不能保证片段插入的方向性且单酶切的载体容易发生自连。同时会引入多余序列。麻烦，着实是麻烦！所以新一代大家质粒构建的心头好——无缝克隆应运而生！8.概括传统酶切酶连构建基因表达载体的缺点？

二、拓展能力无缝克隆技术1.原理：在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15~20bp)，然后用核酸外切酶制造出黏性末端，黏性末端互补配对后，借助DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复缺口，即可实现无缝连接。2.外切酶的种类

①T5核酸外切酶(5'→3'外切酶活性)

②In-Fusion酶(3'→5'外切酶活性)

③T4DNA聚合酶

在反应体系中没有添加dNTP情况下具有3'→5'外切酶活性；

在反应体系中添加dNTP情况下具有聚合酶活性；

在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料(如dATP)，T4DNA聚合酶也具有3'→5'外切酶活性，且外切

到dAMP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端。第一步：载体线性化，_________________________________________________第二步：获得目的基因，可采用_________________，关键在于_____________上，设计的引物5‘端需要和__________末端有15-20bp的重叠，那么由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。第三步：用_____________将线性化载体和目的基因水解出_______________

3.步骤可采用酶切或是直接PCR方式去扩增整个载体；PCR

方式去扩增引物设计线性化载体核酸外切酶黏性末端In-Fusion克隆方法利用的是牛痘病毒DNA聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性，这个3'-5'核酸外切酶能够去除DNA3'末端的核苷酸，形成5'突出（黏性末端）双链体，双链体DNA片段的互补5'突出端（黏性末端）退火在一起，形成重组中间体。In-Fusion反应混合物含有单链DNA结合蛋白，可与互补区域外的任何ssDNA结合，从而增强瞬时复合物稳定性。然后将重组物转化进大肠杆菌，利用细菌修复系统，实现缺口未修复，最后得到共价闭合重组质粒。第四步：线性化载体和目的基因连接修复（体内修复或体外修复）,需要______________________酶。DNA聚合酶、DNA连接4.优点

最后总结一下，构建质粒时，我们到底是选择酶切酶连还是同源重组呢？相信同学们心里已经有了答案。总结一下，酶切酶连能做的普遍无缝克隆都能做！不过无缝克隆也有一定局限性：

（1）载体克隆位点选择尽量选择无重复序列，且GC含量比较均匀的区域进行克隆；

（2）如果载体或目的基因有多个同源重复序列可能会导致克隆含有错误的插入片段；

（3）由于载体和目的基因比例问题以及如果同源区域没有暴露，In-Fusion反应也不会成功。5.缺点例2.(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：图1

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有__________(2分)，扩增程序中最主要的不同是____________。模板、引物

退火温度

例2.(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：图1

(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________(2分)。A．－ATGGTG…CAACCA－B．－TGGTTG…CACCAT－C．－GACGAG…CTGCAG－D．－CTGCAG…CTCGTC－CD

例2.(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：图1

(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________(2分)。限制酶、DNA连接酶

(2021·江苏卷)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag

标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题：(2)重组质粒的构建①将Sma

Ⅰ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及______________酶等，完成质粒的环化。

磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题。（4）PCR扩增PABD基因时需依据______________________________________________设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的__