2025年PCR上岗证考试题及答案

2025年PCR上岗证考试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.PCR反应中，变性步骤的典型温度是？A.94℃B.55℃C.72℃D.37℃2.以下哪种物质可有效抑制PCR反应中的核酸酶活性？A.EDTAB.NaClC.Tris-HClD.SDS3.荧光定量PCR中，Ct值的定义是？A.扩增产物达到平台期的循环数B.荧光信号达到设定阈值的循环数C.引物二聚体开始形成的循环数D.模板完全消耗的循环数4.引物设计时，为避免引物二聚体，应重点关注引物的？A.3’端互补性B.5’端GC含量C.长度D.Tm值5.PCR实验室中，样本处理区（第二区）的主要操作是？A.试剂配制B.核酸提取与纯化C.PCR扩增D.产物电泳分析6.以下哪种情况会导致PCR假阴性结果？A.扩增产物污染B.样本中存在Taq酶抑制剂C.引物浓度过高D.Mg²+浓度过高7.实时荧光PCR中，使用UNG酶（尿嘧啶DNA糖基化酶）的主要目的是？A.提高扩增效率B.降解含dUTP的既往扩增产物C.增强引物特异性D.降低退火温度8.内参基因（如β-actin）在PCR检测中的核心作用是？A.验证样本核酸提取质量B.提高目标基因扩增效率C.减少引物二聚体D.降低Ct值变异系数9.PCR反应体系中，dNTP的最佳浓度范围通常为？A.0.01-0.1mmol/LB.0.1-0.5mmol/LC.1-5mmol/LD.5-10mmol/L10.以下哪种污染类型是PCR实验室最常见的交叉污染来源？A.样本间交叉污染B.气溶胶污染C.试剂污染D.设备残留污染11.荧光定量PCR的标准曲线斜率反映的是？A.扩增效率B.检测灵敏度C.特异性D.重复性12.核酸提取过程中，使用乙醇洗涤的主要目的是？A.裂解细胞B.沉淀核酸C.去除盐离子和杂质D.灭活核酸酶13.PCR扩增仪的温度均匀性应控制在？A.±0.1℃B.±0.5℃C.±1.0℃D.±2.0℃14.检测结果为“阴性”时，需同时满足的条件是？A.目标基因无扩增，内参基因正常扩增B.目标基因无扩增，阴性对照无扩增C.内参基因正常扩增，阳性对照正常扩增D.目标基因无扩增，内参基因正常扩增，阴性对照无扩增15.以下哪种情况无需重新检测？A.阳性对照无扩增B.内参基因扩增失败C.样本Ct值在有效检测范围内且重复性良好D.阴性对照出现扩增曲线二、多项选择题（每题3分，共15分，多选、少选、错选均不得分）1.影响PCR扩增效率的主要因素包括？A.模板核酸的质量与浓度B.引物的特异性与浓度C.Mg²+离子浓度D.退火温度与时间2.PCR实验室分区应包括？A.试剂准备区（第一区）B.样本处理区（第二区）C.扩增区（第三区）D.产物分析区（第四区）3.阳性对照在PCR检测中的作用包括？A.验证扩增体系的有效性B.监测实验过程中的污染C.评估检测方法的灵敏度D.替代内参基因4.核酸提取过程中可能导致产量降低的原因有？A.样本裂解不充分B.离心速度或时间不足C.洗涤液残留过多D.洗脱缓冲液pH不适5.实时荧光PCR结果判读时，需重点关注的参数包括？A.Ct值B.扩增曲线形态C.熔解曲线峰型D.阴性对照的Ct值三、判断题（每题2分，共20分，正确填“√”，错误填“×”）1.PCR实验室可以不设置缓冲间，仅通过分区标识区分区域。（）2.扩增产物分析区（第四区）可使用开放式离心机，无需专用。（）3.同一批检测中，若阳性对照无扩增，所有样本结果均无效。（）4.核酸提取时，加入蛋白酶K的目的是裂解细胞膜。（）5.荧光定量PCR中，熔解曲线出现双峰可能提示引物二聚体或非特异性扩增。（）6.为提高检测灵敏度，可随意降低荧光阈值设置。（）7.样本处理区（第二区）应配备生物安全柜，避免气溶胶扩散。（）8.扩增仪的温度校准应至少每年进行1次。（）9.内参基因扩增失败时，样本检测结果仍可报告为“阴性”。（）10.使用一次性吸头（带滤芯）可有效降低气溶胶污染风险。（）四、简答题（每题8分，共24分）1.简述PCR实验室四区的功能及气流方向要求。2.引物设计的基本原则包括哪些？请至少列出5项。3.列举3种PCR假阳性结果的可能原因，并提出对应的解决措施。五、案例分析题（11分）某临床基因扩增实验室开展新冠病毒核酸检测，某次检测中出现以下情况：-阳性对照（浓度1×10³copies/mL）Ct值为30（预期Ct值28-32）；-阴性对照（无模板水）Ct值为38（基线附近有微弱扩增曲线）；-2份临床样本Ct值分别为35（曲线平滑）和“无扩增”（内参基因Ct值22）。请分析：（1）阴性对照结果是否符合要求？可能的原因是什么？（2）Ct值为35的样本应如何报告？（3）“无扩增”样本的检测结果是否有效？为什么？参考答案一、单项选择题1.A2.A3.B4.A5.B6.B7.B8.A9.B10.B11.A12.C13.B14.D15.C二、多项选择题1.ABCD2.ABCD3.ABC4.ABCD5.ABC三、判断题1.×2.×3.√4.×5.√6.×7.√8.√9.×10.√四、简答题1.PCR实验室四区功能及气流方向要求：-试剂准备区（第一区）：用于PCR反应体系（如引物、dNTP、酶等）的配制与分装，需严格避免外源核酸污染。-样本处理区（第二区）：进行样本的前处理（如细胞裂解、核酸提取与纯化），需防止样本间交叉污染。-扩增区（第三区）：完成PCR扩增反应，需避免扩增产物对前两区的污染。-产物分析区（第四区）：对扩增产物进行检测（如电泳、荧光分析），是污染风险最高的区域。气流方向要求：从清洁区（第一区）到污染区（第四区），保持递减的负压梯度（如第一区＞第二区＞第三区＞第四区），避免空气逆流导致污染。2.引物设计基本原则（至少5项）：-长度：18-25bp（常用），过长易导致非特异性结合，过短影响特异性。-Tm值：引物Tm值应接近（±2℃），通常55-65℃，避免Tm值差异过大导致扩增效率不均。-GC含量：40%-60%，过高易形成二级结构，过低影响引物与模板结合稳定性。-3’端特异性：避免3’端互补（尤其连续2-3个碱基），防止引物二聚体；3’端最好为G/C，增强结合力。-避免重复序列：如polyA或polyT，防止非特异性扩增。-特异性：通过BLAST比对确保引物仅与目标基因互补，避免与其他基因同源序列结合。3.PCR假阳性结果的可能原因及解决措施（列举3种）：-原因1：气溶胶污染（如既往扩增产物形成的微小颗粒残留于实验室环境）。解决措施：分区操作，各区物品专用；扩增后区（第三、四区）避免开启反应管；定期使用紫外线（254nm）照射或DNA酶处理实验台面。-原因2：加样枪交叉污染（吸头未更换或枪头无滤芯）。解决措施：使用带滤芯的一次性吸头；每步操作更换吸头；加样枪定期校准并进行污染检测（如用无模板水作为样本检测）。-原因3：试剂污染（如引物、dNTP等试剂被目标核酸污染）。解决措施：分装试剂至小体积（避免反复冻融）；使用前检测试剂空白（无模板对照）；必要时更换新批次试剂。五、案例分析题（1）阴性对照结果不符合要求。原因：阴性对照（无模板水）出现Ct值38（基线附近微弱扩增），提示存在轻微污染（可能为气溶胶污染或加样过程中交叉污染）。正常情况下，阴性对照应无扩增曲线或Ct值＞40（超出检测范围）。（2）Ct值为35的样本应报告为“阳性”。新冠病毒核酸检测通常以Ct值≤37为阳性判断标准（具体根据试剂盒说明书）。该样本Ct值35且扩增曲线平滑，符合阳性判定条件。（3）“无扩增”样本的检测结果无效。内参基因（如人源管家基因）Ct值22（正常范围），说明