ACE基因多态性对RASI治疗糖尿病肾病疗效的影响

ACE基因多态性对RASI治疗糖尿病肾病疗效的影响目录中文摘要1英文摘要2前言31研究对象42方法42.1标本采集42.2糖尿病肾病的诊断42.2.1肾病临床终点事件诊断42.2.2尿白蛋白的诊断…42.3ACE基因多态性分析52.4统计学方法53结果…………...63.1研究对象临床特点63.2肾病临床终点事件相关因素分析93.3应用RASI的2型糖尿病患者累计发生肾病临床终点事件的发生率113.4基于基线白蛋白尿严重程度和ACEI/D基因型分组的RASI应用对肾病临床终点事件的影响114讨论125结论13参考文献15致谢17中文摘要目的：本研究旨在探讨ACE插入/缺失（I/D）基因多态性对应用肾素血管紧张素系统抑制剂(RASI)治疗2型糖尿病肾病疗效的影响。方法：对1287名无糖尿病肾病病史的2型糖尿病患者检测了ACEI/D基因多态性。肾病临床终点事件诊断为肾衰导致的死亡、肾透析、肾小球滤过率较基线减少15ml/min/1.73m2和/或下降超过50%。采用Cox比例危险模型，调整常规危险因素后，分析了ACEI/D多态性对应用RASI治疗糖尿病肾病疗效的影响。结果：1287名2型糖尿病患者平均年龄为59.3+13.7岁，平均随访时间为44.2个月（四分位数间距为：23.4~57.3）。ACEI/D多态性的I型等位基因频率为67.1%，D型等位基因频率为32.9%，II型、ID型和DD型等位基因型频率分别为45.8、42.6和11.6%。ACEDD基因型是肾脏临床终点事件的独立预测因子，其风险比(HR)(95%置信区间)为1.72(1.16,2.56)。控制了包括ACEI/D基因型在内的混杂因素后，RASI的应用可显著降低肾病临床终点事件的发生风险(HR0.55(0.40,0.75))。在亚组分析中，RASI对肾脏的保护作用在II和DI携带者中最为明显。(II与DI与DD:HR0.52(0.30,0.90)vs.0.43(0.25,0.72)vs.0.95(0.43,2.12))结论：RASI的应用可降低2型糖尿病患者发生肾病临床终点事件的风险，其作用在II和DI基因型携带者中表现最为明显。关键词：糖尿病肾病；ACE多态性；2型糖尿病；RAS抑制剂1ABSTRACTObjective:TheaimofthisstudywastoexploretheinteractionofACEinsertion/deletion(I/D)polymorphismwithrenninangiotensinsysteminhibitor(RASI)intype2diabeticpatientswithclinicalrenalendpoint.Methods:TheACEI/Dpolymorphismweregenotypedinatype2diabeticcohort(n=1287)whowerefreeofrenalcomplicationsatenrolment.Clinicalrenalendpointwasdefinedasdeathduetorenalfailure,dialysis,estimatedglomerularfiltrationrate(eGFR)oflessthan15ml/min/1.73m2and/ormorethan50%lossofeGFRcomparedwithbaseline.TheeffectsofRASIonsurvivalandrenaloutcomeinrelationtoACEI/DpolymorphismweretestedbyCoxproportionalhazardmodelswithadjustmentofconventionalriskfactors.Results:Acohortof1287type2diabeticpatientswithmeanageof59.313.7yearswerefollowedprospectivelyforamedianperiodof44.2(interquartilerange:23.4~57.3)months.ThefrequencyforIallelewas67.1%and32.9%forDallele,withobservedgenotypefrequenciesof45.8,42.6and11.6%forII,IDandDD,respectively.ACEDDpolymorphismwasanindependentpredictorforrenalendpointwithhazardratio(HR)(95%confidenceinterval)of1.72(1.16,2.56).Aftercontrollingforconfoundingfactors,includingACEI/Dgenotype,theusageofRASIwasassociatedwithreducedriskofrenalendpoint(HR0.55(0.40,0.75)).Onsubgroupanalysis,thebeneficialeffectsonrenoprotection(IIvs.DIvs.DD:HR0.52(0.30,0.90)vs.0.43(0.25,0.72)vs.0.95(0.43,2.12))weremostevidentinIIandDIcarriers.Conclusion:TheusageofRASIwasassociatedwithreducedriskofoccurrenceofrenalendpointinpatientswithtype2diabetes.ThesebenefitsweremostevidentamongIIandDIcarriers.

Keywords:Diabeticrenaldisease；ACEpolymorphism；Type2diabetes；RASinhibitor2ACE基因多态性对RASI治疗糖尿病肾病疗效的影响前言糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一组以高血糖、胰岛素抵抗等为基本特征的代谢性疾病。糖尿病发生率呈现逐年上升的趋势，且目前仍然没有对该病的根治方法。糖尿病患者多伴随有多种并发症的出现，其中糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病最为多见和最严重的慢性并发症之一，尿白蛋白水平是DN的主要临床诊断依据之一，形成DN的患者病情易发展为终末期肾病（endstagerenaldisease，ESRD），是糖尿病的主要致死原因之一[1]。目前DN的发病机制仍未完全阐明，且没有特效药物能够治疗，大多是以严格控制血糖延缓DN的病程进展。因此，糖尿病及其主要并发症DN已经成为备受关注的世界性健康问题，有待在理论和临床实践研究中深入探究有关DN的病因和有效治疗手段，为DN的进一步预防和治疗做好相关准备[2]。长期以来，已有研究证实了肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensinsystem，RAS）的过分激活促进了慢性肾脏疾病的病情进展，而抑制RAS系统具有一定的肾保护作用。研究表明，肾素血管紧张素系统抑制剂（reninangiotensinsysteminhibitor，RASI）对合并蛋白尿的DN患者有较好的疗效，对预防和控制病情进展有一定作用，有利于控制血糖和血压、改善胰岛素抵抗[3]。目前RASI已广泛应用于糖尿病肾病的治疗，但临床实践中该药物疗效却呈现出显著的个体差异。ACE是血管紧张素转换酶，是RAS系统的关键酶，能够把血管紧张素I（angiotensinI,AngI）转化成血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）。分子遗传学相关研究表明，人体的血管紧张素转换酶（ACE）基因存在于17号常染色体长臂2区3带（17q23），长度约为21kb，包括26个外显子和25个内含子。其中，ACE基因第16号内含子有一段长度为287bp的Alu重复序列存在插入/缺失基因多态性，以是否含有此片段为标准，可分为“插入型”（I，insertion）和“缺失型”（D，deletion）等位基因，组成II、ID、DD三种基因型[4]。研究显示，ACEI/D基因多态性可能会影响血清ACE水平高低，[5]进而影响RASI治疗肾疾病的疗效差异，但结果不尽一致。[6,7]因此，探究遗传因素对慢性肾疾病3治疗反应的影响仍为当前的重要研究方向之一。本研究旨在对较大样本的人群进行随访，探讨ACE插入/缺失多态性对RASI治疗2型糖尿病肾病的疗效影响，进一步从基因角度研究ACE基因多态性对DN患者治疗反应的作用及其机制，以期为不同基因型携带者的DN患者制定合理、有效的个体化治疗方案[8]。1研究对象2013年10月至2018年7月，共选择符合以下条件的1287名患者纳入本研究：（1）根据中国2型糖尿病防治指南（1999年版）确诊为2型糖尿病；（2）应用RASI治疗的患者疗程至少达到三个月以上。所有患者接受一般资料采集、相关体格检查及血液检测，并将其发病风险因素、并发症、临床用药等进行了详细记录。本研究经临床医学伦理委员会批准，所有受试者均已签署知情同意书，声明同意捐献DNA样本及临床数据，用于医学研究和学术出版之目的。2方法2.1标本采集所有研究对象于禁食8h后，于次日抽取清晨空腹静脉血12mL,，其中5mL分离血清用于脂类、糖类代谢及肾功等生化检测；7mL静脉血，EDTA抗凝，置于-80℃冰箱保存，用于外周血白细胞的DNA提取。此外，留取尿液10mL，用于检测时间点尿白蛋白/肌酐比值(albumintocreatinineratio,ACR)。估算肾小球滤过率（estimatedglomerularfiltrationrate,eGFR）是根据中国化的肾脏疾病饮食修正公式计算的ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>MaY</Author><Year>2006</Year><RecNum>49</RecNum><record><rec-number>49</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="x02x2t2sl2zxfye0a5hvp0fnptrv5dd9wsee">49</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>MaY,C.</author><author>Zuo,L.</author><author>ChenJ,H.</author><author>Luo,Q.</author><author>YuX,Q.</author><author>Li,Y.</author><author>XuJ,S.</author><author>HuangS,M.</author><author>WangL,N.</author><author>Huang,W.</author><author>Wang,M.</author><author>XuG,B.</author><author>WangH,Y.</author></authors></contributors><titles><title>ModifiedglomerularfiltrationrateestimatingequationforChinesepatientswithchronickidneydisease</title><secondary-title>JAmSocNephrol</secondary-title></titles><periodical><full-title>JAmSocNephrol</full-title></periodical><pages>2937-2944</pages><volume>17</volume><number>10</number><dates><year>2006</year><pub-dates><date>October1,2006</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/cgi/content/abstract/17/10/2937</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1681/asn.2006040368</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[9]。糖尿病肾病的诊断2.2.1肾病临床终点事件诊断肾病临床终点事件诊断为肾衰导致的死亡、肾透析、eGFR15ml/min/1.73m2或eGFR比基线时下降超过50%。随访时间是由纳入日期至首次确诊为肾病临床终点事件的日期或至随访结束时间2018年7月31日。2.2.2尿白蛋白的诊断尿白蛋白正常：时间点尿ACR3.5mg/mmol；微量白蛋白尿：3.5mg/mmol<时间点尿ACR<25mg/mmol；4大量白蛋白尿:时间点尿ACR25mg/mmol。ACE基因多态性分析采用酚-氯仿法提取基因组DNA。应用PCR方法检测ACEI/D多态性,扩增ACE基因第16个内含子中包含插入或缺失一个278bp片段的位点，上游引物为：5’-CTGGAGACCACTCCATCCTTTCT-3’，下游引物为：5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’。扩增反应在美国PE公司生产的GeneAmpPCRSystem9600型扩增仪上进行。反应体系总体积为10l,含模板DNA1ng、缓冲液、四种dNTP、引物及Taq酶。扩增程序为预变性94℃2min；扩增30个循环：每个循环94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min；最后于72℃延伸10min。取PCR产物4l，经2.5%琼脂糖胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外透射反射仪上观察基因型。两条等位基因都包含插入片段的PCR产物在490bp处出现一条带者为II型；两条等位基因都不包含插入片段的PCR产物在190bp处出现一条带者为DD型；一条等位基因包含插入片段，而一条等位基因不包含插入片段，则在490bp及190bp处各出现一条带者为ID型（见图1）。图12.5%琼脂糖凝胶上的聚合酶链反应产物统计学方法5数据的统计分析运用SPSS18.0软件。计量资料表示为均数标准差或中位数（第25-第75四分位数间距），计量资料的组间差异比较采用独立样本Mann-WhitneyU检验；计数资料用百分比表示，组间比较用2检验。群体基因型经Hardy-Weinberg平衡检验。罹患肾病临床终点事件的独立危险因素和ACEI/D基因型对应用RASI治疗2型糖尿病肾病疗效的影均采用Cox回归模型分析。应用RASI的2型糖尿病患者累计发生肾病临床终点事件的发生率采用Kaplan-Meier生存曲线分析，log-rank检验用于显示生存趋势。P<0.05为差异有显著性意义。3结果3.1研究对象临床特点 本研究纳入1287名基线时未合并肾脏并发症的2型糖尿病患者，其中41%为男性，平均年龄为59.313.7岁，随访时间为44.2(23.4~57.3)个月。在基线时，58.6%的患者尿白蛋白正常，21.2%和20.2%出现了微量和大量白蛋白尿。在本研究人群中，ACEI/D多态性的I和D等位基因频率分别为67.1%和32.9%，而II,ID和DD基因型频率分别为45.8%，42.6%和11.6%，且样本群体代表性良好，与Hardy-Weinberg遗传平衡相符。将1287名2型糖尿病患者按照ACEI/D多态性的三种基因型分组后，进行了基线临床资料的比较，II、ID和DD携带者具有相似的年龄、糖尿病病程、血压、血糖、血脂及尿白蛋白等临床和生化特点。II、ID和DD携带者分别有45.6%、42.9%和40.7%的患者曾应用RASI治疗。见表1。表11287名2型糖尿病患者按照ACEI/D多态性的三种基因型分组的基线临床资料比较II(n=592)ID(n=540)DD(n=155)P值年龄(岁)59.812.859.013.260.612.60.186续上表II(n=592)ID(n=540)DD(n=155)P值男性（%）43.340.139.70.27病程(年)7.16.27.06.47.16.20.89糖尿病家族史（%）39.738.339.739.20.79吸烟史（%）28.728.727.10.83收缩压(mmHg)1362213424135210.15舒张压(mmHg)7910781179100.13腰臀围比0.880.060.870.070.880.050.47体重指数(kg/m2)24.73.924.73.824.53.70.92HbA1c(%)7.81.87.71.77.81.90.86空腹血糖(mmol/L)8.83.78.73.59.13.60.31总胆固醇(mmol/L)5.41.35.31.45.31.40.567续上表II(n=592)ID(n=540)DD(n=155)P值甘油三酯(mmol/L)1.38(0.95~2.06)1.36(0.90~1.90)1.32(0.92~2.03)0.44HDL-胆固醇(mmol/L)1.20.31.30.41.30.40.28LDL-胆固醇(mmol/L)3.40.73.51.03.50.80.36血浆肌酐(mol/L)72(60~89)71(60~89)73(62~92)0.31eGFR(ml/min/1.73m2)89.7(70.8~108.6)90.4(72.9~107.5)85.2(68.8~101.6)0.08时间点尿ACR(mg/mmol)1.85(0.66~12.45)1.55(0.58~9.40)1.83(0.71~14.55)0.62白蛋白尿（%）0.58正常57.459.161.8微量白蛋白尿22.420.817.6大量白蛋白尿20.220.020.6抗高血压治疗（%）30.129.534.80.57RASI的应用（%）45.642.940.70.498续上表II(n=592)ID(n=540)DD(n=155)P值降脂治疗（%）30.229.932.80.64合并心血管并发症a（%）12.612.416.70.18合并视网膜病（%）32.830.535.00.34表中数据相应表示为均数、标准差或中位数（第25~第75四分位数间距）；a,心血管并发症包括基线时罹患充血性心力衰竭、缺血性心脏病、血运重建、脑卒中或周围性血管疾病；缩写:ACR,白蛋白/肌酐比值;eGFR,估算肾小球滤过率;HbA1c,糖化血红蛋白。3.2肾病临床终点事件相关因素分析在随访期间，II、ID和DD携带者分别有21.6%、34.8%和36.5%的患者发生了肾病临床终点事件。调整了基线混杂因素后，多因素Cox回归分析显示，与II携带者相比较，DD携带者罹患肾病临床终点事件的风险增加了近2倍（见表2，模型1）。当将应用RASI治疗的患者按照ACEI/D多态性分组进行分析时，在II和ID携带者中，RASI治疗显示了显著的肾保护作用（见表2，模型2）。罹患肾病临床终点事件的其它独立危险因素还包括基线时出现白蛋白尿、体重指数和收缩压升高，以及合并大血管和眼部并发症。9表2多因素Cox回归分析1287名2型糖尿病患者的肾病临床终点事件相关因素a变量HR(95%CI)P值模型1bLog(1+ACR)(mg/mmol)1.92(1.77,2.09)0.001收缩压(mmHg)1.01(1.00,1.02)0.006体重指数(kg/m2)0.92(0.89,0.97)0.001合并大血管并发症1.77(1.27,2.45)0.0007合并眼部并发症2.33(1.64,3.30)0.001ACEI/D多态性cDI携带者1.20(0.89,1.62)0.22DD携带者1.72(1.16,2.56)0.007RASI的应用0.55(0.40,0.75)0.0002模型2Log(1+ACR)(mg/mmol)1.92(1.77,2.09)0.001收缩压(mmHg)1.01(1.00,1.02)0.006体重指数(kg/m2)0.92(0.89,0.97)0.001合并大血管并发症1.77(1.27,2.450.0007合并眼部并发症2.33(1.64,3.30)0.001ACEI/D多态性0.03RASI的应用应用RASI的II携带者0.52(0.30,0.90)0.02应用RASI的DI携带者0.43(0.25,0.72)0.001应用RASI的DD携带者0.95(0.43,2.12)0.91a肾病临床终点事件包括肾衰导致的死亡、肾透析、eGFR15ml/min/1.73m2或eGFR比基线时下降超过50%。b模型1中的HR(95%CI)经基线时RAAS抑制剂（是/否应用）校正。模型2中应用RASI对ACEI/D多态性的三种10基因型携带者的肾脏保护作用相关因素分析经基线混杂因素校正。cACEI/D多态性与肾病临床终点事件相关因素分析以II携带者为对照组与DI和DD携带者相比较。3.3应用RASI的2型糖尿病患者累计发生肾病临床终点事件的发生率 在应用RASI治疗的2型糖尿病患者中（N=565）,与II携带者相比较，DD携带者发生肾病临床终点事件的风险最高,其风险比为1.84(95%CI:1.11~3.05),log-rank值为0.04（见图2）。图2应用RASI的2型糖尿病患者ACEI/D多态性的三种基因型携带者发生肾病临床终点事件的生存分析（N=565）3.4基于基线白蛋白尿严重程度和ACEI/D基因型分组的RASI应用对肾病临床终点事件的影响11 将1287名2型糖尿病患者按照基线白蛋白尿严重程度和ACEI/D基因型分为9组，以基线白尿白蛋白正常的II携带者为对照组，采用Cox回归分析RASI的应用对罹患肾病临床终点事件的影响。结果显示，调整了其它混杂因素后，在基线发生大量白蛋白尿的患者中，应用RASI治疗显著地增加了肾保护作用（见表3）。表31287名2型糖尿病患者中按照ACEI/D多态性和基线时尿白蛋白程度分组分析RASI的应用对肾病临床终点事件的影响IIDIDD大量白蛋白尿0.25(0.15,0.42)0.31(0.18,0.53)0.40(0.17,0.94)微量白蛋白尿1.40(0.39,4.97)1.15(0.38,3.51)1.95(0.22,17.48)正常白蛋白尿1（对照）1.99(0.44,9.03)1.26(0.23,6.92)P值<0.05时为黑色加粗字体。4讨论相关研究发现，ACE基因多态性会影响糖尿病患者血浆中ACE的水平高低，对肾脏疾病的发生及发展起到一定的作用。因此ACE基因多态性对糖尿病合并肾脏疾病的病程发展和治疗可能有一定关联[10]。本研究以前瞻性设计方法对大样本的1287例2型糖尿病患者进行了随访观察，结果显示，ACEI/D基因多态性和RASI的应用都是2型糖尿病患者发生肾病临床终点事件的独立风险因素。在基线的临床和生化指标相似的情况下，RASI的应用对ID和II基因型携带者的疗效更显著，更有利于这部分2型糖尿病患者肾病的治疗和延缓病情的进展；然而，对DD基因型携带者的疗效不十分明显。在本研究的肾病临床终点事件发生风险的相关因素分析中，表2中的模型1显示携带DD基因型是发生肾病临床终点事件的独立危险因素，比II基因型携带者的12风险增高1.72倍，而应用RASI治疗能够将肾病临床终点事件的发生风险降低45%，显示出明显的肾保护作用。成金罗等发现，携带DD基因型的2型糖尿病患者发生慢性肾脏并发症的风险比ID和II基因型携带者明显增高[11]。另有研究人员报道，DD基因型携带者发生ESRD的风险较高，D等位基因或DD基因型与2型糖尿病肾病患者的ESRD易感性显著关[12,13]。这与本文的研究结果一致。表2中的模型2的分析显示，与未应用RASI治疗的患者相比较，应用RASI治疗的II和DI携带者发生肾病临床终点事件的风险分别降低了48%和57%，而在DD携带者中，未观察到应用RASI后明显的肾保护作用；而图2的生存曲线显示出，在应用RASI治疗的患者中，DD基因型携带者的肾病临床重点事件的累计发生率最高，体现了不同的ACE基因型携带者对于RASI治疗的反应不尽相同。随后，我们从另一个角度进行了分析，由表3的结果观察到，在基线时已发生大量白蛋白尿的患者中，RASI的应用具有显著的肾保护作用；其中II和DI基因型携带者罹患肾病临床终点事件的风险分别降低了75%和69%，而且DD基因型携带者的风险也降低了60%。以往的研究曾报道，RASI在DD携带者的应用能够改善糖尿病肾病,且疗效较佳[14,15]。但由于DD携带者在本研究的糖尿病人群中的人数较少，这个结果还需进一步验证。此外，本研究结果还显示（表2），除了ACEI/D基因多态性和RASI的应用可影响2型糖尿病患者发生肾病临床重点事件的风险，血压、体重控制以及眼部和心血管并发症的防治也是糖尿病肾病进展的重要影响因素，因此，在临床治疗中，应对2型糖尿病患者的病情进行全面评估后，采取综合措施防治肾病并发症。本研究在设计上也存在一定的局限性，首先，在对患者使用RASI治疗时，没能遵循随机的原则，绝大多数患者应用了肾素血管紧张素转换酶抑制剂，这可能导致了研究对象的选择性偏差；其次，由于应用血管紧张素II抑制剂的患者人数较少（n=193）,我们没能分析血管紧张素II抑制剂和ACEI/D不同基因型对罹患糖尿病肾病风险的影响。5结论综上所述，本研究发现ACEI/D基因多态性对RASI治疗2型糖尿病肾病的疗13效有一定影响，调整了常见混杂因素后，携带ACEDD基因型仍是糖尿病肾病发生发展的独立风险因素。而RASI的应用通过肾保护作用，在一定程度上能够改善糖尿病肾病患者的生存状况，这种作用在II和ID携带者中尤为明显。这一研究结果可能对临床应用RASI治疗糖尿病肾病有一定的指导作用，有利于根据遗传因素个体差异来分别制定个体化治疗方案并进行健康管理干预，有效延缓、遏制糖尿病肾病的病程进展。而鉴于DD基因型携带者面临更高罹患糖尿病肾病的风险，而他们从RASI治疗获益可能不多，我们还需要探索其他治疗方法以降低这些患者发生糖尿病肾病并发症的风险。14参考文献[1]赖轩.糖尿病肾病患者病理指标同临床指标及预后的相关性分析[D].北京协和医学院,2018.[2]赵日新,陈瑞,谢佳欣,战翔宇,耿浩文,隋洪玉.浅议糖尿病肾病发病机制及防治方法[J].广东化工,2019,46(19):102-103.[3]赵飞,任野平,孔凡武.慢性肾脏病患者交感神经系统及肾素-血管紧张素-醛固酮系统与肾脏疾病进展之间的关系[J].中华老年多器官疾病杂志,2017,16(05):394-397.[4]张瑞生,徐勇飞,朱婵,渠丽丽,唐志鹏,鲍倩,田福亮,王书奎.血管紧张素转换酶基因多态性与2型糖尿病发病的相关性研究[J].现代生物医学进展,2010,10(18):3486-3488.[5]谈红,张国元,黄超,吴宗贵,黄佐.国人ACE基因插入/缺失多态性分析及与血清ACE水平的相关性[J].第二军医大学学报,1997(04):37-39.[6]廖岚,郭丽娟,陈慧玲,雷闽湘,韩秀云.2型糖尿病肾病中ACE基因型和ACEI疗效关系的研究[J].中国糖尿病杂志,2002(06):29-32.[7]JacobsenP,RossingK,RossingP,TarnowL,MalletC,PoirierO,CambienF,ParvingHH.AngiotensinconvertingenzymegenepolymorphismandACEinhibitionindiabeticnephropathy.[J].Kidneyinternational,1998,53(4).[8]曾文,张广宇.血管紧张素转换酶基因多态性与肾疾病ACEI的治疗[J].国外医学.遗传学分册,2000(01):16-19.[9]MaYC，ZuoL，ChenJH，etal．Modifiedglomerularfiltrationrateestimatin