DB15∕T 4230-2025 牛、羊产气荚膜梭菌病荧光定量PCR诊断技术

ICS65.020.01

CCSB41

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T4230—2025

牛羊产气荚膜梭菌病荧光定量

PCR诊断技术

FluorescentquantitativePCRdiagnostictechniquesforClostridium

perfringensinfectionsincattleandsheep

2025-10-30发布2025-11-30实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T4230—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制

中心、准格尔旗动物疫病预防控制中心、内蒙古兴安盟突泉县动物疫病预防控制中心、内蒙古自治区质

量和标准化研究院。

本文件主要起草人：韩四娥、徐丽媛、金鹰、史文瑞、张博、乔煜婷、关平原、李劼、赵丽霞、徐

晓静、郭宇、刘慧、周治国、王震、刘月。

I

DB15/T4230—2025

牛、羊产气荚膜梭菌病荧光定量PCR诊断技术

1范围

本文件规定了牛、羊产气荚膜梭菌病的临床诊断、样品采集和保存、荧光定量PCR定种和分型鉴定

方法。

本文件适用于牛、羊产气荚膜梭菌病的诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T3073家畜魏氏梭菌病诊断技术

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

牛产气荚膜梭菌病clostridiumperfringensinfectionsincattle

由产气荚膜梭菌引起牛的一种急性、致死性传染病。其特点是发病急、死亡快，多以出血性坏死性

肠炎和全身毒血症为主要特征。

羊产气荚膜梭菌病clostridiumperfringensinfectionsinsheep

由产气荚膜梭菌引起羊的一种急性、致死性传染病。其特点是发病急、死亡快。死后解剖可见特征

性的出血性肠炎、“肾软化”等病变。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CP：产气荚膜梭菌（ClostridiumPerfringens）

DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate）

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

1

DB15/T4230—2025

qPCR：荧光定量PCR（QuantitativePolymeraseChainReaction）

5临床诊断

按照NY/T3073相关规定执行。

6样品采集和保存

按照GB19489和NY/T541相关规定执行。

7荧光定量PCR定种鉴定

仪器设备

7.1.1二级生物安全柜。

7.1.2台式低温高速离心机。

7.1.3组织研磨仪或研钵。

7.1.4全自动核酸提取仪。

7.1.5荧光定量PCR仪。

7.1.6旋涡混匀器。

7.1.7微量可调移液器（1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL）。

试剂材料

7.2.1无酶无菌带滤芯吸头。

7.2.2PCR扩增管。

7.2.3商品化PCR预混液。

7.2.4商品化细菌DNA提取试剂盒。

7.2.5阴性对照：DEPC水。

7.2.6阳性对照：带目的片段的质粒DNA，制备方法与基因序列见附录A中的A.1、A.2。

7.2.7引物和探针见附录A中A.3，加DEPC水配制成100μmol/L的储存浓度和10μmol/L工作浓度。

试验方法

7.3.1样品处理

7.3.1.1肛拭子样品

在1mLPBS中反复挤压肛拭子样品，使用旋涡混匀器充分涡旋振荡后，备用。

7.3.1.2粪便、肠道内容物及其他组织样品

无菌取粪便或肠道内容物约1g，加入5mLPBS，混合均匀，备用；或剪取典型病变组织约1g，加

入5mLPBS，于组织研磨仪或研钵中充分研磨成悬液，备用。

7.3.2样品DNA提取

2

DB15/T4230—2025

采用细菌DNA提取试剂盒或用全自动核酸提取仪，提取各类样品（肛拭子、粪便、肠道内容物及其

他组织样品等）中的细菌DNA。

7.3.3反应体系配制

产气荚膜梭菌qPCR定种鉴定反应总体系为25µL，使用附录A中A.3的产气荚膜梭菌定种引物及探针，

按照表1配制qPCR定种鉴定反应体系，瞬时离心后，放入荧光定量PCR仪中进行反应，同时设阴性对照和

阳性对照。

表1qPCR定种鉴定反应体系

组分体积/μL

2×HieffUnicon®UniversalTaqManmultiplexqPCRmastermix12.5

CP-上游引物（10μmol/L）0.75

CP-下游引物（10μmol/L）0.75

CP-荧光探针（10μmol/L）0.5

模板DNA5

加DEPC水至25

7.3.4反应程序

95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火/延伸30s（收集荧光），共45个循环。

结果判定

7.4.1试验成立条件

阴性对照无Ct值或Ct值＞40且未出现特异性扩增曲线，阳性对照Ct值≤35且出现特异性扩增

曲线，判为试验成立。否则，本次试验无效。

7.4.2判定标准

被检样品Ct值≤35且出现特异性扩增曲线，判定为CP核酸阳性；被检样品无Ct值或Ct值＞40，

判定为CP核酸阴性；被检样品35＜Ct值≤40且出现特异性扩增曲线，判定为CP核酸可疑，需复检。

如复检结果为阳性或可疑，则判定为CP核酸阳性，否则判定为阴性。

8多重荧光定量PCR分型鉴定

仪器设备

见7.1。

试剂材料

8.2.1无酶无菌带滤芯吸头。

8.2.2PCR扩增管。

8.2.3商品化PCR预混液。

8.2.4商品化细菌DNA提取试剂盒。

8.2.5阴性对照：DEPC水。

8.2.6阳性对照：A～G型CP阳性对照分别为带目的片段的重组质粒，制备方法与基因序列见附录B

3

DB15/T4230—2025

中的B.1、B.2。

8.2.7引物和探针见B.3，加DEPC水配制成100μmol/L的储存浓度和10μmol/L工作浓度。

试验方法

8.3.1样品处理

肛拭子样品与粪便、肠道内容物及其他组织样品处理分别按照7.3.1.1与7.3.1.2。

8.3.2样品DNA提取

按照7.3.2方法。

8.3.3反应体系配制

使用附录B中B.3的毒素基因分型引物及探针，按照表2（含α、β、ε毒素引物与探针）和表3

（含ι、cpe、NetB毒素引物与探针）分别配制多重荧光定量分型鉴定反应体系1与反应体系2。瞬时

离心后，放入荧光定量PCR仪中进行反应，同时设阴性对照和阳性对照（分别加α、β、ε毒素的阳

性对照与加ι、cpe、NetB毒素的阳性对照）。

表2多重荧光定量分型鉴定反应体系1

组分体积/μL

2×HieffUnicon®UniversalTaqManmultiplexqPCRmastermix12.5

α毒素-F（10μmol/L）1.0

α毒素-R（10μmol/L）1.0

α毒素-P（10μmol/L）0.5

β毒素-F（10μmol/L）1.0

β毒素-R（10μmol/L）1.0

β毒素-P（10μmol/L）0.5

ε毒素-F（10μmol/L）1.0

ε毒素-R（10μmol/L）1.0

ε毒素-P（10μmol/L）0.5

模板DNA5

总体积25

4

DB15/T4230—2025

表3多重荧光定量分型鉴定反应体系2

组分体积/μL

2×HieffUnicon®UniversalTaqManmultiplexqPCRmastermix12.5

ι毒素-F（10μmol/L）1.0

ι毒素-R（10μmol/L）1.0

ι毒素-P（10μmol/L）0.5

cpe毒素-F（10μmol/L）1.0

cpe毒素-R（10μmol/L）1.0

cpe毒素-P（10μmol/L）0.5

NetB毒素-F（10μmol/L）1.0

NetB毒素-R（10μmol/L）1.0

NetB毒素-P（10μmol/L）0.5

模板DNA5

总体积25

8.3.4反应程序

95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火/延伸30s（收集荧光），共45个循环。

结果判定

8.4.1试验成立条件

按照7.4.1分别判定每个通道阴性、阳性对照是否成立。

8.4.2判定标准

8.4.2.1若被检样品在对应不同通道Ct值≤35且出现特异性扩增曲线，则判定为对应的A型、B型、

C型、D型、E型、F型或G型CP核酸阳性。

8.4.2.2若被检样品在对应通道35＜Ct值≤40且出现特异性扩增曲线，判定为可疑，需复检。如复

检结果为阳性，则判定为CP相应血清型核酸阳性，否则判定为阴性。

8.4.2.3若被检样品在对应通道无Ct值或Ct值＞40，判定为CP相应血清型核酸阴性。具体血清型判

定标准见表4。

5

DB15/T4230—2025

表4A～G型产气荚膜梭菌核酸阳性判定标准

反应体系1反应体系2

血清型α毒素β毒素ε毒素ι毒素cpe毒素NetB毒素

FAMHEXCY5FAMROXCY5

A型+-----

B型+++---

C型++--+/--

D型+-+-+/--

E型+--++/--

F型+---+-

G型+----+

注：“+”表示Ct值≤35且出现特异性扩增曲线；“-”表示无Ct值或Ct值＞40，或35＜Ct值≤40且出现特异性扩

增曲线，经复检未达“+”标准；“+/-”表示出现“+”或“-”。

9综合判定

疑似病例

符合NY/T3073临床诊断中描述的相应临床症状和病理变化，判定为牛或羊产气荚膜梭菌病疑似病

例。

确诊病例

疑似病例经产气荚膜梭菌荧光定量PCR定种鉴定或多重荧光定量PCR分型鉴定阳性者判定为产气

荚膜梭菌病确诊病例。

6

DB15/T4230—2025

A

A

附录A

（资料性）

荧光定量PCR定种鉴定阳性对照及引物和探针序列

A.1荧光定量PCR检测阳性对照的制备

将产气荚膜梭菌α毒素基因169bp目的片段连接pCR®4-TOPO载体，再转化到JM109感受态细胞中，制

备成重组大肠杆菌菌株，克隆培养后提取重组质粒。取适量质粒，使用超微量核酸蛋白仪测定浓度，按

公式“copies/μL=（6.02×1023copies/mol×浓度ng/μL）/（DNA碱基数×6.60×1011ng/mol）”计算

质粒的拷贝数（copies），用TE缓冲液连续梯度稀释至1×104copies/μL，作为阳性对照，检验后定量

分装，-15℃以下保存。

A.2荧光定量PCR扩增特异性片段基因序列

参考产气荚膜梭菌ATCC13124菌株（NCBIReferenceSequence:NC_008261.1）α毒素基因序

列，设计荧光定量PCR引物探针，可扩增169bp的目的片段，基因序列如下：

tacattctatcttggagaggctatgcactattttggagatatagatactccatatcatcctgctaatgttactgccgttgatagc

gcaggacatgttaagtttgagacttttgcagaggaaagaaaagaacagtataaaataaacacagcaggttgcaaaactaatgag

A.3荧光定量PCR引物和探针

A.3.1CP–上游引物：5′-TACATTCTATCTTGGAGAGGCT-3′。

A.3.2CP–下游引物：5′-CTCATTAGTTTTGCAACCTGCT-3′。

A.3.3CP–荧光探针：5′-（FAM）CCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGC（BHQ1）-3′。

7

DB15/T4230—2025

B

B

附录B

（资料性）

多重荧光定量PCR分型鉴定阳性对照及引物和探针序列

B.1多重荧光定量PCR检测阳性对照的制备

将产气荚膜梭菌α毒素基因169bp目的片段、β毒素基因的131bp目的片段、ε毒素基因的128bp

目的片段分别连接pCR®4-TOPO载体，再转化到JM109感受态细胞中，制备成3株重组大肠杆菌菌株，克隆

培养后提取重组质粒。取适量的以上3种质粒，使用超微量核酸蛋白仪测定浓度，按公式“copies/μL=

（6.02×1023copies/mol×浓度ng/μL）/（DNA碱基数×6.60×1011ng/mol）”计算质粒的拷贝数

（copies），使用TE缓冲液均稀释至1×1010copies/μL，再将稀释的3种阳性质粒与TE缓冲液按1:1:1:7

的比例混合均匀后，标记为1×109copies/μL阳性质粒混合液，将混合液连续梯度稀释至1×104

copies/μL，作为反应体系1阳性对照，检验后定量分装，-15℃以下保存。

选取包含产气荚膜梭菌ɩ毒素基因的qPCR引物目的基因片段附近480个碱基进行基因合成，将合成的

基因片段连接pUC57载体，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，构建带产气荚膜梭菌ɩ毒素基因的重组大

肠杆菌，克隆培养后提取重组质粒；选取包含产气荚膜梭菌cpe毒素基因的qPCR引物目的基因片段附近

501个碱基进行基因合成，将合成的基因片段连接pUC57载体，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，构建

带产气荚膜梭菌cpe毒素基因的重组大肠杆菌，克隆培养后提取重组质粒；选取包含产气荚膜梭菌NetB毒

素基因qPCR引物目的基因片段附近983个碱基进行基因合成，将合成的基因片段连接pUC57载体，转化到

大肠杆菌TOP10感受态细胞中，构建带产气荚膜梭菌NetB毒素基因的重组大肠杆菌，克隆培养后提取重组

质粒。取适量的以上3种质粒，使用超微量核酸蛋白仪测定浓度，按公式“copies/μL=（6.02×1023

copies/mol×浓度ng/μL）/（DNA碱基数×6.60×1011ng/mol）”计算质粒的拷贝数（copies），使用

TE缓冲液均稀释至1×1010copies/μL，再将稀释的3种阳性质粒与TE缓冲液按1:1:1:7的比例混合均匀后，

标记为1×109copies/μL阳性质粒混合液，将混合液连续梯度稀释至1×104copies/μL，作为反应体系

2阳性对照，检验后定量分装，-15℃以下保存。

B.2多重荧光定量PCR扩增特异性片段基因序列

B.2.1α毒素阳性对照基因序列

参考产气荚膜梭菌ATCC13124菌株（NCBIReferenceSequence:NC_008261.1）α毒素基因序

列，设计荧光定量PCR引物探针，可扩增169bp的目的片段，基因序列如下：

TACATTCTATCTTGGAGAGGCTATGCACTATTTTGGAGATATAGATACTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGC

GCAGGACATGTTAAGTTTGAGACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAG

B.2.2β毒素阳性对照基因序列

参考产气荚膜梭菌ATCC3626菌株（NCBIReferenceSequence:NZ_CP116438.1）β毒素基因序

列，设计荧光定量PCR引物探针，可扩增131bp的目的片段，基因序列如下：

AGCTGTTACTTTGTGAGTAAGCCAATTTATTTTGAATGTAAATATATGACTATCTACATTTGGGGTATCAAAAGCTAGCCTGGAA

TAGACTTGTCCTACCCAGTTAGCACCATTCCAATTAAGATAATAAC

B.2.3ε毒素阳性对照基因序列

参考产气荚膜梭菌ATCC3626菌株（NCBIReferenceSequence:NZ_CP116438.1）ε毒素基因序

列，设计荧光定量PCR引物探针，可扩增128bp的目的片段，基因序列如下：

8

DB15/T4230—2025

CCAGCTAATACTACTGTAGAAGTAATAGCATATTTAAAAAAAGTTAATGTTAAAGGAAATGTAAAGTTAGTAGGACAAGTAAGTG

GAAGTGAATGGGGAGAGATACCTAGTTATTTAGCTTTTCCTAG

B.2.4合成ɩ毒素阳性对照基因序列

TTATGGGGAAAAGAAAATTATAGTGATTGGAGTAATAAATTAACTCCTAATGAACTTGCTGATGTAAATGACTATATGCGTGGAG

GATATACCGCAATTAATAACTATTTAATATCAAATGGTCCTTTAAATAATCCTAATCCAGAACTAGACTCTAAAGTAAATAACATTGAA

AACGCATTAAAGCTCACACCTATTCCATCTAACTTAATTGTATATAGAAGGTCTGGTCCACAAGAATTTGGATTAACTCTCACATCTCC

TGAATATGATTTTAATAAAATAGAAAATATAGATGCTTTTAAAGAAAAATGGGAAGGAAAAGTAATAACATACCCAAACTTTATTAGTA

CTAGTATTGGAAGTGTAAATATGAGTGCATTTGCTAAAAGAAAAATAATACTACGTATAAACATACCAAAAGATTCTCCAGGAGCTTAT

TTATCAGCCATTCCAGGTTATGCAGGAGAATATGAAGTA

B.2.5合成cpe毒素阳性对照基因序列

AGCTATCTGCAGATGTTTTACTAAGCCATATTCCTGTTAATTTATAAATTGATCCATCATCAGAGATATTACCATGAGAAATTCT

AATAGCTTGATACTTTCTATAAGTTGCATAAACCTTATAATATACATATTCATTTGGACCAGCAGTTGTAGATACAGATCTTTCTATTG

TATTTTGTTCTCCTATAGTTATTCCAAATCCATATTCTACAGATGCTTGTATAAATTCAGAAGTAAATCCAACTGAAAAATTTACATTT

ATAGATACTTCTTTAGATTTAGTTAATGATTGGCTAAAGGTACCTGTTTCATTAGGATTAAGAATTTGACTTGAAACTACTGAGGGTTC

CCCTAATATCCAACCATCTCCTTTATCTATTACATATAATCCATCACTTAAATTTGAGTTAGAGTTTGTAATATTAATTGGTGTTTTTA

AATCCTCAGAAATAAGAAATACTTCTTTAGCATTTTCGAACACCATTGGATTTAAATTGT

B.2.6合成NetB毒素阳性对照基因序列

AAGGAGGAATTATTTTGAAAAGATTAAAAATTATTTCAATTACACTAGTTCTTACAAGTGTAATTAGTACAAGCCTTTTTTCAAC

TCAAACTCAAGTTTTTGCAAGTGAATTAAATGACATAAACAAAATTGAGTTGAAAAATCTAAGTGGAGAAATAATAAAAGAAAATGGAA

AGGAAGCTATTAAATATACTTCTAGTGATACCGCTTCACATAAAGGTTGGAAGGCAACTTTAAGTGGAACATTTATTGAAGATCCTCAT

TCTGATAAGAAAACTGCTTTATTAAATTTAGAAGGATTTATACCTTCTGATAAACAGATTTTTGGTTCTAAATATTACGGAAAAATGAA

ATGGCCTGAAACTTATAGAATTAATGTAAAAAGTGCTGATGTAAATAATAATATAAAAATAGCAAATTCTATTCCTAAAAATACTATAG

ATAAAAAAGATGTATCTAATTCAATTGGTTATTCTATAGGCGGTAATATATCTGTTGAAGGAAAAACTGCTGGTGCTGGAATAAATGCT

TCATATAATGTCCAAAATACTATAAGCTATGAACAACCTGATTTTAGAACAATTCAAAGAAAAGATGATGCAAATTTAGCATCATGGGA

TATAAAATTTGTTGAGACTAAGGACGGTTATAATATAGATTCTTATCATGCTATTTATGGAAATCAATTATTCATGAAATCAAGATTGT

ATAATAATGGTGATAAAAATTTCACAGATGATAGAGATTTATCAACATTAATTTCTGGTGGATTTTCACCCAATATGGCTTTAGCATTA

ACAGCACCTAAAAATGCTAAAGAATCTGTAATAATAGTTGAATATCAAAGATTTGATAATGACTATATTTTAAATTGGGAAACTACTCA

ATGGCGAGGAACAAACAAACTTT