《药品生物检定技术》课件-第五章 微生物限度检查法

第五章微生物限度检查法第一节概述第二节微生物总数检查第三节控制菌检查目录第五章微生物限度检查法学习目标掌握

熟悉

了解

第五章微生物限度检查法微生物限度检查法的概念、检查项目、检查方法、限度要求及结果判断微生物总数检查及控制菌检查的流程微生物限度检查对人员环境与操作的要求、微生物限度检查的意义、检查方法的验证及培养基的适用性检查等内容概述第一节第五章微生物限度检查法第一节概述（1）概念

微生物限度检查法系检查非无菌制剂及其原料、辅料、内包装材料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及控制菌检查（2）检查的意义

●保证药品质量，保障人民的用药安全●评价药品生产过程的卫生状况1.微生物限度检查法的概念及意义2.

微生物限度检查的内容及要求第一节概述微生物总数检查需氧菌总数霉菌和酵母菌总数1控制菌检查耐胆盐革兰阴性菌大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白念珠菌检查2微生物总数不得超过限度规定控制菌不得检出要求依据：《中国药典》（2020年版）第一节概述（1）总的要求

微生物限度检查应在环境洁净度为不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行（2）无菌室的设置

3.微生物限度检查法的环境要求缓冲走廊缓冲间操作间第一节概述

（3）无菌室的要求3.微生物限度检查法的环境要求温度：18~26℃湿度：40%~60%相邻环境形成正压：不低于4.9pa控温装置紫外消毒灯空气过滤净化装置定期做洁净度检查第一节概述4.微生物限度标准符合各品种项下规定的标准对于限度标准的解释101cfu：可接受的最大菌数为20102cfu：可接受的最大菌数为200103cfu：可接受的最大菌数为2000依此类推微生物总数检查第二节第五章微生物限度检查法第二节微生物总数检查试验前准备检验过程结果判断发放报告1324微生物总数检查的步骤第二节微生物总数检查1.试验前准备取样01无菌室的清洁与消毒

02试验物品准备

03取多少抽样量依据检验量3~5倍的检验量10g或10ml或100cm2；2个以上独立包装消毒剂：0.2%苯扎溴铵、75%乙醇等消毒流程：自上而下、先里后外；开启紫外灯与空气过滤装置30分钟以上消毒处理干热灭菌处理：160℃2小时足够量无菌处理湿热灭菌处理：高压蒸汽微生物总数检查采用的方法：包括微生物计数法，包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法，操作过程包含：●计数培养基适用性检查●计数方法适用性试验●供试品的检查2.

操作过程第二节微生物总数检查重点掌握：供试品的检查（1）计数培养基适用性检查●检查目的●检查方法●检查操作：包括菌种及菌液制备、阴性对照试验、培养基适用性检查2.

操作过程第二节微生物总数检查培养基是否是无菌的培养基能否保证微生物的生长阴性对照试验阳性对照试验（计数培养基的适用性检查操作流程）2.

操作过程第二节微生物总数检查菌种（复活）1#2#3#4#5#1#或2#3#或4#3#或5#培养基30~35℃18~24hr20~25℃2~3天20~25℃5~7天新鲜培养物分别接种1#或2#稀释液3#或4#适宜浓度菌液1#/2#/3#菌液分别接种不大于100cfu2个平皿2支2#培养基管1#培养基注入30~35℃不超过3天4#/5#菌液分别接种不大于100cfu2个平皿2个平皿3#培养基注入30~35℃不超过5天20~25℃不超过5天1#培养基结果①平皿的平均菌落数的比值应在0.5~2之间与对照培养基同条件下比较：②平皿的菌落形态、大小一致③液体培养基管试验菌生长良好菌种1#：金黄色葡萄球菌2#：铜绿假单胞菌3#：枯草芽孢杆菌4#：白念珠菌5#：黑曲霉菌培养基1#：胰酪大豆胨琼脂培养基2#：胰酪大豆胨液体培养基3#：沙氏葡萄糖琼脂培养基4#：沙氏葡萄糖液体培养基5#：马铃薯葡萄糖琼脂培养基稀释液1#：

PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液2#：0.9%无菌氯化钠溶液3#：0.05%聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液4#：0.05%聚山梨酯80的

0.9%无菌氯化钠溶液阳性对照菌液的制备（2）计数方法的适用性试验●检查目的：确认所采用方法适合产品微生物计数（产品的抑菌性）●适用范围：新产品或生产工艺变更的旧产品●检查方法：微生物回收试验法●检查操作包括：供试液的制备（见教材）

阳性对照菌液制备同“培养基的适用性检查”回收试验：平皿法和薄膜过滤法操作流程见下图2.

操作过程第二节微生物总数检查（计数方法的适用性试验操作流程—平皿法）2.

操作过程第二节微生物总数检查试验组供试品对照组菌液对照组菌液适量供试液各1ml2个平皿菌液适量稀释液（含菌≤100cfu/ml）倾注15-20ml适宜培养基规定条件培养计算各组平均菌落数结果判断（试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数）菌液对照组平均菌落数应在0.5~2范围内。1#：金黄色葡萄球菌2#：铜绿假单胞菌3#：枯草芽孢杆菌4#：白色念珠菌5#：黑曲霉菌试验用菌液对应培养基对应培养条件胰酪大豆胨琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基30~35℃不超过3天20~25℃不超过5天一般供试液的制备：称取供试品10g100ml稀释液中1:10供试液（最低稀释级），再根据需求做10倍递增稀释每种菌株均需验证供试液（含菌≤100cfu/ml）00cfu1ml/皿2个平皿1ml/皿2个平皿（计数方法的适用性试验操作流程—薄膜过滤法）2.

操作过程第二节微生物总数检查滤膜的要求冲洗量的规定每种培养基至少制备一张滤膜试验组供试品对照组菌液对照组培养计数同平皿法分别取10ml或适量过滤冲洗滤膜取下滤膜菌面朝上相应培养基平板上结果判断贴于（3）供试品的检查2.

操作过程第二节微生物总数检查平皿法无抑菌活性的供试品薄膜过滤法MPN法有抑菌活性的供试品仅适于需氧菌总数测定检查项目：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数所用培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温度及时间：30~35℃3~5天（需氧菌总数测定）；20~25℃

5~7天（霉菌和酵母菌总数测定）（3）供试品的检查—平皿法操作流程2.

操作过程第二节微生物总数检查供试品10g10ml100cm2稀释液1:10供试液1ml9ml稀释液1:100供试液分别注入1ml/皿2个平皿2个平皿分别注入1ml/皿2个平皿2个平皿15-20ml/皿胰酪大豆胨琼脂培养基30~35℃

培养3~5天计数15-20ml/皿沙氏葡萄糖琼脂培养基20~25℃

培养5~7天计数结果报告重点强调：计数时：①点计平板上所有的菌落数；②若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上用稀释液代替供试液同法操作进行阴性对照试验2.

操作过程第二节微生物总数检查01需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告的依据03如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数02取最髙的平均菌落数，计算lg、lml或10cm2供试品中所含的微生物数（3）供试品的检查—平皿法菌数报告规则2.

操作过程第二节微生物总数检查（3）供试品的检查—平皿法菌数报告示例各稀释级需氧菌总数平均菌落计数（cfu）菌数报告数（cfu/g，ml，10cm2）

1:10

1:1006486404206464000.50<10（3）供试品的检查—薄膜过滤法操作流程2.

操作过程第二节微生物总数检查重点强调：①用稀释液代替供试液同法操作进行阴性对照试验②计数时每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu，否则做进一步的10递增倍稀释供试品10g10ml100cm2稀释液1:10供试液10ml1个平皿1个平皿15-20ml/皿胰酪大豆胨琼脂培养基30~35℃

培养3~5天计数15-20ml/皿沙氏葡萄糖琼脂培养基20~25℃

培养5~7天过滤器结果报告10ml过滤冲洗滤膜取下滤膜菌面朝上菌数报告规则：以相当于lg、lml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数或＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数3.

结果判断第二节微生物总数检查重点强调：①需氧菌总数是胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的菌落数(包括真菌菌落数)；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落数(包括细菌菌落数）②若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合度要求，可使用含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数测定符合规定两项检査结果均符合该品种项下的规定A不符合规定B其中任一项不符合该品种项下的规定限度标准解析101cfu：最大限度为20102cfu：最大限度为200103cfu：最大限度为2000依此类推控制菌检查第三节第五章微生物限度检查法第三节控制菌检查重点强调：供试品的控制菌检查按一次检出结果为准，不再复试控制菌（致病菌）检查项目耐胆盐革兰阴性菌大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白念珠菌第三节控制菌检查重点强调：控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括：培养基的促生长、抑制能力和指示特性（1）培养基的适用性检查

所用菌种

1金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌乙型副伤寒沙门菌白念珠菌生孢梭菌2

菌液制备

参照教材3阴性对照培养基中不加阳性对照菌，其余同“适用性检查操作”4

适用性检查

检查所用的菌株及检测项目见表5-5；方法参照教材1.

培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验1.

培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验第三节控制菌检查重点强调：控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括：培养基的促生长、抑制能力和指示特性（2）检查方法的适用性试验检查方法及流程同“微生物计数法适用性检查”所用阳性对照菌液不同结果判断不同：控制菌检查用培养基制药检出阳性对照菌即可判为无抑菌性2.

对照试验第三节控制菌检查阳性对照试验重点强调：所有控制菌检查均需做阳性对照和阴性对照试验对照试验目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜操作：同供试品操作，仅加入了不超过100cfu的阳性对照菌结果要求：应呈阳性阴性对照试验目的：检查操作环境、试验物品、操作技术是否无菌操作：用稀释剂代替供试品，其余同供试品。结果要求：应呈阴性3.

耐胆盐革兰阴性菌的检查第三节控制菌检查重点强调：《中国药典》（2015年版）用“耐胆盐格兰阴性菌检查”取代2010年版药典的“大肠菌群检查”有菌生长（阳性）供试液制备及预培养供试品胰酪大豆胨液体培养基1:10供试液20~25℃培养2小时培养物定性试验划线接种预培养物1ml接种30~35℃24~48h紫红胆盐葡萄糖琼脂平板30~35℃18~24h定量试验划线接种分别接种肠道菌增菌液体培养基30~35℃24~48h紫红胆盐葡萄糖琼脂平板30~35℃18~24h肠道菌增菌液体培养基预培养物0.1/0.01/0.001ml结果判断无菌生长（阴性）查表确定可能的菌数观察平板有无菌落生长有菌生长4.

大肠埃希菌的检查第三节控制菌检查重点强调：所有口服制剂均需做这个项目的检查结果判断有菌生长（阳性）供试液制备及增菌培养供试品稀释液1:10供试液胰酪大豆胨液体培养基培养物选择培养预培养物1ml接种100ml麦康凯液体培养基42~44℃24~48h分离培养划线接种麦康凯琼脂平板30~35℃18~72h麦康凯液体培养物观察无菌生长（阴性）分离、纯化及进一步的鉴定试验30~35℃18~24h麦康凯液体培养物未检出1ml5.

沙门菌的检查第三节控制菌检查选择培养供试液制备及增菌培养供试品10g/10ml胰酪大豆胨液体培养基预培养物预培养物0.1ml接种10mlRV沙门增菌液体培养基分离培养划线接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板30~35℃18~48h沙门增菌液体培养物观察结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基斜面为红色、底层为黄色或斜面为黄色、底层为黄色或黑色，应进行适宜鉴定试验，确证是否为沙门菌30~35℃18~24h沙门增菌液体培养物若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上没有菌落生长，或有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌18~24h30~35℃高层穿刺接种疑似菌落三糖铁琼脂培养基高层斜面培养18~24h6.

铜绿假单胞菌的检查第三节控制菌检查供试液制备及增菌培养供试品稀释液1:10供试液胰酪大豆胨液体培养基培养物选择和分离培养预培养物1ml划线接种溴化十六烷基三甲铵琼脂平板30~35℃18~72h氧化酶试验无菌玻棒洁净滤纸片平板菌落滴加新配制的1%二盐酸N，N-二甲基对苯二胺试液结果判断30~35℃18~24h观察平板有无菌落生长有菌生长凃于30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌若平板上没