微生物检验标准操作规范

微生物检验标准操作规范一、概述

微生物检验是确保产品质量、食品安全及环境安全的重要手段。本规范旨在提供一套标准化的操作流程，以规范微生物检验的各个环节，确保检验结果的准确性和可靠性。规范内容涵盖检验前的准备、样品处理、培养、计数及结果分析等关键步骤，适用于各类微生物检验工作。

二、检验前的准备

（一）环境要求

1.检验环境应在洁净、通风良好的实验室中进行，避免交叉污染。

2.实验台面应定期使用75%乙醇或消毒剂进行清洁消毒。

3.工作人员需佩戴洁净工作服、口罩和手套，操作前后需洗手消毒。

（二）设备与试剂

1.主要设备：高压灭菌锅、培养箱、显微镜、菌落计数器等。

2.试剂：无菌生理盐水、营养琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂（TSB）等。

3.设备需定期校准，确保运行正常。

（三）培养基制备

1.按照标准配方称量培养基原料，如营养琼脂。

2.将培养基溶解后分装至无菌培养皿或试管中。

3.高压灭菌（通常121℃，15-20分钟）。

4.冷却后备用，培养皿需倒置放置以防水分蒸发。

三、样品处理

（一）样品采集

1.使用无菌采样工具（如无菌棉签、取样勺）采集样品。

2.采集部位应随机分布，避免污染。

3.样品量应满足检验需求（如液体样品5mL，固体样品10g）。

（二）样品前处理

1.液体样品：混匀后取适量稀释。

2.固体样品：剪碎混匀，取适量加入无菌生理盐水中研磨。

3.稀释系列：采用梯度稀释法（如10⁻¹、10⁻²、10⁻³等），确保菌落计数在30-300CFU/mL范围内。

四、培养与计数

（一）培养条件

1.将处理后的样品接种至无菌培养基上，每皿接种0.1mL-1mL。

2.培养温度：35-37℃，培养时间18-24小时。

3.嗜冷菌检验需在25-28℃培养。

（二）菌落计数

1.选用平板计数法（MPN法或平板法）。

2.平板法：计数菌落数，计算CFU/g或CFU/mL。

3.MPN法：根据稀释液和培养管中的菌落数，查表计算估计值。

五、结果分析

（一）菌落形态观察

1.使用显微镜观察菌落大小、颜色、边缘形态等特征。

2.必要时进行革兰染色，区分革兰氏阳性菌和阴性菌。

（二）数据记录与报告

1.记录菌落数、稀释倍数及检验时间。

2.结果以CFU/g或CFU/mL表示，超过标准限值需标注。

3.编制检验报告，注明样品类型、检验方法及结论。

六、注意事项

（一）无菌操作

1.所有接触样品的工具和容器必须无菌。

2.操作过程中避免空气流动，减少污染风险。

（二）安全防护

1.污染培养基需高压灭菌后丢弃。

2.操作完成后彻底清洁消毒实验台面及设备。

（三）质量控制

1.每批检验需使用阳性对照和阴性对照。

2.定期进行室内质控，确保检验结果准确。

一、概述

微生物检验是确保产品质量、食品安全及环境安全的重要手段。本规范旨在提供一套标准化的操作流程，以规范微生物检验的各个环节，确保检验结果的准确性和可靠性。规范内容涵盖检验前的准备、样品处理、培养、计数及结果分析等关键步骤，适用于各类微生物检验工作。

本规范强调操作的严谨性、无菌控制和细节管理，以最大限度地减少人为误差和环境污染。所有检验人员必须经过培训并熟悉本规范，严格按照流程执行。检验过程中产生的废弃物需按无菌和生物安全要求处理，以防止交叉污染和安全事故。

二、检验前的准备

（一）环境要求

1.检验环境：应在生物安全柜内或经过认证的洁净实验室进行。生物安全柜应定期进行性能验证（如风量、风速、沉降菌测试），确保运行符合要求。实验台面应使用中性清洁剂和消毒剂（如70-75%乙醇或含氯消毒液）每日至少清洁消毒两次，并在每次使用后进行表面消毒。

2.空气净化：实验室应保持正压，空气过滤系统应定期检查和维护，确保空气洁净度。操作区域应尽量减少不必要的人员走动，以降低空气扰动。

3.温湿度控制：实验室温度应维持在18-26℃，相对湿度控制在40%-60%。培养箱等设备应放置在远离热源和阳光直射的位置，确保其工作稳定。

（二）设备与试剂

1.主要设备：

(1)高压灭菌锅：应能承受至少121℃、15磅/英寸²（约1.05kg/cm²）压力。使用前需检查压力表、安全阀是否正常，定期进行灭菌效果验证（如使用嗜热脂肪芽孢菌片）。

(2)培养箱：需配备温控器，能精确维持35-37℃（常规菌）或特定温度（如25-28℃用于嗜冷菌）。使用前需进行空载校准，定期检查温度均匀性。

(3)超净工作台/生物安全柜：使用前需进行紫外线照射消毒30分钟，然后开启通风15-30分钟，检查风速和过滤效果。

(4)显微镜：应配备不同倍数物镜，用于菌落形态观察和革兰染色后细菌鉴定。

(5)菌落计数器：电子或手动计数器，需定期校准以确保计数准确性。

(6)天平：精度达到0.1g，用于称量培养基和样品。

(7)恒温水浴锅：用于样品处理（如研磨）或试剂加热。

2.试剂与培养基：

(1)无菌生理盐水：使用前需确认包装完好，未开封或经高压灭菌处理。用于样品稀释和冲洗。

(2)营养琼脂（NA）：基础培养基，用于通用菌的分离和培养。需按说明书比例称量、溶解、分装、高压灭菌。

(3)胰酪大豆胨琼脂（TSB）：用于增菌和保存。需按说明书比例称量、溶解、分装、高压灭菌。

(4)革兰氏染色试剂：包括结晶紫、碘液、酒精脱色剂、复红。需检查试剂有效期和浓度，按标准流程使用。

(5)其他特定培养基：根据检验对象选择，如沙氏培养基（用于真菌）、血琼脂（用于需氧菌增菌或鉴定）等。所有培养基制备后均需进行无菌试验和凝固性检查。

3.个人防护用品（PPE）：

(1)洁净工作服：进入实验室必须穿戴，避免污染。

(2)口罩：能有效遮盖口鼻，操作时佩戴。

(3)无菌手套：接触样品、培养基等操作时佩戴，一次性使用，用后立即丢弃。

(4)护目镜/面屏：操作可能产生飞溅时佩戴，保护眼睛和面部。

（三）培养基制备（详细步骤）

1.称量：根据培养基总重量和所需配方，精确称量各组分（如琼脂粉、蛋白胨、牛肉提取物等）。例如，制备1L营养琼脂，通常称量15g琼脂粉和20g蛋白胨、10g牛肉提取物。

2.溶解：将称量好的组分加入适量蒸馏水或去离子水中，在搅拌器上搅拌或加热助溶，直至完全溶解。确保无沉淀或未融化的琼脂颗粒。

3.分装：待培养基冷却至60-65℃（不烫手）时，将其倒入无菌培养皿（约15-20mL/皿）或无菌试管/三角瓶中。分装量应考虑冷却后培养基收缩及培养时菌落生长空间。

4.无菌封口与灭菌：对于试管，用棉塞或硅胶塞封口；对于三角瓶，可用牛皮纸封口或直接高压灭菌。高压灭菌参数通常为121℃、15-20分钟。注意排尽瓶内空气，防止培养基爆沸。

5.冷却与储存：灭菌后，将培养皿倒置放置在超净工作台或无菌环境中冷却至室温。试管可静置冷却。冷却后的培养基应密封保存于4℃冰箱，标注名称、制备日期和有效期（通常为2-4周）。

三、样品处理

（一）样品采集

1.采样工具：必须使用无菌采样工具，如无菌棉签（不同规格）、无菌取样勺/铲、无菌注射器等。采样工具使用前需在酒精灯火焰上烧灼灭菌或使用一次性无菌工具。

2.采样计划：根据检验目的和样品特性，制定采样计划。确保样品能代表整体批次的状况。采样点应具有代表性，如液体样品取不同批次、不同位置；固体样品取表面、内部、不同包装等。

3.样品量：采集的样品量应足以进行所有必要的检验项目，并留有备份。参考如下示例：

(1)液体食品（如饮料、酱料）：每份样品取5mL-10mL。

(2)固体食品（如肉制品、糕点）：每份样品取10g-20g。

(3)空气样品：使用撞击式采样器，撞击面积通常为38cm²。

(4)表面样品：使用无菌棉签擦拭规定面积（如5cmx5cm）。

4.样品标识与保存：采集的样品应立即贴上标签，注明样品名称、编号、采集日期、采集人等信息。根据样品类型和待检微生物，选择合适的保存条件（如4℃冷藏、冷冻或加入无菌稀释液）。尽快进行检验，一般不超过4-6小时。

（二）样品前处理（详细步骤）

1.液体样品处理：

(1)混匀：轻轻摇动或搅拌样品，确保均匀。

(2)稀释：根据初步估计的污染水平，选择合适的稀释液（通常是无菌生理盐水）进行系列稀释。例如：

-取1mL样品加入9mL生理盐水中，混匀（10⁻¹稀释）。

-取1mL10⁻¹稀释液加入9mL生理盐水中，混匀（10⁻²稀释）。

-依此类推，直至稀释液中的菌落数在30-300CFU/mL范围内。

(3)取样接种：根据后续检验方法（平板法或MPN法）和所需接种量，从合适的稀释梯度中取0.1mL-1mL样品接种至培养基。

2.固体样品处理：

(1)剪碎混匀：对于大块固体样品（如肉块、蔬菜），将其剪成小块（约2-5mm），充分混匀。

(2)选择性稀释：取10g-20g样品加入90mL-180mL无菌生理盐水中，使用组织捣碎器或研钵充分研磨，制成匀浆。此匀浆液可作为10⁻¹稀释液。

(3)稀释系列制备：参照液体样品处理方法，对匀浆液进行系列稀释。

3.表面样品处理：

(1)擦拭：将无菌棉签在样品表面按规定方式擦拭（如旋转擦拭5次），确保棉签充分吸收表面微生物。

(2)洗脱：将棉签放入含有一定体积无菌生理盐水（如10mL）的试管中，使用无菌玻璃珠或匀浆器充分振荡洗脱。

(3)稀释：取适量洗脱液进行系列稀释。

4.嗜冷菌处理：对于检验嗜冷菌（如某些李斯特菌），样品采集后应立即在4℃条件下处理，并使用适合嗜冷菌生长的培养基（如TSB或特殊嗜冷菌培养基），在25-28℃条件下进行培养。

四、培养与计数

（一）培养条件

1.接种：根据检验项目和稀释倍数，将样品接种至合适的无菌培养基中。

(1)平板法：将0.1mL-0.2mL稀释液滴加到无菌培养皿中的营养琼脂表面，使用无菌玻璃刮刀或涂布棒均匀涂布。

(2)显微镜接种：对于镜检，将样品涂布在载玻片上，干燥后染色。

(3)增菌培养：将样品接种至TSB等增菌液中，用于提高目标菌浓度。

2.培养箱培养：将接种后的培养皿或试管放入培养箱中。

(1)温度：根据待检微生物种类设定培养温度。常用温度为35-37℃（需氧菌），35-30℃（兼性厌氧菌），25-28℃（嗜冷菌）。使用温度计监测培养箱内温度，确保稳定。

(2)时间：培养时间通常为18-24小时，某些特殊微生物（如分枝杆菌）可能需要48-72小时或更长时间。培养结束后检查培养基颜色和透明度。

3.嗜冷菌特殊培养：如前所述，在较高温度（如25-28℃）下培养，并可能需要更长的培养时间（如48小时）。

（二）菌落计数（详细步骤）

1.平板计数法（典型平板法）：

(1)观察与选择：培养后，观察平板上菌落的生长情况。选择菌落数在30-300个/皿的稀释液平板进行计数。若菌落数过多，需进行下一级稀释后再计数；若菌落数过少，则需计数原始稀释液或更高稀释度的平板（根据实际稀释倍数计算）。

(2)计数：采用菌落计数器逐个计数选定平板上的独立菌落。对于难以区分的连片菌落，可挑取部分进行分离。

(3)计算：CFU/g或CFU/mL=(平板菌落数×稀释倍数)/接种量（mL或g）。例如，在10⁻³稀释液中，1个平板计数为50CFU，接种量为0.1mL，则细菌数为(50×10³)/0.1=5×10⁶CFU/mL。

2.转移平板法（用于选择特定菌落）：

(1)操作：在菌落计数前，将平板上的单个菌落用接种环或涂布棒挑取，转移到新的无菌平板上，进行划线分离或点种。

(2)目的：用于获得纯培养物，用于后续鉴定或药敏试验。

3.MPN（MostProbableNumber，最可能数）法：

(1)适用：适用于样品中微生物数量较低，难以在平板上形成可见菌落的情况，常用于水样或食品中大肠菌群等的估计。

(2)操作：将三个不同稀释度的样品分别接种于三个装有液体培养基（如MPN肉汤管）的试管中。同时设置三个不接种样品的空白对照管。培养后，记录每个管中是否有菌生长（阳性或阴性）。

(3)查表计算：根据各稀释度管的阳性/阴性结果，查阅MPN表（根据所用培养基和稀释度），得到该样品的MPN估计值（单位通常是MPN/100mL或MPN/g）。

五、结果分析

（一）菌落形态观察

1.宏观观察：记录菌落的大小、形状（圆形、椭圆形等）、颜色（白色、黄色、粉色等）、边缘形态（光滑、粗糙、丝状）、表面光泽（湿润、干燥、黏液状）、透明度（透明、半透明、不透明）以及培养特性（如产气、溶血）。

2.显微镜检查：制备菌悬液（革兰染色或美兰染色），在显微镜下观察细菌的形态（球状、杆状、螺旋状）、大小、颜色（革兰染色后G⁺为紫色，G⁻为红色）、排列方式（单个、成对、链状、簇状）以及特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢）。

3.鉴定线索：结合菌落形态和显微镜下的菌体形态，初步判断可能的微生物种类。例如，葡萄状、成对或链状的球菌可能是链球菌属；杆状菌、两端钝圆可能是大肠杆菌；丝状菌可能是放线菌属。

（二）数据记录与报告

1.数据记录：详细记录检验过程中的所有信息，包括：

(1)样品信息：来源、编号、类型、采集日期等。

(2)检验项目：具体的微生物指标。

(3)检验方法：所使用的培养基、稀释液、培养条件、计数方法等。

(4)检验结果：各指标的菌落数或MPN值、菌落形态特征、显微镜观察结果等。

(5)质量控制：阳性对照、阴性对照的结果。

2.报告编制：根据检验结果，按照实验室报告模板编制检验报告。报告内容应包括：

(1)样品标识信息。

(2)检验目的和项目。

(3)检验依据（如内部SOP、参考方法）。

(4)检验过程简述（关键步骤）。

(5)检验结果（明确指出是否合格，如菌落数低于/高于某个限值）。

(6)菌落形态特征描述。

(7)结论和建议（如有必要，如需进一步鉴定或采取控制措施）。

(8)检验人、审核人签名及日期。

3.结果解释：根据标准限值或客户要求，对检验结果进行解释。例如，若大肠菌群MPN值超过标准限值，则表明样品卫生状况可能存在问题。

六、注意事项

（一）无菌操作

1.环境控制：在超净工作台或生物安全柜内进行所有无菌操作。操作前开启通风，确保洁净环境。

2.工具使用：所有接触样品和培养基的工具必须无菌。使用前检查包装完整性，必要时高压灭菌。使用一次性无菌工具可减少污染风险。

3.手部卫生：操作前必须用肥皂和流动水洗手，并用70-75%乙醇消毒。避免手直接接触培养基和样品。

4.培养皿处理：倾倒培养基时避免培养基溅出皿外。培养皿应倒置放置，防止冷凝水滴落污染菌落。

5.去除污染：操作过程中如发生污染（如培养基被污染），应立即停止检验，分析污染原因，并对受影响的培养基、设备进行彻底清洁消毒或废弃处理。

（二）安全防护

1.污染物处理：所有可能被微生物污染的废弃物（如培养基、试管、手套等）必须先高压灭菌（121℃，15-20分钟）后才能丢弃。锐器（如接种环、针头）应放入锐器盒中。

2.消毒：操作结束后，使用合适的消毒剂（如70-75%乙醇或含氯消毒液）清洁工作台面、设备表面及地面。定期对生物安全柜进行表面消毒和空气滤网更换。

3.个人防护：根据操作风险级别，佩戴适当级别的个人防护用品（PPE）。处理潜在生物危害样品时，应佩戴防护服、手套、口罩，必要时佩戴护目镜或面屏。

（三）质量控制

1.阳性对照：每次检验批必须设置阳性对照，接种已知浓度的标准菌（如大肠杆菌），确保培养基、培养条件等能支持目标微生物生长。阳性对照结果应为阳性，否则检验无效。

2.阴性对照：设置无菌对照（未接种样品的培养基），检验过程是否存在污染。阴性对照结果应为无菌或无污染菌落，否则检验无效。

3.内部质控：定期使用内部质控菌株，检验检验方法和设备的可靠性。记录并分析质控结果，发现异常及时调查和纠正。

4.室内实验：定期参加实验室间比对（如能力验证计划），与其他实验室比较检验结果，评估自身检验水平。

5.记录审核：所有检验记录必须真实、完整、及时，并由专人定期审核，确保记录的准确性和规范性。

一、概述

微生物检验是确保产品质量、食品安全及环境安全的重要手段。本规范旨在提供一套标准化的操作流程，以规范微生物检验的各个环节，确保检验结果的准确性和可靠性。规范内容涵盖检验前的准备、样品处理、培养、计数及结果分析等关键步骤，适用于各类微生物检验工作。

二、检验前的准备

（一）环境要求

1.检验环境应在洁净、通风良好的实验室中进行，避免交叉污染。

2.实验台面应定期使用75%乙醇或消毒剂进行清洁消毒。

3.工作人员需佩戴洁净工作服、口罩和手套，操作前后需洗手消毒。

（二）设备与试剂

1.主要设备：高压灭菌锅、培养箱、显微镜、菌落计数器等。

2.试剂：无菌生理盐水、营养琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂（TSB）等。

3.设备需定期校准，确保运行正常。

（三）培养基制备

1.按照标准配方称量培养基原料，如营养琼脂。

2.将培养基溶解后分装至无菌培养皿或试管中。

3.高压灭菌（通常121℃，15-20分钟）。

4.冷却后备用，培养皿需倒置放置以防水分蒸发。

三、样品处理

（一）样品采集

1.使用无菌采样工具（如无菌棉签、取样勺）采集样品。

2.采集部位应随机分布，避免污染。

3.样品量应满足检验需求（如液体样品5mL，固体样品10g）。

（二）样品前处理

1.液体样品：混匀后取适量稀释。

2.固体样品：剪碎混匀，取适量加入无菌生理盐水中研磨。

3.稀释系列：采用梯度稀释法（如10⁻¹、10⁻²、10⁻³等），确保菌落计数在30-300CFU/mL范围内。

四、培养与计数

（一）培养条件

1.将处理后的样品接种至无菌培养基上，每皿接种0.1mL-1mL。

2.培养温度：35-37℃，培养时间18-24小时。

3.嗜冷菌检验需在25-28℃培养。

（二）菌落计数

1.选用平板计数法（MPN法或平板法）。

2.平板法：计数菌落数，计算CFU/g或CFU/mL。

3.MPN法：根据稀释液和培养管中的菌落数，查表计算估计值。

五、结果分析

（一）菌落形态观察

1.使用显微镜观察菌落大小、颜色、边缘形态等特征。

2.必要时进行革兰染色，区分革兰氏阳性菌和阴性菌。

（二）数据记录与报告

1.记录菌落数、稀释倍数及检验时间。

2.结果以CFU/g或CFU/mL表示，超过标准限值需标注。

3.编制检验报告，注明样品类型、检验方法及结论。

六、注意事项

（一）无菌操作

1.所有接触样品的工具和容器必须无菌。

2.操作过程中避免空气流动，减少污染风险。

（二）安全防护

1.污染培养基需高压灭菌后丢弃。

2.操作完成后彻底清洁消毒实验台面及设备。

（三）质量控制

1.每批检验需使用阳性对照和阴性对照。

2.定期进行室内质控，确保检验结果准确。

一、概述

微生物检验是确保产品质量、食品安全及环境安全的重要手段。本规范旨在提供一套标准化的操作流程，以规范微生物检验的各个环节，确保检验结果的准确性和可靠性。规范内容涵盖检验前的准备、样品处理、培养、计数及结果分析等关键步骤，适用于各类微生物检验工作。

本规范强调操作的严谨性、无菌控制和细节管理，以最大限度地减少人为误差和环境污染。所有检验人员必须经过培训并熟悉本规范，严格按照流程执行。检验过程中产生的废弃物需按无菌和生物安全要求处理，以防止交叉污染和安全事故。

二、检验前的准备

（一）环境要求

1.检验环境：应在生物安全柜内或经过认证的洁净实验室进行。生物安全柜应定期进行性能验证（如风量、风速、沉降菌测试），确保运行符合要求。实验台面应使用中性清洁剂和消毒剂（如70-75%乙醇或含氯消毒液）每日至少清洁消毒两次，并在每次使用后进行表面消毒。

2.空气净化：实验室应保持正压，空气过滤系统应定期检查和维护，确保空气洁净度。操作区域应尽量减少不必要的人员走动，以降低空气扰动。

3.温湿度控制：实验室温度应维持在18-26℃，相对湿度控制在40%-60%。培养箱等设备应放置在远离热源和阳光直射的位置，确保其工作稳定。

（二）设备与试剂

1.主要设备：

(1)高压灭菌锅：应能承受至少121℃、15磅/英寸²（约1.05kg/cm²）压力。使用前需检查压力表、安全阀是否正常，定期进行灭菌效果验证（如使用嗜热脂肪芽孢菌片）。

(2)培养箱：需配备温控器，能精确维持35-37℃（常规菌）或特定温度（如25-28℃用于嗜冷菌）。使用前需进行空载校准，定期检查温度均匀性。

(3)超净工作台/生物安全柜：使用前需进行紫外线照射消毒30分钟，然后开启通风15-30分钟，检查风速和过滤效果。

(4)显微镜：应配备不同倍数物镜，用于菌落形态观察和革兰染色后细菌鉴定。

(5)菌落计数器：电子或手动计数器，需定期校准以确保计数准确性。

(6)天平：精度达到0.1g，用于称量培养基和样品。

(7)恒温水浴锅：用于样品处理（如研磨）或试剂加热。

2.试剂与培养基：

(1)无菌生理盐水：使用前需确认包装完好，未开封或经高压灭菌处理。用于样品稀释和冲洗。

(2)营养琼脂（NA）：基础培养基，用于通用菌的分离和培养。需按说明书比例称量、溶解、分装、高压灭菌。

(3)胰酪大豆胨琼脂（TSB）：用于增菌和保存。需按说明书比例称量、溶解、分装、高压灭菌。

(4)革兰氏染色试剂：包括结晶紫、碘液、酒精脱色剂、复红。需检查试剂有效期和浓度，按标准流程使用。

(5)其他特定培养基：根据检验对象选择，如沙氏培养基（用于真菌）、血琼脂（用于需氧菌增菌或鉴定）等。所有培养基制备后均需进行无菌试验和凝固性检查。

3.个人防护用品（PPE）：

(1)洁净工作服：进入实验室必须穿戴，避免污染。

(2)口罩：能有效遮盖口鼻，操作时佩戴。

(3)无菌手套：接触样品、培养基等操作时佩戴，一次性使用，用后立即丢弃。

(4)护目镜/面屏：操作可能产生飞溅时佩戴，保护眼睛和面部。

（三）培养基制备（详细步骤）

1.称量：根据培养基总重量和所需配方，精确称量各组分（如琼脂粉、蛋白胨、牛肉提取物等）。例如，制备1L营养琼脂，通常称量15g琼脂粉和20g蛋白胨、10g牛肉提取物。

2.溶解：将称量好的组分加入适量蒸馏水或去离子水中，在搅拌器上搅拌或加热助溶，直至完全溶解。确保无沉淀或未融化的琼脂颗粒。

3.分装：待培养基冷却至60-65℃（不烫手）时，将其倒入无菌培养皿（约15-20mL/皿）或无菌试管/三角瓶中。分装量应考虑冷却后培养基收缩及培养时菌落生长空间。

4.无菌封口与灭菌：对于试管，用棉塞或硅胶塞封口；对于三角瓶，可用牛皮纸封口或直接高压灭菌。高压灭菌参数通常为121℃、15-20分钟。注意排尽瓶内空气，防止培养基爆沸。

5.冷却与储存：灭菌后，将培养皿倒置放置在超净工作台或无菌环境中冷却至室温。试管可静置冷却。冷却后的培养基应密封保存于4℃冰箱，标注名称、制备日期和有效期（通常为2-4周）。

三、样品处理

（一）样品采集

1.采样工具：必须使用无菌采样工具，如无菌棉签（不同规格）、无菌取样勺/铲、无菌注射器等。采样工具使用前需在酒精灯火焰上烧灼灭菌或使用一次性无菌工具。

2.采样计划：根据检验目的和样品特性，制定采样计划。确保样品能代表整体批次的状况。采样点应具有代表性，如液体样品取不同批次、不同位置；固体样品取表面、内部、不同包装等。

3.样品量：采集的样品量应足以进行所有必要的检验项目，并留有备份。参考如下示例：

(1)液体食品（如饮料、酱料）：每份样品取5mL-10mL。

(2)固体食品（如肉制品、糕点）：每份样品取10g-20g。

(3)空气样品：使用撞击式采样器，撞击面积通常为38cm²。

(4)表面样品：使用无菌棉签擦拭规定面积（如5cmx5cm）。

4.样品标识与保存：采集的样品应立即贴上标签，注明样品名称、编号、采集日期、采集人等信息。根据样品类型和待检微生物，选择合适的保存条件（如4℃冷藏、冷冻或加入无菌稀释液）。尽快进行检验，一般不超过4-6小时。

（二）样品前处理（详细步骤）

1.液体样品处理：

(1)混匀：轻轻摇动或搅拌样品，确保均匀。

(2)稀释：根据初步估计的污染水平，选择合适的稀释液（通常是无菌生理盐水）进行系列稀释。例如：

-取1mL样品加入9mL生理盐水中，混匀（10⁻¹稀释）。

-取1mL10⁻¹稀释液加入9mL生理盐水中，混匀（10⁻²稀释）。

-依此类推，直至稀释液中的菌落数在30-300CFU/mL范围内。

(3)取样接种：根据后续检验方法（平板法或MPN法）和所需接种量，从合适的稀释梯度中取0.1mL-1mL样品接种至培养基。

2.固体样品处理：

(1)剪碎混匀：对于大块固体样品（如肉块、蔬菜），将其剪成小块（约2-5mm），充分混匀。

(2)选择性稀释：取10g-20g样品加入90mL-180mL无菌生理盐水中，使用组织捣碎器或研钵充分研磨，制成匀浆。此匀浆液可作为10⁻¹稀释液。

(3)稀释系列制备：参照液体样品处理方法，对匀浆液进行系列稀释。

3.表面样品处理：

(1)擦拭：将无菌棉签在样品表面按规定方式擦拭（如旋转擦拭5次），确保棉签充分吸收表面微生物。

(2)洗脱：将棉签放入含有一定体积无菌生理盐水（如10mL）的试管中，使用无菌玻璃珠或匀浆器充分振荡洗脱。

(3)稀释：取适量洗脱液进行系列稀释。

4.嗜冷菌处理：对于检验嗜冷菌（如某些李斯特菌），样品采集后应立即在4℃条件下处理，并使用适合嗜冷菌生长的培养基（如TSB或特殊嗜冷菌培养基），在25-28℃条件下进行培养。

四、培养与计数

（一）培养条件

1.接种：根据检验项目和稀释倍数，将样品接种至合适的无菌培养基中。

(1)平板法：将0.1mL-0.2mL稀释液滴加到无菌培养皿中的营养琼脂表面，使用无菌玻璃刮刀或涂布棒均匀涂布。

(2)显微镜接种：对于镜检，将样品涂布在载玻片上，干燥后染色。

(3)增菌培养：将样品接种至TSB等增菌液中，用于提高目标菌浓度。

2.培养箱培养：将接种后的培养皿或试管放入培养箱中。

(1)温度：根据待检微生物种类设定培养温度。常用温度为35-37℃（需氧菌），35-30℃（兼性厌氧菌），25-28℃（嗜冷菌）。使用温度计监测培养箱内温度，确保稳定。

(2)时间：培养时间通常为18-24小时，某些特殊微生物（如分枝杆菌）可能需要48-72小时或更长时间。培养结束后检查培养基颜色和透明度。

3.嗜冷菌特殊培养：如前所述，在较高温度（如25-28℃）下培养，并可能需要更长的培养时间（如48小时）。

（二）菌落计数（详细步骤）

1.平板计数法（典型平板法）：

(1)观察与选择：培养后，观察平板上菌落的生长情况。选择菌落数在30-300个/皿的稀释液平板进行计数。若菌落数过多，需进行下一级稀释后再计数；若菌落数过少，则需计数原始稀释液或更高稀释度的平板（根据实际稀释倍数计算）。

(2)计数：采用菌落计数器逐个计数选定平板上的独立菌落。对于难以区分的连片菌落，可挑取部分进行分离。

(3)计算：CFU/g或CFU/mL=(平板菌落数×稀释倍数)/接种量（mL或g）。例如，在10⁻³稀释液中，1个平板计数为50CFU，接种量为0.1mL，则细菌数为(50×10³)/0.1=5×10⁶CFU/mL。

2.转移平板法（用于选择特定菌落）：

(1)操作：在菌落计数前，将平板上的单个菌落用接种环或涂布棒挑取，转移到新的无菌平板上，进行划线分离或点种。

(2)目的：用于获得纯培养物，用于后续鉴定或药敏试验。

3.MPN（MostProbableNumber，最可能数）法：

(1)适用：适用于样品中微生物数量较低，难以在平板上形成可见菌落的情况，常用于水样或食品中大肠菌群等的估计。

(2)操作：将三个不同稀释度的样品分别接种于三个装有液体培养基（如MPN肉汤管）的试管中。同时设置三个不接种样品的空白对照管。培养后，记录每个管中是否有菌生长（阳性或阴性）。

(3)查表计算：根据各稀释度管的阳性/阴性结果，查阅MPN表（根据所用培养基和稀释度），得到该样品的MPN估计值（单位通常是MPN/100mL或MPN/g）。

五、结果分析

（一）菌落形态观察

1.宏观观察：记录菌落的大小、形状（圆形、椭圆形等）、颜色（白色、黄色、粉色等）、边缘形态（光滑、粗糙、丝状）、表面光泽（湿润、干燥、黏液状）、透明度（透明、半透明、不透明）以及培养特性（如产气、溶血）。

2.显微镜检查：制备菌悬液（革兰染色或美兰染色），在显微镜下观察细菌的形态（球状、杆状、螺旋状）、大小、颜色（革兰染色后G⁺为紫色，G⁻为红色）、排列方式（单个、成对、链状、簇状）以及特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢）。

3.鉴定线索：结合菌落形态和显微镜下的菌体形态，初步判断可能的