基因工程制药的下游技术课件

第八节基因工程制药的下游技术

一、重组工程菌的培养二、基因工程药物的分离纯化三、基因工程药物的质量控制四、基因工程药物制造实例基因工程制药的下游技术获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装制备基因工程药物的一般程序上游阶段下游阶段基因工程制药的下游技术一、重组工程菌的培养基因工程制药的下游技术（一）、基因工程菌的培养方式分批培养(batchculture）补料分批培养(fedbatchculture）连续培养(continuousculture）透析培养(dialysisculture）固定化培养(immobilizedculture）基因工程制药的下游技术分批培养定义：将种子液和培养基一次性装入反应器内，经过一定时间培养后一次性出料的培养过程。补料分批培养：将种子接人发酵罐中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法基因工程制药的下游技术连续培养定义：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。两阶段连续培养基因工程制药的下游技术透析培养定义：利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响基因工程制药的下游技术固定化培养基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利基因工程制药的下游技术（二）、基因工程菌的培养工艺生物工程菌为含有带外源基因的重组载体的微生物细胞生物工程菌的发酵生产的目的是希望能获得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染发酵水平的好坏还直接影响产品的纯化及其质量基因工程制药的下游技术2.1培养基的影响培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达使用不同的培养基对菌体生长和外源基因表达有较大的影响基因工程制药的下游技术碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖及果糖等氮源：酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵及氯化铵等无机盐、微量元素、维生素、生物素等基因工程制药的下游技术2.2接种量的影响接种量：指移入的种子液体积和培养液体积的比例，它的大小影响发酵的产量和发酵周期接种量小，菌体延迟期较长，不利于外源基因的表达。采用大接种量，可以缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会；但接种量过高往往会使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长

基因工程制药的下游技术温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子合成等水平上温度影响蛋白质的活性和包含体的形成2.3温度的影响基因工程制药的下游技术溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和产物生成的影响很大。菌群在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给很重要采用调整搅拌转速的方法可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量（发酵前期采用较低转速，培养后期采用高搅拌转速）2.4溶解氧的影响基因工程制药的下游技术在发酵过程中pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件决定采用两阶段培养工艺，培养前期阶段着重于优化工程菌的最佳生长条件（最佳pH范围为6.8-7.4），培养后期阶段着重于优化外源蛋白的表达条件（最佳pH为6.0-6.5）

2.5pH的影响基因工程制药的下游技术诱导时机的影响：一般在对数生长期或对数生长后期诱导表达诱导表达程序的影响2.6其他影响基因工程制药的下游技术二、基因工程药物的分离纯化

基因工程制药的下游技术基因工程药物的特点目的产物在初始物料中含量低含目的产物的初始物料组成复杂目的产物的稳定性差种类繁多应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源等基因工程制药的下游技术（一）、建立工艺需了解各种因素含目的产物的初始物料的特点物料中杂质种类和性质目的产物特性产品质量要求基因工程制药的下游技术（二）、分离纯化的基本过程细胞破碎固液分离浓缩与初步纯化高度纯化直至得到纯品成品加工基因工程制药的下游技术（三）、细胞的破碎方法物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法化学破碎法：渗透冲击、增溶法、脂溶法生物破碎法：酶溶法基因工程制药的下游技术（四）、固液分离离心沉淀：高速离心和超速离心膜过滤：微滤、超滤和反渗透双水相萃取

基因工程制药的下游技术（五）、重组蛋白质的分离纯化分离纯化主要依赖色谱分离方法。分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱等色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应基因工程制药的下游技术离子交换层析离子交换层析(ionexchangechromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法基因工程制药的下游技术离子交换色谱分辨率高、容量大、操作容易，为多肽、蛋白质、核酸和许多发酵产物分离纯化的一种重要方法阳离子交换剂和阴离子交换剂基因工程制药的下游技术疏水层析疏水层析(hydrophobicinteractionchromatography，HIC）是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法广泛应用于蛋白质类大分子的分离以及蛋白质结构和折叠机制的研究等基因工程制药的下游技术在高盐浓度时，蛋白质与固定相疏水缔合；盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来疏水色谱回收率较高，蛋白质与固定相的疏水作用力较弱，蛋白质变性的可能性小，蛋白质活性在层析分离过程中不易丧失基因工程制药的下游技术亲和层析亲和层析(affinitychromatography，AC）是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除基因工程制药的下游技术亲和色谱是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在生物分离中有广泛的应用。同时也可用于某些生物大分子结构和功能的研究基因工程制药的下游技术凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography）又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。填料有一定大小范围的孔径，大分子进不去先洗脱，小分子进入孔径而后被阻滞，不同的蛋白质根据它们大小和形状的不同在层析柱中被分离基因工程制药的下游技术优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物学活性等缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近的分子之间基因工程制药的下游技术广泛用于蛋白质(酶）、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化用于蛋白质相对分子质量的测定、脱盐、样品浓缩等基因工程制药的下游技术（六）、非蛋白质类杂质的去除DNA的去除：离子交换层析、亲和层析、疏水层析热原质的去除：最好的方法是防止产生热原质，阴离子交换层析法，疏水层析法，亲和层析法（多黏菌素B）病毒的去除：色谱分离、紫外线照射和过滤基因工程制药的下游技术根据产物表达形式来选择根据分离单元之间的衔接选择根据分离纯化工艺的要求来选择（七）、选择分离纯化方法的依据基因工程制药的下游技术7.1根据产物表达形式来选择分泌型表达产物：浓缩处理（沉淀和超滤）可溶性表达产物：亲和层析，离子交换周质表达产物：低浓度溶菌酶处理后，采用渗透压休克的方法基因工程制药的下游技术包含体：对蛋白质分离纯化有两方面的影响，一是它可以很容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，蛋白纯化较容易完成；另一方面产物经过了一个变性复性过程，较易形成产物的错误折叠和聚合体

基因工程制药的下游技术选择不同机制的分离单元组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效分离手段，将含量最多的杂质先分离去除，将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段7.2根据分离单元之间的衔接选择基因工程制药的下游技术先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质随后采用高分辨率的操作单元，如离子交换色谱和亲和色谱最后选用分离规模小、分离速度慢的操作单元如凝胶排阻色谱，可以提高分离效果基因工程制药的下游技术色谱分离次序的选择经盐析得到的液体不适宜于离子交换层析，可直接应用疏水层析离子交换色谱之后进行疏水层析比较合适亲和层析多放在第二步以后凝胶过滤色谱放在最后一步基因工程制药的下游技术要具有良好的稳定性和重复性要尽可能减少组成工艺的步骤组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也能相互适应，从而减少步骤之间对物料的处理和条件调整7.3根据分离纯化工艺的要求来选择

基因工程制药的下游技术在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量工艺时间要尽可能短（生物活性收率会降低）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备要求低，能耗低具有较高的安全性基因工程制药的下游技术三、基因工程药物的质量控制基因工程制药的下游技术1983年美国FDA制定“重组DNA生产的药品、生物制品生产与检定要点”1988年与1990年欧共体分别制定“基因重组技术医药用产品生产与质量控制”、“生物技术医药产品临床前生物安全性试验要求”与“生物技术生产细胞因子的质量控制”基因工程制药的下游技术1990年中国卫生部相继颁发“人用重组DNA制品质量控制要点”

1991年世界卫生组织正式公布“重组DNA生产的药品生物制品的生产和检定要点”2000年中国颁布执行《中国生物制品规程》基因工程制药的下游技术（一）、医药生物技术产品质量保证要点产品安全性评价：临床试验产品本身的结构：药理学、毒理学研究严格控制条件：从原料到制成品制备全过程的每一步都须严格控制条件与鉴定质量，确保符合标准规格、安全有效基因工程制药的下游技术（二）、生物材料的质量控制原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定目的基因，表达载体，宿主细胞基因工程制药的下游技术（三）、培养过程的质量控制在贮存中，要求种子克隆纯而稳定在培养过程中，要求质粒稳定，始终无突变重复生产发酵中，工程菌表达稳定始终能排除外源微生物污染基因工程制药的下游技术（四）、纯化过程的质量控制分离纯化过程质量控制要求：保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带人的有害化学物质及热原质，或者将这类杂质都控制在规定限度以下基因工程制药的下游技术（五）、目标产品的质量控制基因工程药物质量控制主要要点：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性任何一种单一的分析方法都无法满足对该类产品的检测要求基因工程制药的下游技术生物活性测定体内生物活性测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型体外生物活性测定方法：细胞培养计数法3H-TαR掺入法和酶法细胞计数等蛋白质的比活性：每毫克蛋白质的生物学活性。不仅是含量指标，也是纯度指标基因工程制药的下游技术理化性质鉴定非特异性鉴别特异性鉴别：免疫印迹和点免疫相对分子质量测定：凝胶过滤法和SDS法等电点测定：等电聚焦电泳法基因工程制药的下游技术肽图分析：用酶法或化学法降解目的蛋白质后，对生成的肽段进行的分离分析，它是一种可检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法蛋白质降解形成的肽段鉴定：用SDS电泳法、高效液相色谱、毛细管电泳法及质谱法基因工程制药的下游技术氨基酸组成分析部分氨基酸序列分析：测定N端15个氨基酸，C端应根据情况测定1-3个氨基酸蛋白质二硫键分析基因工程制药的下游技术蛋白质含量测定和纯度分析含量测定：Folin-酚试剂法、染色法(Bradford法）、双缩服法、紫外吸收法、HPLC法和凯氏定氮法等方法纯度分析：还原性和非还原性SDS、等电点聚焦、各种HPLC及毛细管电泳等

基因工程制药的下游技术杂质检测蛋白类杂质非蛋白类杂质基因工程制药的下游技术稳定性考察和产品一致性没有一种单一的稳定性试验或参数能够完全反映基因工程药物的稳定性特征，必须对产品在一致性、纯度、分子特征和生物效价等多方面变化情况加以综合评价从原料、生产到产品的每一步骤都进行严格条件控制和质量鉴定，才能确保各批最终产品都是安全有效、含量和杂质限度一致并符合标准规格的基因工程制药的下游技术（六）、产品的保存目的产物失活受多种理化因素的影响，保存时要根据其不同特性，采取不同的措施，防止变性、降解，保护其活性液态保存和固态保存基因工程制药的下游技术液态保存低温保存：液态蛋白质样品在-20--10℃以下冷冻保存在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点附近高浓度保存加保护剂保存：糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇及有机溶剂等基因工程制药的下游技术固态保存固态蛋白质比液态稳定，一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定长期保存蛋白质的最好方法：制成干粉或结晶基因工程制药的下游技术冷冻干燥是指使被干燥液体冷冻成固体，在低温低压条件下利用水的升华性能，使冰直接升华变成水蒸气而除去，以达到干燥目的的一种干燥方法冻干过程一般分三步：预冻结、升华干燥和解吸干燥基因工程制药的下游技术四、基因工程药物制造实例

干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂的蛋白质。干扰素除具有广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免疫调节等功能，作为一种生物活性蛋白有着良好的临床应用价值。基因工程制药的下游技术

干扰素是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别仅表现为个别氨基酸。是我国已经批准上市的基因工程药物。早期获得方法：用病毒诱导人白血球(白细胞)产生，产量低，价格贵。300L人血才提取1mg

。基因工程制药的下游技术

2003年抗非典期间，江南大学与丽珠集团苏州新宝制药厂合作攻关，通过发酵工程和生物制药工程研制成功了重组人α-2b干扰素口鼻腔喷雾剂，解决了干扰素常温保存稳定性问题。在疫区特殊人群捐赠使用，效果显著。基因工程制药的下游技术（一）、基因工程菌的组建诱生的白细胞提取全RNA通过寡dT-纤维素柱蔗糖密度梯度获得寡A的mRNA离心提取12s

的mRNA

逆转录成cDNA双链cDNA接上dT或dG尾

pBR322质粒pBR322质粒加上dA或dC基因工程制药的下游技术

退火获的杂交质粒转化大肠杆菌k12扩增杂交质粒筛选抗四环素但对氨苄用已知干扰素的DNA片断作为青霉素敏感细菌克隆探针挑选富有干扰素cDNA克隆

将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达基因工程制药的下游技术（二）、基因工程干扰素的制备启开种子制备种子液发酵培养粗提精提半成品制备半成品检定