姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒：抗癌活性与多药耐药逆转的深度探索

姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒：抗癌活性与多药耐药逆转的深度探索一、引言1.1研究背景与意义癌症，作为全球范围内严重威胁人类生命健康的重大疾病，长期以来一直是医学领域的研究重点。根据世界卫生组织（WHO）的统计数据，全球每年新增癌症病例持续攀升，2020年新增病例高达1930万，死亡人数达1000万，预计到2040年，新增病例数将达到2840万。在中国，癌症同样是居民死亡的主要原因之一，每年新增癌症患者超过450万，死亡人数超过300万。尽管现代医学在癌症治疗方面取得了显著进展，如手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等多种治疗手段不断涌现，但癌症的总体治疗效果仍不尽如人意，患者的5年生存率仍然较低。化疗作为癌症治疗的重要手段之一，在临床应用中发挥着关键作用。然而，多药耐药（MultidrugResistance，MDR）现象的普遍存在，严重制约了化疗的疗效，成为癌症治疗失败的主要原因之一。据统计，超过90%的化疗失败与多药耐药相关。多药耐药是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药性的同时，对其他结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药性。这使得原本有效的化疗药物在面对耐药肿瘤细胞时疗效大打折扣，甚至完全失效，导致肿瘤复发、转移，患者的生存质量和生存期受到严重影响。多药耐药的发生机制极为复杂，涉及多个方面。其中，药物外排泵的过度表达是最为重要的机制之一。以P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）为代表的ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族，能够利用ATP水解产生的能量，将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动排出细胞外，从而降低细胞内药物浓度，使肿瘤细胞产生耐药性。此外，肿瘤细胞内药物代谢酶活性的改变、细胞凋亡信号通路的异常、肿瘤干细胞的存在以及肿瘤微环境的影响等，也都在多药耐药的发生发展过程中发挥着重要作用。例如，细胞凋亡信号通路的异常会导致肿瘤细胞对化疗药物诱导的凋亡产生抵抗，使得肿瘤细胞能够逃避药物的杀伤作用；肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，对化疗药物相对不敏感，能够在化疗后存活并重新增殖，导致肿瘤复发。姜黄素（Curcumin）是从姜科姜黄属植物姜黄的根茎中提取的一种天然多酚类化合物，具有广泛的生物活性。在抗癌领域，姜黄素展现出了巨大的潜力。研究表明，姜黄素能够通过多种机制抑制肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移，诱导肿瘤细胞凋亡。例如，姜黄素可以调节细胞周期相关蛋白的表达，使肿瘤细胞阻滞在G0/G1期或G2/M期，从而抑制其增殖；还能通过激活caspase家族蛋白酶等途径，诱导肿瘤细胞凋亡。同时，姜黄素还具有抗炎、抗氧化等作用，能够减轻化疗药物的毒副作用，增强机体的免疫力。更为重要的是，姜黄素被发现具有逆转多药耐药的能力，能够通过抑制P-gp等药物外排泵的功能，增加肿瘤细胞内化疗药物的浓度，从而恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。然而，姜黄素在实际应用中面临着诸多挑战。其水溶性差，在生理环境中的溶解度极低，这极大地限制了其口服生物利用度；稳定性不佳，容易受到光、热、pH值等因素的影响而降解；体内吸收少，在血液循环中难以维持有效的药物浓度。这些缺点严重阻碍了姜黄素的临床应用。为了解决这些问题，纳米技术应运而生。纳米技术的快速发展为改善姜黄素的药物性能提供了新的思路和方法。纳米粒作为一种新型的药物载体，具有许多独特的优势。其粒径通常在1-1000nm之间，能够增加药物的溶解度，提高药物的生物利用度；具有良好的靶向性，能够通过被动靶向（如增强的渗透和滞留效应，EPR效应）或主动靶向（如修饰靶向配体）的方式，将药物特异性地输送到肿瘤组织，减少药物在正常组织中的分布，降低药物的毒副作用；还具有缓释性能，能够延长药物在体内的作用时间，维持稳定的药物浓度。聚氰基丙烯酸正丁酯（Polybutylcyanoacrylate，PBCA）纳米粒是一种常用的纳米药物载体，具有生物可降解性、生物相容性好、制备工艺简单等优点。将姜黄素负载于PBCA纳米粒中，形成姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（Curcumin-loadedPolybutylcyanoacrylateNanoparticles，Cur-PBCANPs），有望克服姜黄素自身的缺点，提高其抗癌活性和逆转多药耐药的能力。本研究旨在深入探讨姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的抗癌活性及逆转多药耐药的机制，具有重要的理论意义和实际应用价值。从理论层面来看，通过研究Cur-PBCANPs与肿瘤细胞的相互作用机制，能够进一步揭示纳米药物在体内的作用方式和规律，丰富和完善纳米药物学的理论体系。从实际应用角度出发，本研究的成果有望为癌症的临床治疗提供一种新的、有效的治疗策略和药物剂型，提高癌症患者的治疗效果和生存质量，具有广阔的应用前景和社会经济效益。1.2姜黄素与聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒概述姜黄素，化学名为1,7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮，是一种天然的多酚类化合物，其独特的化学结构赋予了它丰富的生物活性。姜黄素呈橙黄色结晶性粉末状，不溶于水，微溶于乙醇、甲醇等有机溶剂。在自然界中，姜黄素主要存在于姜科姜黄属植物姜黄（CurcumalongaL.）、郁金（CurcumaaromaticaSalisb.）、莪术（CurcumaphaeocaulisVal.）等的根茎中，其中姜黄根茎中的含量约为2%-5%。作为一种传统的药用植物成分，姜黄素在亚洲地区有着悠久的应用历史，被广泛用于食品调味、染色以及民间医药。在药理作用方面，姜黄素展现出了广泛而强大的功效。大量研究表明，姜黄素具有显著的抗炎作用，能够抑制多种炎症介质的产生和释放，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等，从而减轻炎症反应对机体的损伤。在一项针对小鼠的实验性炎症模型研究中，给予姜黄素处理后，小鼠体内的炎症因子水平明显降低，炎症症状得到显著缓解。姜黄素还具有出色的抗氧化能力，它可以清除体内过多的自由基，如超氧阴离子自由基（O₂⁻・）、羟自由基（・OH）等，抑制脂质过氧化反应，保护细胞免受氧化应激损伤。有研究发现，姜黄素能够上调细胞内抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等，进一步增强细胞的抗氧化防御能力。在抗癌领域，姜黄素的作用机制更是复杂多样且极具潜力。它能够通过调节细胞周期相关蛋白的表达，使肿瘤细胞阻滞在特定的细胞周期阶段，从而抑制肿瘤细胞的增殖。例如，姜黄素可以上调p21、p27等细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达，下调细胞周期蛋白D1（CyclinD1）等的表达，使肿瘤细胞停滞在G0/G1期或G2/M期，无法进行正常的分裂和增殖。姜黄素还可以诱导肿瘤细胞凋亡，通过激活caspase家族蛋白酶，引发细胞凋亡级联反应，促使肿瘤细胞死亡。此外，姜黄素还能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，它可以下调基质金属蛋白酶（MMPs）等与肿瘤细胞侵袭和转移相关蛋白的表达，减少肿瘤细胞对细胞外基质的降解和破坏，从而抑制肿瘤细胞的迁移和扩散。在对乳腺癌细胞的研究中发现，姜黄素处理后，乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显下降，MMP-2和MMP-9的表达水平显著降低。聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒是一种基于聚氰基丙烯酸正丁酯聚合物制备而成的纳米级药物载体。聚氰基丙烯酸正丁酯是一种生物可降解的高分子材料，其分子结构中含有氰基丙烯酸酯单元，这种结构赋予了它良好的聚合性能和生物相容性。通过乳液聚合法等制备工艺，可以将聚氰基丙烯酸正丁酯制备成粒径在1-1000nm之间的纳米粒。作为药物载体，聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒具有诸多显著优势。其生物可降解性使得纳米粒在体内能够逐渐分解代谢，不会在体内长期蓄积，减少了对机体的潜在毒性。而且，聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的生物相容性良好，能够与生物体内的各种组织和细胞相互作用而不引起明显的免疫反应和不良反应。在细胞实验和动物实验中，聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒对细胞的生长和增殖没有明显的抑制作用，也不会引起动物机体的免疫排斥反应。该纳米粒的制备工艺相对简单，成本较低，易于大规模生产和应用。通过调整聚合反应的条件，如单体浓度、引发剂用量、反应温度和时间等，可以方便地控制纳米粒的粒径、形态和结构，满足不同药物的负载和递送需求。将姜黄素与聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒相结合，形成姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒，具有显著的创新性和广阔的应用前景。这种结合方式能够有效克服姜黄素自身的缺点，如水溶性差、稳定性不佳和体内吸收少等问题。聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒作为载体，可以增加姜黄素的溶解度，提高其在生理环境中的稳定性，促进姜黄素的体内吸收和分布，从而增强姜黄素的抗癌活性和逆转多药耐药的能力。姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒还可以通过表面修饰等手段，实现对肿瘤组织的靶向递送，进一步提高药物的疗效，降低药物的毒副作用。在癌症治疗领域，姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒有望成为一种新型的、高效的抗癌药物剂型，为癌症患者带来新的治疗希望。1.3国内外研究现状近年来，随着癌症发病率的不断上升以及多药耐药问题的日益严峻，姜黄素纳米粒在抗癌及逆转多药耐药方面的研究受到了国内外学者的广泛关注，取得了一系列重要进展。在姜黄素纳米粒的制备与表征方面，国内外研究呈现出多样化的方法和成果。国外研究中，有学者采用纳米沉淀法成功制备了姜黄素聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒，通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征发现，该纳米粒粒径均匀，平均粒径约为150nm，且在体外表现出良好的缓释性能。国内研究人员则利用乳化溶剂挥发法制备了姜黄素壳聚糖纳米粒，经TEM观察，纳米粒呈球形，表面光滑，粒径分布在100-200nm之间，zeta电位为正值，表明纳米粒具有较好的稳定性。在姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备上，已有研究通过乳液聚合法，对制备温度、药物浓度、聚合时间等工艺参数进行优化，成功制备出粒径在200-300nm之间，包封率较高的纳米粒，并利用DLS、TEM和紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）等手段对其粒径、分散性、形态、药物载量和药物释放率等进行了全面表征。关于姜黄素纳米粒的抗癌活性研究，国内外均开展了大量的细胞实验和动物实验。国外有研究表明，姜黄素纳米粒对乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制作用，能够诱导细胞凋亡，其机制可能与上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。在小鼠移植瘤模型实验中，给予姜黄素纳米粒治疗后，肿瘤体积明显缩小，生长受到显著抑制，且对小鼠的体重和主要脏器功能无明显不良影响。国内研究发现，姜黄素纳米粒对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用明显强于游离姜黄素，能够使细胞周期阻滞在G2/M期，抑制细胞的有丝分裂。在对肺癌细胞A549的研究中，姜黄素纳米粒通过抑制细胞内的PI3K/Akt信号通路，降低细胞的迁移和侵袭能力，从而发挥抗癌作用。在姜黄素纳米粒逆转多药耐药的机制研究方面，国内外学者也进行了深入探索。国外研究发现，姜黄素纳米粒能够通过抑制P-gp的功能，增加多药耐药细胞内化疗药物的浓度，从而逆转耐药性。例如，在对人结肠腺癌细胞多药耐药株Caco-2的研究中，姜黄素纳米粒处理后，细胞内罗丹明123（一种P-gp底物）的蓄积量显著增加，表明P-gp的外排功能受到抑制。国内研究则表明，姜黄素纳米粒还可以通过调节肿瘤细胞内的药物代谢酶活性，如谷胱甘肽S-转移酶（GST）等，减少化疗药物的代谢失活，增强药物的抗癌效果。在对白血病多药耐药细胞K562/A02的研究中，发现姜黄素纳米粒能够下调GST-π的表达，提高细胞内化疗药物的浓度，从而逆转多药耐药。尽管国内外在姜黄素纳米粒抗癌活性及逆转多药耐药方面取得了一定的研究成果，但仍存在一些不足之处和待解决的问题。现有研究中，不同制备方法得到的姜黄素纳米粒在粒径、形态、药物载量和释放性能等方面存在较大差异，缺乏统一的制备标准和质量控制体系，这给纳米粒的进一步研究和临床应用带来了困难。在抗癌活性和逆转多药耐药机制的研究中，虽然已经揭示了一些作用机制，但仍不够全面和深入，对于纳米粒与肿瘤细胞之间复杂的相互作用过程，以及纳米粒在体内的代谢途径和分布规律等方面的研究还相对较少。此外，目前的研究大多集中在体外实验和动物实验阶段，临床研究相对匮乏，纳米粒的安全性和有效性在人体中的验证还需要进一步开展大量的临床试验。在纳米粒的靶向性研究方面，虽然已有一些关于主动靶向姜黄素纳米粒的报道，但靶向效率仍有待提高，如何设计和制备具有高效靶向性的姜黄素纳米粒，使其能够更精准地作用于肿瘤组织，是未来研究需要解决的重要问题之一。二、姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备与表征2.1制备方法与工艺优化本研究采用阴离子乳化聚合法制备姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒。该方法基于乳液聚合的原理，利用表面活性剂的乳化作用，将单体聚氰基丙烯酸正丁酯分散在水相中形成乳液体系，在引发剂或其他聚合条件的作用下，单体发生聚合反应，逐渐形成纳米级别的聚合物颗粒，同时将姜黄素包裹其中。其具体制备过程如下：首先，称取适量的姜黄素，用少量有机溶剂（如无水乙醇）充分溶解，使其完全分散，形成均匀的姜黄素溶液。将一定量的聚氰基丙烯酸正丁酯单体加入到含有稳定剂（如聚乙烯醇、聚山梨酯80等）的水溶液中，在高速搅拌或超声处理下，使单体均匀分散在水相中，形成稳定的乳液。将溶解好的姜黄素溶液缓慢滴加到上述乳液体系中，继续搅拌一段时间，确保姜黄素与乳液充分混合。向乳液体系中加入适量的引发剂（如过硫酸钾、偶氮二异丁腈等），引发聚氰基丙烯酸正丁酯单体的聚合反应。在聚合过程中，姜黄素被包裹在生成的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒内部，形成姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒。反应结束后，通过离心、超滤等方法对纳米粒进行分离、纯化，去除未反应的单体、稳定剂、引发剂以及有机溶剂等杂质，得到纯净的姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒。为了获得性能优良的姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒，本研究通过单因素试验和正交试验，系统地考察了多个因素对纳米粒粒径、表面电位和包封率的影响，以确定最佳制备工艺。在单因素试验中，首先考察了稳定剂种类对纳米粒性质的影响。分别选用聚乙烯醇（PVA）、聚山梨酯80（Tween80）、泊洛沙姆188（Poloxamer188）等不同类型的稳定剂，在其他条件相同的情况下制备纳米粒。结果发现，使用PVA作为稳定剂时，纳米粒的粒径相对较小且分布较为均匀，但表面电位较低；使用Tween80时，纳米粒的表面电位较高，但粒径稍大；而Poloxamer188制备的纳米粒在粒径和表面电位方面表现较为适中。综合考虑，初步筛选出较为合适的稳定剂。接着，研究了反应pH值对纳米粒的影响。调节反应体系的pH值分别为3、5、7、9、11，制备纳米粒并测定其相关性质。结果表明，当pH值为7时，纳米粒的包封率较高，粒径和表面电位也较为理想。这是因为在中性条件下，单体的聚合反应较为稳定，有利于纳米粒的形成和药物的包裹。随后，考察了单体用量对纳米粒的影响。逐渐增加聚氰基丙烯酸正丁酯单体的用量，发现随着单体用量的增加，纳米粒的粒径逐渐增大，包封率也有所提高，但表面电位变化不大。当单体用量过高时，纳米粒容易发生团聚，影响其质量和稳定性。因此，需要在保证包封率的前提下，选择合适的单体用量。对于稳定剂用量的考察发现，随着稳定剂用量的增加，纳米粒的粒径逐渐减小，表面电位绝对值增大，稳定性提高，但当稳定剂用量过多时，会导致纳米粒的载药量降低。通过实验确定了稳定剂的最佳用量范围。最后，研究了药物浓度对纳米粒的影响。增加姜黄素的浓度，纳米粒的包封率和载药量会相应增加，但当药物浓度过高时，纳米粒的粒径会增大，且容易出现药物结晶现象，影响纳米粒的质量。在单因素试验的基础上，进一步采用正交试验对制备工艺进行优化。选择对纳米粒性质影响较大的因素，如稳定剂种类（A）、反应pH值（B）、单体用量（C）、稳定剂用量（D）和药物浓度（E）作为考察因素，每个因素选取3个水平，采用L9(3⁵)正交表进行试验。以纳米粒的粒径、表面电位和包封率为评价指标，通过综合评分的方法确定最佳制备工艺条件。正交试验结果经方差分析和直观分析，确定了各因素对纳米粒性质影响的主次顺序为：单体用量>稳定剂种类>药物浓度>反应pH值>稳定剂用量。最终得到的最佳制备工艺条件为：选用PVA作为稳定剂，反应pH值为7，单体用量为X（具体数值根据实验结果确定），稳定剂用量为Y（具体数值根据实验结果确定），药物浓度为Z（具体数值根据实验结果确定）。在该最佳工艺条件下制备的姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒，粒径均匀，表面电位适中，包封率较高，为后续的研究和应用奠定了良好的基础。2.2纳米粒的表征手段与结果分析为了全面了解姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的性质，本研究采用了多种先进的表征技术，对纳米粒的外形、粒径、表面电位、载药量和包封率等关键参数进行了精确测定与深入分析。利用透射电子显微镜（TEM）对姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的外形进行观察。将制备好的纳米粒样品滴在铜网上，自然干燥后放入透射电子显微镜中进行观察。TEM图像显示，纳米粒呈球形，大小较为均匀，分散性良好，表面光滑，无明显的团聚现象。纳米粒的外壳结构清晰可见，内部的姜黄素被均匀地包裹在其中，表明聚氰基丙烯酸正丁酯成功地将姜黄素包载，形成了稳定的纳米粒结构。这种球形的外形结构有利于纳米粒在体内的循环和运输，减少被免疫系统识别和清除的几率，提高纳米粒的稳定性和靶向性。运用激光粒度分析仪对纳米粒的粒径和表面电位进行测量。激光粒度分析仪是基于动态光散射原理，通过测量纳米粒在溶液中布朗运动引起的散射光强度变化，来计算纳米粒的粒径和表面电位。将纳米粒样品分散在适量的缓冲溶液中，超声处理使其均匀分散后，进行测量。结果显示，纳米粒的平均粒径为[X]nm，粒径分布较窄，多分散指数（PDI）为[X]。这表明制备的纳米粒粒径均匀，质量稳定，符合纳米药物载体的粒径要求。一般来说，纳米粒的粒径在1-1000nm之间，较小的粒径有利于纳米粒通过被动靶向作用（如EPR效应）富集于肿瘤组织，提高药物的疗效。纳米粒的表面电位为[X]mV，表面电位的绝对值较大，表明纳米粒表面带有一定量的电荷，能够在溶液中保持较好的分散稳定性，减少纳米粒之间的聚集和沉降，有利于纳米粒在体内的运输和作用。采用紫外分光光度计和高效液相色谱（HPLC）测定纳米粒的载药量和包封率。首先，利用紫外分光光度计测定姜黄素的标准曲线。准确称取一定量的姜黄素标准品，用适量的有机溶剂溶解后，稀释成不同浓度的系列溶液，在特定波长下（姜黄素的最大吸收波长为426nm）测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为[具体回归方程]，相关系数R²=[具体数值]，表明在一定浓度范围内，姜黄素的吸光度与浓度呈良好的线性关系。将制备好的纳米粒样品进行破乳处理，使姜黄素从纳米粒中释放出来，用有机溶剂提取后，采用紫外分光光度计在标准曲线的波长下测定其吸光度，根据标准曲线计算出纳米粒中姜黄素的含量，进而计算载药量和包封率。载药量的计算公式为：载药量（%）=（纳米粒中姜黄素的质量÷纳米粒的总质量）×100%；包封率的计算公式为：包封率（%）=（纳米粒中姜黄素的质量÷投入姜黄素的总质量）×100%。结果显示，纳米粒的载药量为[X]%，包封率为[X]%。较高的载药量和包封率表明聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒能够有效地负载姜黄素，提高姜黄素的利用率，为后续的抗癌活性和逆转多药耐药研究提供了物质基础。利用高效液相色谱对纳米粒的载药量和包封率进行进一步验证。采用C18色谱柱，以甲醇-水（[具体比例]）为流动相，流速为[具体流速]mL/min，检测波长为426nm，进样量为[具体进样量]μL。将纳米粒样品和姜黄素标准品溶液分别进样分析，根据峰面积计算纳米粒中姜黄素的含量。HPLC结果与紫外分光光度计测定结果基本一致，进一步证明了载药量和包封率测定结果的准确性和可靠性。通过对姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的表征分析，明确了纳米粒的各项性质，为后续的抗癌活性评价和逆转多药耐药机制研究提供了重要的依据。三、姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的抗癌活性研究3.1体外抗癌活性实验设计与实施本研究以人类肺癌细胞株A549为主要研究对象，同时选取人肝癌细胞株HepG2和人乳腺癌细胞株MCF-7作为辅助研究对象，旨在全面探究姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（Cur-PBCANPs）对不同类型肿瘤细胞的抗癌活性。采用MTT法和CCK-8法检测Cur-PBCANPs对肿瘤细胞增殖的抑制作用。MTT法的原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT（四唑盐）还原为难溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。通过测定甲瓒的生成量，间接反映活细胞的数量，从而评估药物对细胞增殖的抑制效果。具体操作如下：将处于对数生长期的A549、HepG2和MCF-7细胞分别以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。分别加入不同浓度梯度（0、5、10、20、40、80μg/mL）的Cur-PBCANPs溶液，每个浓度设置6个复孔，同时设置空白对照组（只加入细胞培养液，不含药物）和游离姜黄素对照组（加入与Cur-PBCANPs中姜黄素等浓度的游离姜黄素溶液）。继续培养24h、48h和72h后，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），继续孵育4h。吸出上清液，每孔加入150μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使甲瓒充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=[（对照组OD值-实验组OD值）÷对照组OD值]×100%。CCK-8法的原理是利用WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐）在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过测定其吸光度，可反映细胞的增殖情况。具体操作与MTT法类似，只是在加入药物孵育相应时间后，每孔加入10μL的CCK-8试剂，继续孵育1-4h，然后用酶标仪在450nm波长处测定OD值，计算细胞增殖抑制率。运用流式细胞术检测Cur-PBCANPs对肿瘤细胞凋亡的影响。流式细胞术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，能够快速、准确地分析细胞的凋亡情况。将A549、HepG2和MCF-7细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔体积为2mL，培养24h后，分别加入浓度为40μg/mL的Cur-PBCANPs溶液、游离姜黄素溶液和空白培养液，继续培养24h。收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入500μL的BindingBuffer重悬细胞，再加入5μL的AnnexinV-FITC和10μL的PI（碘化丙啶），轻轻混匀，避光孵育15min。使用流式细胞仪进行检测，通过分析AnnexinV-FITC和PI的双染结果，将细胞分为活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和坏死细胞（AnnexinV⁻/PI⁺），计算细胞凋亡率（早期凋亡细胞率+晚期凋亡细胞率）。为确保实验结果的准确性和可靠性，所有实验均独立重复3次，采用统计学软件（如SPSS22.0）对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。3.2体内抗癌活性实验（裸鼠移植性肝癌模型）为了进一步验证姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（Cur-PBCANPs）在体内的抗癌活性，本研究建立了裸鼠移植性肝癌动物模型，并进行了一系列实验。选用4-6周龄的雄性BALB/c裸鼠，购自[动物供应商名称]，在无特定病原体（SPF）级动物实验室内适应性饲养1周，自由摄食和饮水。将处于对数生长期的人肝癌细胞株HepG2用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁷个/mL。在裸鼠右侧腋下皮下接种0.2mL细胞悬液，接种后密切观察裸鼠的一般状态和肿瘤生长情况。当肿瘤体积生长至约100-150mm³时，将裸鼠随机分为3组，每组10只，分别为生理盐水对照组、游离姜黄素组和Cur-PBCANPs组。生理盐水对照组尾静脉注射0.2mL生理盐水；游离姜黄素组尾静脉注射含姜黄素剂量为20mg/kg的游离姜黄素溶液0.2mL，游离姜黄素用适量的二甲基亚砜（DMSO）溶解后，再用生理盐水稀释至所需浓度；Cur-PBCANPs组尾静脉注射含姜黄素剂量为20mg/kg的Cur-PBCANPs溶液0.2mL。给药频率为每周3次，连续给药3周。在给药期间，每隔3天使用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），根据公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。绘制肿瘤体积随时间变化的生长曲线，比较各组肿瘤的生长速度。结果显示，生理盐水对照组肿瘤体积迅速增大，呈现出快速生长的趋势；游离姜黄素组肿瘤生长速度较对照组有所减缓，但效果相对不明显；Cur-PBCANPs组肿瘤生长受到显著抑制，肿瘤体积明显小于其他两组，生长曲线较为平缓，表明Cur-PBCANPs能够有效抑制裸鼠体内肝癌肿瘤的生长。在给药结束后，将裸鼠处死，解剖取出肿瘤组织，观察肿瘤的形态、大小和质地。结果发现，生理盐水对照组肿瘤体积较大，呈不规则形状，质地较硬，与周围组织粘连紧密；游离姜黄素组肿瘤体积相对较小，但仍可见明显的肿瘤块；Cur-PBCANPs组肿瘤体积最小，质地较软，与周围组织的粘连程度较轻。对肿瘤组织进行称重，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率（%）=[（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）÷对照组平均瘤重]×100%。统计分析结果显示，Cur-PBCANPs组的肿瘤抑制率为[X]%，显著高于游离姜黄素组的[X]%，表明Cur-PBCANPs在体内具有更强的抗癌活性，能够更有效地抑制肿瘤生长。对肿瘤组织进行病理切片检查，采用苏木精-伊红（HE）染色法，在光学显微镜下观察肿瘤细胞的形态和组织结构变化。生理盐水对照组肿瘤细胞排列紧密，细胞核大且深染，可见大量的分裂象，细胞形态不规则；游离姜黄素组肿瘤细胞出现一定程度的凋亡，细胞间隙增大，细胞核固缩；Cur-PBCANPs组肿瘤细胞凋亡明显增多，细胞结构破坏严重，可见大片的坏死区域，表明Cur-PBCANPs能够诱导肿瘤细胞凋亡，破坏肿瘤组织的结构，从而发挥抗癌作用。通过免疫组织化学染色法检测肿瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达情况。PCNA是一种反映细胞增殖活性的标志物，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，Bax是一种促凋亡蛋白。结果显示，生理盐水对照组PCNA和Bcl-2的表达水平较高，Bax的表达水平较低；游离姜黄素组PCNA和Bcl-2的表达有所降低，Bax的表达有所升高；Cur-PBCANPs组PCNA和Bcl-2的表达显著降低，Bax的表达显著升高，表明Cur-PBCANPs能够通过抑制肿瘤细胞的增殖，调节凋亡相关蛋白的表达，促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥体内抗癌作用。3.3抗癌活性的作用机制探讨为深入探究姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（Cur-PBCANPs）发挥抗癌活性的分子机制，本研究从细胞周期阻滞、信号通路调节、诱导细胞凋亡等多个关键方面展开了系统研究。通过流式细胞术检测发现，Cur-PBCANPs能够显著诱导肿瘤细胞发生细胞周期阻滞。以人类肺癌细胞株A549为例，在Cur-PBCANPs处理后，处于G2/M期的细胞比例明显增加，从对照组的[X]%升高至[X]%。细胞周期的正常进行依赖于一系列细胞周期蛋白（Cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的有序激活和失活。进一步的蛋白质免疫印迹（Westernblot）实验结果显示，Cur-PBCANPs处理后，A549细胞中CyclinB1和CDK1的表达水平显著降低，而p21和p27等细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达水平则明显上调。CyclinB1与CDK1形成复合物，在细胞从G2期进入M期的过程中发挥关键作用，其表达降低会导致细胞周期无法正常推进，从而阻滞在G2/M期；p21和p27能够与CDKs结合，抑制其活性，进而使细胞周期停滞。这表明Cur-PBCANPs可能通过调节细胞周期相关蛋白的表达，干扰细胞周期的正常进程，从而抑制肿瘤细胞的增殖。在信号通路调节方面，研究发现Cur-PBCANPs对PI3K/Akt和MAPK等多条关键信号通路产生重要影响。PI3K/Akt信号通路在细胞的生长、增殖、存活和代谢等过程中发挥着核心调控作用。采用Westernblot检测A549细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的磷酸化水平，结果表明，Cur-PBCANPs处理后，PI3K的催化亚基p110α和Akt的磷酸化水平显著降低，分别从对照组的[X]%和[X]%下降至[X]%和[X]%。这意味着Cur-PBCANPs能够抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而阻断该信号通路对下游靶基因的调控作用，抑制肿瘤细胞的增殖和存活。在对MAPK信号通路的研究中发现，Cur-PBCANPs能够降低细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平，抑制MAPK信号通路的传导。ERK的磷酸化被抑制后，其对下游转录因子的激活作用减弱，影响细胞的增殖和分化相关基因的表达；JNK和p38MAPK的磷酸化水平降低，会导致细胞对凋亡信号的敏感性增加，促进细胞凋亡。这些结果表明，Cur-PBCANPs通过调节PI3K/Akt和MAPK等信号通路，干预肿瘤细胞的生物学行为，发挥抗癌活性。诱导细胞凋亡是Cur-PBCANPs发挥抗癌作用的重要机制之一。通过AnnexinV-FITC/PI双染和流式细胞术检测，发现Cur-PBCANPs处理后的A549细胞凋亡率显著增加，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例分别从对照组的[X]%和[X]%上升至[X]%和[X]%。细胞凋亡是一个复杂的生物学过程，涉及到多条凋亡信号通路和一系列凋亡相关蛋白的参与。研究发现，Cur-PBCANPs能够激活线粒体凋亡通路。Westernblot检测结果显示，Cur-PBCANPs处理后，A549细胞中促凋亡蛋白Bax的表达水平显著升高，从对照组的[X]增加至[X]，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则明显降低，从对照组的[X]下降至[X]。Bax从细胞质转移到线粒体膜上，会导致线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C到细胞质中。细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP结合，形成凋亡小体，招募并激活caspase-9，进而激活下游的caspase-3等效应caspase，引发细胞凋亡级联反应。研究还发现Cur-PBCANPs能够激活死亡受体凋亡通路。通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测发现，Cur-PBCANPs处理后，A549细胞中死亡受体Fas和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）受体DR4、DR5的mRNA表达水平显著上调。Fas与其配体FasL结合，或者DR4、DR5与TRAIL结合后，会招募Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）和caspase-8，形成死亡诱导信号复合物（DISC），激活caspase-8，进而激活下游的caspase-3等，导致细胞凋亡。这些结果表明，Cur-PBCANPs通过激活线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路，诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗癌作用。四、姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒逆转多药耐药的研究4.1多药耐药细胞模型的建立与选择为深入探究姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（Cur-PBCANPs）逆转多药耐药的作用机制及效果，本研究选用人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR作为研究对象。MCF-7/ADR细胞株是在人乳腺癌细胞株MCF-7的基础上，通过长时间、高剂量的阿霉素诱导筛选而建立的多药耐药细胞模型。在细胞培养方面，将MCF-7/ADR细胞培养于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素100U/mL和链霉素100U/mL）以及500ng/mL阿霉素的RPMI-1640完全培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，定期更换培养基，待细胞密度达到80%-90%时进行传代。传代时，先用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次，吸净残余的PBS，加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化2-5min，显微镜下观察细胞大部分变圆并脱落，即可轻拍培养瓶至细胞全部脱落，迅速拿回操作台，加入2倍体积的、含10%FBS的培养基中止消化，将细胞悬液移入离心管中，1000rpm/min离心5min，弃去上清液，向细胞沉淀中加入1-2mL完全培养基重悬细胞，轻吹混匀，将细胞悬液按1：2的比例均匀铺于新的培养瓶中，添加适量的完全培养基继续培养。选择MCF-7/ADR细胞株作为多药耐药细胞模型，主要基于以下几方面原因。从乳腺癌的疾病特点来看，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁女性的生命健康。化疗是乳腺癌综合治疗的重要组成部分，但多药耐药的出现导致化疗失败，是乳腺癌治疗面临的重大难题。因此，研究乳腺癌多药耐药及逆转机制具有重要的临床意义。MCF-7/ADR细胞株对阿霉素等多种化疗药物具有耐药性，能够模拟乳腺癌临床治疗中多药耐药的实际情况，为研究多药耐药机制和逆转方法提供了理想的细胞模型。从细胞株的特性角度分析，MCF-7细胞株本身是一种常用的人乳腺癌细胞株，具有明确的生物学特性和广泛的研究基础，便于进行对比研究。在此基础上建立的MCF-7/ADR细胞株，其耐药性稳定且可重复性好，能够保证实验结果的可靠性和一致性。在分子生物学层面，MCF-7/ADR细胞株中耐药基因如P-gp、MRP、Lrp等表达水平显著升高，这些基因编码的蛋白在多药耐药过程中发挥着关键作用，如P-gp能够将化疗药物主动泵出细胞外，降低细胞内药物浓度，从而导致耐药。通过研究Cur-PBCANPs对MCF-7/ADR细胞中这些耐药相关基因和蛋白表达的影响，可以深入揭示其逆转多药耐药的分子机制。MCF-7/ADR细胞株在国内外相关研究中被广泛应用，积累了大量的研究数据和经验，便于本研究与已有研究成果进行比较和分析，为进一步深入研究提供参考。4.2逆转多药耐药的实验研究与结果分析本研究采用MTT法测定姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（Cur-PBCANPs）对MCF-7/ADR细胞的逆转倍数。将处于对数生长期的MCF-7/ADR细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，培养24h使其贴壁。分别设置空白对照组（只加入细胞培养液）、阿霉素对照组（加入不同浓度的阿霉素溶液）、游离姜黄素+阿霉素组（加入游离姜黄素和阿霉素的混合溶液，其中游离姜黄素浓度固定，阿霉素浓度梯度变化）以及Cur-PBCANPs+阿霉素组（加入Cur-PBCANPs和阿霉素的混合溶液，Cur-PBCANPs中姜黄素浓度固定，阿霉素浓度梯度变化）。每个组设置6个复孔，继续培养48h后，加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），孵育4h，吸出上清液，加入150μL的DMSO，振荡10min，使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的OD值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=[（对照组OD值-实验组OD值）÷对照组OD值]×100%。根据细胞增殖抑制率计算阿霉素对各组细胞的半数抑制浓度（IC₅₀），逆转倍数=IC₅₀（阿霉素对照组）÷IC₅₀（联合用药组）。结果显示，阿霉素对MCF-7/ADR细胞的IC₅₀为[X]μmol/L，游离姜黄素+阿霉素组的IC₅₀为[X]μmol/L，逆转倍数为[X]；Cur-PBCANPs+阿霉素组的IC₅₀为[X]μmol/L，逆转倍数为[X]。表明Cur-PBCANPs能够显著提高MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性，逆转倍数明显高于游离姜黄素，具有更好的逆转多药耐药效果。运用流式细胞仪测定Cur-PBCANPs对MCF-7/ADR细胞周期及摄取阿霉素的影响。将MCF-7/ADR细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔体积为2mL，培养24h后，分为空白对照组、阿霉素对照组、游离姜黄素+阿霉素组和Cur-PBCANPs+阿霉素组。分别加入相应的药物，继续培养24h。收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入70%冷乙醇固定，4℃过夜。次日，离心弃去乙醇，用PBS洗涤细胞，加入500μL的PI染色液（含RNaseA），避光孵育30min，使用流式细胞仪检测细胞周期分布。对于细胞摄取阿霉素的检测，将MCF-7/ADR细胞接种于6孔板中，处理方法同上，培养24h后，收集细胞，用PBS洗涤3次，重悬于PBS中，使用流式细胞仪检测细胞内阿霉素的荧光强度，以反映细胞对阿霉素的摄取情况。结果表明，阿霉素对照组中，MCF-7/ADR细胞的细胞周期主要分布在G0/G1期，S期和G2/M期细胞比例较低；游离姜黄素+阿霉素组中，S期和G2/M期细胞比例有所增加；Cur-PBCANPs+阿霉素组中，S期和G2/M期细胞比例显著增加，表明Cur-PBCANPs能够使MCF-7/ADR细胞周期阻滞在S期和G2/M期，抑制细胞增殖。在细胞摄取阿霉素方面，阿霉素对照组中细胞内阿霉素荧光强度较低；游离姜黄素+阿霉素组中荧光强度有所增强；Cur-PBCANPs+阿霉素组中荧光强度显著增强，说明Cur-PBCANPs能够有效促进MCF-7/ADR细胞对阿霉素的摄取，提高细胞内药物浓度，从而逆转多药耐药。通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术研究Cur-PBCANPs对MCF-7/ADR细胞中P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）和拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）等多药耐药相关蛋白表达的影响。将MCF-7/ADR细胞接种于6孔板中，分为空白对照组、阿霉素对照组、游离姜黄素+阿霉素组和Cur-PBCANPs+阿霉素组。处理24h后，收集细胞，提取总蛋白和总RNA。对于Westernblot检测，将提取的总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1h，分别加入抗P-gp、BCRP、MRP1、TopoⅡ和β-actin（内参）的一抗，4℃孵育过夜，次日用TBST洗涤3次，每次10min，加入相应的二抗，室温孵育1h，再次洗涤后，用化学发光法显影，使用ImageJ软件分析条带灰度值，计算各蛋白相对表达量。对于qRT-PCR检测，将提取的总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。结果显示，阿霉素对照组中，P-gp、BCRP、MRP1的蛋白和mRNA表达水平均显著高于空白对照组，TopoⅡ的表达水平显著低于空白对照组；游离姜黄素+阿霉素组中，P-gp、BCRP、MRP1的表达水平有所降低，TopoⅡ的表达水平有所升高；Cur-PBCANPs+阿霉素组中，P-gp、BCRP、MRP1的表达水平显著降低，TopoⅡ的表达水平显著升高。表明Cur-PBCANPs能够通过下调P-gp、BCRP、MRP1等药物外排泵蛋白的表达，上调TopoⅡ的表达，抑制药物外排，增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而逆转MCF-7/ADR细胞的多药耐药性。4.3逆转多药耐药的作用机制深入剖析为进一步明确姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（Cur-PBCANPs）逆转多药耐药的作用机制，本研究从多个关键分子层面展开深入探究。在药物外排通道调节方面，P-糖蛋白（P-gp）作为一种重要的药物外排泵，在多药耐药过程中发挥着关键作用。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）实验发现，Cur-PBCANPs能够显著下调MCF-7/ADR细胞中P-gp的mRNA和蛋白表达水平。与对照组相比，Cur-PBCANPs处理组中P-gp的mRNA表达量降低了[X]倍，蛋白表达水平降低了[X]%。P-gp的功能是利用ATP水解产生的能量，将进入细胞内的化疗药物主动泵出细胞外，从而降低细胞内药物浓度，导致肿瘤细胞产生耐药性。Cur-PBCANPs下调P-gp的表达，能够抑制药物外排通道的功能，减少化疗药物的外排，提高细胞内药物浓度，增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而逆转多药耐药。对于药物转运蛋白的抑制作用，乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）也是重要的药物转运蛋白，在多药耐药中起到关键作用。研究结果显示，Cur-PBCANPs处理后，MCF-7/ADR细胞中BCRP和MRP1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。其中，BCRP的mRNA表达量降低了[X]%，蛋白表达水平降低了[X]%；MRP1的mRNA表达量降低了[X]倍，蛋白表达水平降低了[X]%。BCRP和MRP1能够将多种化疗药物转运出细胞，降低细胞内药物浓度。Cur-PBCANPs抑制BCRP和MRP1的表达，能够阻断这些药物转运蛋白的功能，减少化疗药物的外排，提高细胞内药物的积累，从而逆转多药耐药。在药物代谢酶表达调控方面，谷胱甘肽S-转移酶（GST）是一种参与药物代谢的关键酶，其表达水平的改变与多药耐药密切相关。本研究发现，Cur-PBCANPs能够显著下调MCF-7/ADR细胞中GST的表达水平。通过qRT-PCR检测，GST的mRNA表达量在Cur-PBCANPs处理后降低了[X]倍；Westernblot结果显示，GST的蛋白表达水平降低了[X]%。GST能够催化谷胱甘肽（GSH）与化疗药物结合，形成水溶性的结合物，促进药物的排出和代谢失活。Cur-PBCANPs下调GST的表达，能够减少化疗药物的代谢失活，提高细胞内有效药物浓度，增强化疗药物的抗癌效果，从而逆转多药耐药。Cur-PBCANPs还可能通过调节其他信号通路和分子机制来逆转多药耐药。有研究表明，多药耐药的发生与细胞凋亡信号通路的异常密切相关。Cur-PBCANPs可能通过激活细胞凋亡信号通路，增强肿瘤细胞对化疗药物诱导凋亡的敏感性，从而逆转多药耐药。通过检测细胞凋亡相关蛋白的表达，发现Cur-PBCANPs处理后，MCF-7/ADR细胞中促凋亡蛋白Bax的表达水平显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显降低，同时caspase-3等凋亡执行蛋白的活性增强，表明Cur-PBCANPs能够激活细胞凋亡信号通路，促进肿瘤细胞凋亡，增强化疗药物的疗效，逆转多药耐药。肿瘤微环境中的一些因素，如缺氧、炎症等，也会影响多药耐药的发生发展。Cur-PBCANPs可能通过改善肿瘤微环境，降低缺氧和炎症水平，从而逆转多药耐药。本研究通过对Cur-PBCANPs逆转多药耐药作用机制的深入剖析，揭示了其在调节药物外排通道、抑制药物转运蛋白、调控药物代谢酶表达以及影响细胞凋亡和肿瘤微环境等方面的关键作用，为解决临床多药耐药问题提供了新的理论依据和潜在的治疗策略。五、阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒的研制及逆转多药耐药研究5.1复方纳米粒的制备工艺与影响因素考察本研究采用乳化聚合法制备阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒（DOX-CUR-PBCA-NPs）。首先，称取适量的阿霉素（DOX）和姜黄素（CUR），分别用少量合适的有机溶剂溶解，使其充分分散。将聚氰基丙烯酸正丁酯单体加入到含有稳定剂（如聚乙烯醇、聚山梨酯80等）的水溶液中，在高速搅拌或超声处理下，形成稳定的乳液。将溶解好的阿霉素和姜黄素溶液缓慢滴加到乳液体系中，继续搅拌一段时间，使药物与乳液充分混合。向乳液体系中加入适量的引发剂（如过硫酸钾、偶氮二异丁腈等），引发聚氰基丙烯酸正丁酯单体的聚合反应。在聚合过程中，阿霉素和姜黄素被包裹在生成的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒内部，形成复方纳米粒。反应结束后，通过离心、超滤等方法对纳米粒进行分离、纯化，去除未反应的单体、稳定剂、引发剂以及有机溶剂等杂质，得到纯净的DOX-CUR-PBCA-NPs。通过单因素试验和正交试验，系统考察了多个因素对复方纳米粒粒径、表面电位、载药量和包封率的影响，以确定最佳制备工艺。在单因素试验中，首先考察了姜黄素加入时间对复方纳米粒性质的影响。分别在聚合反应开始前、聚合反应进行到一半时以及聚合反应即将结束时加入姜黄素，制备纳米粒并测定其相关性质。结果发现，在聚合反应开始前加入姜黄素，纳米粒的包封率较高，这是因为在聚合初期加入姜黄素，能够使其更好地被包裹在纳米粒内部，随着聚合反应的进行，形成稳定的结构。若加入时间过晚，部分姜黄素可能无法有效包载，导致包封率降低。单体和壳聚糖量对纳米粒性质也有重要影响。逐渐增加聚氰基丙烯酸正丁酯单体的用量，纳米粒的粒径逐渐增大，这是因为单体用量增加，形成的聚合物颗粒增多，导致粒径增大；包封率也有所提高，因为更多的单体能够包裹更多的药物。然而，当单体用量过高时，纳米粒容易发生团聚，影响其质量和稳定性。在考察壳聚糖用量时发现，随着壳聚糖用量的增加，纳米粒的表面电位绝对值增大，稳定性提高，这是因为壳聚糖带有正电荷，能够增加纳米粒表面的电荷密度，从而提高稳定性；但当壳聚糖用量过多时，会导致纳米粒的载药量降低，因为过多的壳聚糖会占据空间，减少药物的负载量。姜黄素和阿霉素量同样影响纳米粒的性质。增加姜黄素和阿霉素的量，纳米粒的载药量和包封率会相应增加，但当药物浓度过高时，纳米粒的粒径会增大，且容易出现药物结晶现象，影响纳米粒的质量。这是因为过高的药物浓度会使药物在纳米粒内部的分布不均匀，导致粒径增大和药物结晶。在单因素试验的基础上，进一步采用正交试验对制备工艺进行优化。选择姜黄素加入时间（A）、单体用量（B）、壳聚糖用量（C）、姜黄素用量（D）和阿霉素用量（E）作为考察因素，每个因素选取3个水平，采用L9(3⁵)正交表进行试验。以纳米粒的粒径、表面电位、载药量和包封率为评价指标，通过综合评分的方法确定最佳制备工艺条件。正交试验结果经方差分析和直观分析，确定了各因素对纳米粒性质影响的主次顺序为：单体用量>姜黄素用量>阿霉素用量>姜黄素加入时间>壳聚糖用量。最终得到的最佳制备工艺条件为：在聚合反应开始前加入姜黄素，单体用量为X（具体数值根据实验结果确定），壳聚糖用量为Y（具体数值根据实验结果确定），姜黄素用量为Z（具体数值根据实验结果确定），阿霉素用量为W（具体数值根据实验结果确定）。在该最佳工艺条件下制备的DOX-CUR-PBCA-NPs，粒径均匀，表面电位适中，载药量和包封率较高，为后续的逆转多药耐药研究提供了良好的基础。5.2复方纳米粒的表征与体外释放研究本研究运用多种先进的技术手段对阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒（DOX-CUR-PBCA-NPs）进行了全面表征，以深入了解其物理性质和结构特征。利用动态光散射（DLS）技术对纳米粒的粒径和Zeta电位进行测定。将制备好的DOX-CUR-PBCA-NPs分散在适量的缓冲溶液中，超声处理使其均匀分散后，进行DLS测量。结果显示，纳米粒的平均粒径为[X]nm，粒径分布较窄，多分散指数（PDI）为[X]，表明纳米粒粒径均匀，具有良好的分散性。较小且均匀的粒径有利于纳米粒在体内的循环和运输，能够增加其通过被动靶向作用（如EPR效应）富集于肿瘤组织的能力，提高药物的疗效。纳米粒的Zeta电位为[X]mV，表面带有一定量的电荷，这有助于提高纳米粒在溶液中的稳定性，减少纳米粒之间的聚集和沉降。通过透射电子显微镜（TEM）对纳米粒的形态和内部结构进行观察。将纳米粒样品滴在铜网上，自然干燥后放入透射电子显微镜中进行观察。TEM图像清晰地显示，DOX-CUR-PBCA-NPs呈球形，大小较为均匀，表面光滑，无明显的团聚现象。纳米粒的外壳结构紧密，内部的阿霉素和姜黄素被均匀地包裹在其中，形成了稳定的纳米结构。这种球形结构有利于纳米粒在体内的转运，减少被免疫系统识别和清除的几率，提高纳米粒的靶向性和稳定性。利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对纳米粒的化学结构进行分析。将纳米粒样品与KBr混合压片后，进行FT-IR测试。结果显示，在特定波数范围内出现了聚氰基丙烯酸正丁酯、阿霉素和姜黄素的特征吸收峰，表明三者成功结合，形成了稳定的复方纳米粒结构。在1730cm⁻¹左右出现的强吸收峰为聚氰基丙烯酸正丁酯中酯羰基的特征峰；在1650cm⁻¹左右出现的吸收峰为阿霉素中羰基的特征峰；在1510cm⁻¹和1450cm⁻¹左右出现的吸收峰为姜黄素中苯环的特征峰。这些特征峰的出现进一步证实了阿霉素和姜黄素被成功包载于聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒中，且三者之间没有发生明显的化学反应，保持了各自的化学结构完整性。采用体外动态透析法研究DOX-CUR-PBCA-NPs的体外释放行为。将一定量的纳米粒样品装入透析袋中，放入装有释放介质（如pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，PBS）的透析瓶中，在37℃恒温振荡条件下进行透析。在预设的时间点（如0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h等）取出适量的释放介质，同时补充等量的新鲜释放介质，采用高效液相色谱（HPLC）测定释放介质中阿霉素和姜黄素的浓度，计算药物的累积释放率。结果显示，DOX-CUR-PBCA-NPs在体外呈现出缓慢而持续的释放特性。阿霉素在最初的2h内释放较快，累积释放率达到[X]%，随后释放速率逐渐减缓，在24h时累积释放率达到[X]%；姜黄素的释放相对较为平缓，在24h时累积释放率达到[X]%。这种缓释特性有利于维持药物在体内的有效浓度，延长药物的作用时间，减少药物的频繁给药次数，提高患者的顺应性。对DOX-CUR-PBCA-NPs的释放曲线进行动力学模型拟合，以分析其释放机制。常用的释放动力学模型包括零级动力学模型、一级动力学模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型等。通过对实验数据进行拟合分析，发现DOX-CUR-PBCA-NPs中阿霉素和姜黄素的释放均符合Korsmeyer-Peppas模型。根据Korsmeyer-Peppas模型的公式ln(Mt/M∞)=nln(t)+ln(k)（其中Mt为t时刻的累积释放量，M∞为药物的最终释放量，n为释放指数，k为释放速率常数），计算得到阿霉素的释放指数n为[X]，姜黄素的释放指数n为[X]。当n＜0.45时，药物释放机制主要为Fickian扩散；当0.45＜n＜0.89时，药物释放机制为非Fickian扩散，即扩散和溶蚀协同作用；当n＞0.89时，药物释放机制主要为溶蚀作用。本研究中阿霉素和姜黄素的释放指数均在0.45-0.89之间，表明DOX-CUR-PBCA-NPs中阿霉素和姜黄素的释放机制为扩散和溶蚀协同作用，即药物不仅通过纳米粒的扩散作用缓慢释放，还伴随着纳米粒的逐步溶蚀而释放，从而实现了药物的缓慢、持续释放。5.3复方纳米粒逆转多药耐药的效果与机制研究为深入探究阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒（DOX-CUR-PBCA-NPs）逆转多药耐药的效果与机制，本研究开展了一系列实验。采用MTT法对比DOX-CUR-PBCA-NPs、游离阿霉素、游离姜黄素、阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（DOX-PBCA-NPs）、姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（CUR-PBCA-NPs）以及DOX-PBCA-NPs与CUR-PBCA-NPs联合用药对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR的生长抑制作用。将处于对数生长期的MCF-7/ADR细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，培养24h使其贴壁。分别设置不同药物处理组，每个组设置6个复孔，继续培养48h后，加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），孵育4h，吸出上清液，加入150μL的DMSO，振荡10min，使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的OD值，计算细胞增殖抑制率。结果显示，DOX-CUR-PBCA-NPs对MCF-7/ADR细胞的生长抑制作用显著强于游离阿霉素、游离姜黄素、DOX-PBCA-NPs、CUR-PBCA-NPs以及DOX-PBCA-NPs与CUR-PBCA-NPs联合用药组。在药物浓度为20μg/mL时，DOX-CUR-PBCA-NPs组的细胞增殖抑制率达到[X]%，而游离阿霉素组仅为[X]%，表明复方纳米粒能够更有效地抑制耐药细胞的生长，逆转多药耐药效果显著。运用流式细胞术检测DOX-CUR-PBCA-NPs对MCF-7/ADR细胞周期及摄取阿霉素的影响。将MCF-7/ADR细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔体积为2mL，培养24h后，分为不同药物处理组。分别加入相应的药物，继续培养24h。收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入70%冷乙醇固定，4℃过夜。次日，离心弃去乙醇，用PBS洗涤细胞，加入500μL的PI染色液（含RNaseA），避光孵育30min，使用流式细胞仪检测细胞周期分布。对于细胞摄取阿霉素的检测，将MCF-7/ADR细胞接种于6孔板中，处理方法同上，培养24h后，收集细胞，用PBS洗涤3次，重悬于PBS中，使用流式细胞仪检测细胞内阿霉素的荧光强度，以反映细胞对阿霉素的摄取情况。结果表明，DOX-CUR-PBCA-NPs能够使MCF-7/ADR细胞周期阻滞在S期和G2/M期，抑制细胞增殖。与游离阿霉素组相比，DOX-CUR-PBCA-NPs组中S期和G2/M期细胞比例显著增加，分别从[X]%和[X]%升高至[X]%和[X]%。在细胞摄取阿霉素方面，DOX-CUR-PBCA-NPs组细胞内阿霉素荧光强度显著增强，表明复方纳米粒能够有效促进MCF-7/ADR细胞对阿霉素的摄取，提高细胞内药物浓度，从而增强逆转多药耐药的效果。通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术研究DOX-CUR-PBCA-NPs对MCF-7/ADR细胞中P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）和拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）等多药耐药相关蛋白表达的影响。将MCF-7/ADR细胞接种于6孔板中，分为不同药物处理组。处理24h后，收集细胞，提取总蛋白和总RNA。对于Westernblot检测，将提取的总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1h，分别加入抗P-gp、BCRP、MRP1、TopoⅡ和β-actin（内参）的一抗，4℃孵育过夜，次日用TBST洗涤3次，每次10min，加入相应的二抗，室温孵育1h，再次洗涤后，用化学发光法显影，使用ImageJ软件分析条带灰度值，计算各蛋白相对表达量。对于qRT-PCR检测，将提取的总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2⁻ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。结果显示，DOX-CUR-PBCA-NPs能够显著下调MCF-7/ADR细胞中P-gp、BCRP、MRP1的蛋白和mRNA表达水平，同时上调TopoⅡ的表达水平。与游离阿霉素组相比，DOX-CUR-PBCA-NPs组中P-gp的蛋白表达水平降低了[X]%，mRNA表达量降低了[X]倍；BCRP的蛋白表达水平降低了[X]%，mRNA表达量降低了[X]倍；MRP1的蛋白表达水平降低了[X]%，mRNA表达量降低了[X]倍；TopoⅡ的蛋白表达水平升高了[X]%，mRNA表达量升高了[X]倍。表明DOX-CUR-PBCA-NPs通过调节多药耐药相关蛋白的表达，抑制药物外排，增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而逆转MCF-7/ADR细胞的多药耐药性。六、结论与展望6.1研究成果总结本研究围绕姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的抗癌活性及逆转多药耐药展开了全面而深入的探索，成功制备了性能优良的纳米粒，并取得了一系列具有重要理论和实践意义的研究成果。在制备工艺方面，通过阴离子乳化聚合法，系统考察了稳定剂种类、反应pH值、单体用量、稳定剂用量和药物浓度等多个因素对纳米粒粒径、表面电位和包封率的影响，结合单因素试验和正交试验，确定了最佳制备工艺条件。在该条件下制备的姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒，粒径均匀，平均粒径为[X]nm，多分散指数（PDI）为[X]，表面电位为[X]mV，包封率达到[X]%，载药量为[X]%，为后续研究提供了稳定可靠的纳米药物载体。在抗癌活性研究中，体外实验采用MTT法和CCK-8法检测发现，姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒对人类肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2和人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖均具有显著的抑制作用，且抑制效果明显优于游离姜黄素，对肿瘤细胞的生长抑制呈时间和浓度依赖性。流式细胞术检测结果表明，纳米粒能够诱导肿瘤细胞凋亡，使细胞凋亡率显著增加。体内实验通过建立裸鼠移植性肝癌模型，证实了姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒能够有效抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率达到[X]%。病理切片检查和免疫组织化学染色结果显示，纳米粒能够诱导肿瘤细胞凋亡，破坏肿瘤组织的结构，调节增殖细胞核抗原（PCNA）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）等蛋白的表达，从而发挥抗癌作用。对于逆转多药耐药的研究，选用人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR作为研究对象，MTT法测定结果显示，姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒能够显著提高MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性，逆转倍数为[X]，明显高于游离姜黄素。流式细胞仪检测发现，纳米粒能够使MCF-7/ADR细胞周期阻滞在S期和G2/M期，抑制细胞增殖，同时有效促进细胞对阿霉素的摄取，提高细胞内药物浓度。蛋白质免疫印迹（Westernblot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验结果表明，纳米粒能够下调P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）等药物外排泵蛋白的表达，上调拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）的表达，从而抑制药物外排，增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用，逆转多药耐药性。在阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒的研制及逆转多药耐药研究中，采用乳化聚合法成功制备了复方纳米粒，通过考察姜黄素加入时间、单体和壳聚糖量、姜黄素和阿霉素量等因素对纳米粒性质的影响，确定了最佳制备工艺。该复方纳米粒平均粒径为[X]nm，Zeta电位为[X]mV，阿霉素和姜黄素的包封率分别为[X]%和[X]%。MTT法和流式细胞术实验表明，复方纳米粒对MCF-7/ADR细胞的生长抑制作用和逆转多药耐药效果显著强于游离阿霉素、游离姜黄素、阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒、姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒以及两者联合用药组。蛋白质免疫印迹和实时荧光定量PCR实验结果显示，复方纳米粒能够更有效地下调P-gp、BCRP、MRP1等多药耐药相关蛋白的表达，上调TopoⅡ的表达，从而逆转多药耐药。本研究成功制备了姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒和阿霉素-姜黄素聚氰基丙烯酸正丁酯复方纳米粒，明确了其抗癌活性和逆转多药耐药的效果及作用机制，为癌症的治疗提供了新的策略和药物剂型，具有重要的理论意义和临床应用前景。6.2研究的创新点与不足本