第四章知识资料知识资料蛋白质

第四章蛋白质天然界的生物多种多样，因而蛋白质的

提要种类和功能也十分繁多。概括起来，蛋白质

一.概念主要有以下功能：

容易蛋白、结合蛋白、基本氨基酸、等1.催化功能生物体内的酶都是由蛋白

电点、甲醛滴定法、Edman降解、一级结构、质构成的，它们有机体新陈代谢的催化剂，

肽键、构型与构象、二面角、二级结构、超没有酷，生物体内的各种化学反应就无法正

二级结构、结构域、三级结构、四级结构、常举行。例如，没有淀粉酶，淀粉就不能被

亚基、别构蛋白、分子病、水化层、双电层、分解利用。

蛋白质的变性与复性、盐析与盐溶2.结构功能蛋白质可以作为生物体的

二.氨基酸结构成分。在高等动物里，胶原是主要的细

分类、基本氨基酸的结构、分类、名称、胞外结构蛋白，参加结缔组织和骨骼作为身

符号、化学反应、鉴定、蛋白质的水解体的支架，占蛋白总量的1/4。细胞里的片层

三.蛋白质的结构结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网

一级结构结构特点、测定步骤、常用主等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。动物的

意、酶毛发和指甲都是由角蛋白构成的。

二级结构四种结构特点、数据、超二3.运输功能脊椎动物红细胞中的血红

级结构蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过

三级结构主要靠疏水键维持程中起着运输氧气的作用。血液中的载脂蛋

四级结构变构现象白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁。一些脂

结构与功能的适应、结构变化对功能的溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要

影响、典型蛋白质与甲状腺素结合球蛋白结合才干在血液中运

四.蛋白质的性质输。

分子量的测定主意、酸碱性、溶解性、4.储藏功能某些蛋白质的作用是储藏

变性、色彩反应氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长

第一节蛋白质通论发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清

一、蛋白质的功能多样性蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醉

蛋白质是原生质的主要成分，任何生物溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余

都含有蛋白质。天然界中最小、最容易的生的铁储存起来，供缺铁时使用。

物是病毒，它是由蛋白质和核酸组成的。没5.运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动

有蛋白质也就没有生命。蛋白是运动系统的须要成分，它们构象的改

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变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中抗体等。球状蛋白的长度与直径之比普通小

的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭于10o

毛的摆动，从而使细菌在水中游动。2.纤维状蛋白形状细长，分子量大，大

6.防御功能高等动物的免疫反应是机都是结构蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角

体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质蛋白等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤

（抗体）来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白维蛋白与不溶性纤维蛋白。前者如血液中的

因子、溶菌的、干扰素等，也担负着防御和纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如

保护功能。胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白，

7.调节功能某些激素、一切激素受体和（二）按分子组成分类

许多其他调节因子都是蛋白质。1.容易蛋白彻低由氨基酸组成，不含非

8.信息传递功能生物体内的信息传递蛋白成分。如血清清蛋白等。按照溶解性的

过程也离不开蛋白质。例如，视觉信息的传不同，可将容易蛋白分为以下7类：清蛋白、

递要有视紫红质参加，感触滋味需要味觉蛋球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋

白。视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子白和硬蛋白。

即可被激发，产生视觉。2.结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分组

9.遗传调控功能遗传信息的储存和表成，后者称为辅基。按照辅基的不同，可将

达都与蛋白质有关。DNA在储存时是缠绕在结合蛋白分为以下7类：核蛋白、脂蛋白、

蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和

遏蛋白，与特定基因的表达有关。半乳金属蛋白。

糖苜酶基因的表达受到种阻遏蛋白的抑三、蛋白质的元素组成与分了量

制，当需要合成B一半乳糖昔酶时经过去阻1.元素组成所有的蛋白质都含有碳氢

遏作用才干表达。氧氮四种元素，有些蛋白质还含有硫、磷和

10.其他功能某些生物能合成有毒的蛋一些金属元素。

白质，用以袭击或自卫。如某些植物在被昆蛋白质平均含碳50%,氢7%,氧23%,

虫咬过以后会产生一种毒蛋白。白喉毒素可氮16%。其中氮的含量较为恒定，而且在糖

抑制生物蛋白质合成。和脂类中不含氮，所以常通过测量样品中氮

二、蛋白质的分类的含量来测定蛋白质含量。如常用的凯氏定

（一）按分子形状分类氮：

1.球状蛋白形状近似球体，多溶于水，蛋白质含量=蛋白氮X6.25

大都具有活性，如酶、转运蛋白、蛋白激素、

其中6.25是16%的倒数。

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2.蛋白质的分子量蛋白质的分子量变(-)基本氨基酸

化范围很大,从6000至大00万或更大。这个组成蛋白质的20种氨基酸称为基本氮

范围是人为规定的。普通将分子量:小于6000基酸。它们中除脯氨酸外都是。•氨基酸，即

的称为肽。不过这个界限不是绝对的，如牛在Q-碳原子上有一个氨基。基本氨基酸都符

胰岛素分子量为5700,普通仍认为是蛋白质。合通式，都有单字母和三字母缩写符号。

蛋白质煮沸凝结，而肽不凝结。较大的蛋白按照氨基酸的侧链结构，可分为三类：

质如烟草花叶病毒，分子量达400()万。脂肪族氨基酸、芬芳族氨基酸和杂环氨基酸。

四、蛋白质的水解1.脂肪族氨基酸共15种。

氨基酸是蛋白质的基本结构单位，这个侧链只是是链：Gly,Ala,Vai,Leu,He后

发现是从蛋白质的水解得到的。蛋白质的水三种带有支链，人体不能合成，是必须氨基

解主要有三种主意：酸。

1.酸水解用6MH。或4MH2so4,105℃侧链含有羟基：Ser,Thr许多蛋白酶的活

回流2()小时即可彻低水解。酸水解不引起氨性中央含有丝氨酸，它还在蛋白质与糖类及

基酸的消旋，但色氨酸彻低被破坏，丝氨酸磷酸的结合中起重要作用。

和苏氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链含硫原子：Cys,Met两个半胱氨酸

酰胺基被水解。如样品含有杂质，在酸水解可通过形成二硫键结合成一个胱氨酸。二疏

过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。川键对维持蛋白质的高级结构有重要意义。半

3moi/L对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较胱氨酸也常常浮上在蛋白质的活性中央里，

多，可像丝氨酸和苏氨酸一样用外推法求其甲硫氨酸的硫原子偶尔参加形成配位键。甲

含量。硫氨酸可作为通用甲基供体，参加多种分了

2.碱水解用5MNaOH,水解10—20小的甲基化反应。

时可水解彻低。碱水解使氨基酸消旋，许多侧链含有竣基:Asp(D),Glu(E)

氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。常用于侧链含酰胺基:Asn(N),Gln(Q)

测定色氨酸含量。可参加淀粉以防止氧化。侧链显碱性：Arg(R),Lys(K)

3.酶水解酶水解既不破坏氨基酸，也不2.芬芳族氨基酸包括苯丙氨酸(Phe,F)

引起消旋。但酶水解时光长，反应不彻低。和酪氨酸(Tyr,Y)两种。酪氨酸是合成甲状腺

普通用于部分水解，若要彻低水解.，需要用素的原料。

多种酶协同作用。3.杂环氨基酸包括色氨酸(Trp,W)、组氨

第二节氨基酸酸(His)和脯氨酸(Pro)三种。其中的色氨酸与

一、氨基酸的结构与分类芬芳族氨基酸都含苯环，都有紫外吸收

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(280nm)o所以可通过测量蛋白质的紫外吸收酸的中间产物，丙氨酸是遍多酸(泛酸，

来测定蛋白质的含量。组氨酸也是碱性氨基辅酶A前体)的前体，丫・氨基丁酸是传递神

酸，但碱性较弱，在生理条件下是否带电与经冲动的化学介质。

周围内环境有关。它在活性中央常起传递电二、氨基酸的性质

荷的作用。组氨酸能与铁等金属离子配位。(-)物理性质

脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是螺旋的破坏a-氨基酸都是白色晶体，每种氨基酸都

者。有异常的结晶形状，可以用来鉴别各种氨基

B是指Asx,即Asp或Asn；Z是指Glx,酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中，

即Glu或Gino脯氨酸和羟胆氨酸还能溶于乙醇或乙醛中，

基本氨基酸也可按侧链极性分类：除甘氨酸外，。•氨基酸都有旋光性，a

非极性氨基酸:Ala,Vai,Leu,He,Met,-碳原子具有手性。苏氨酸和异凫氨酸有两个

Phe,Trp,Pro共八种手性碳原子。从蛋白质水解得到的氨基酸都

极性不带电荷：Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,是L-型。但在生物体内异常是细菌中，D-氨

Gin,Tyr共七种基酸也存在，如细菌的细胞壁和某些抗菌素

带正电荷：Arg,Lys,His中都含有D-氨基酸。

带负电荷：Asp.Glu三个带苯环的氨基酸有紫外吸收，

(二)不常见的蛋白质氨基酸F:257nm,e=200;Y:275nm,£=14(X);

某些蛋白质中含有一些不常见的氨基W:28()nm,e=5600。通常蛋白质的紫外吸收

酸，它们是基本氨基酸在蛋白质合成以后经主要是后两个氨基酸决定的，普通在280nmo

羟化、瘦化、甲基化等修饰衍生而来的。也氨基酸分了中既含有氨基乂含有按基，

叫稀少氨基酸或异常氨基酸。如4-羟腑氨酸、在水溶液中以偶极离子的形式存在。所以氨

5-羟赖氨酸、锁链素等。其中羟脯氨酸和羟基酸品体是离子晶体，熔点在200℃以上。

赖氨酸在胶原和弹性蛋白中含量较多。在甲氨基酸是两性电解质，各个解离基的表观解

状腺素中还有3,5・二碘酪氨酸。离常数按其酸性强度递降的顺序，分离以

(三)非蛋白质氨基酸KI'、K2'来表示。当氨基酸分子所带的净

天然界中还有150多种不参加构成蛋白电荷为零时的pH称为氨基酸的等电点(pl)。

质的氨基酸。它们大多是基本氨基酸的衍生等电点的值是它在等电点前后的两个pK'值

物，也有一些是D-氨基酸或B、丫、3-氨基的算术平均值。

酸。这些氨基酸中有些是重要的代谢物前体氨基酸彻低质子化时可看作多元弱酸，

或中间产物，如瓜氨酸和鸟氨酸是合成精氨各解离基团的表观解离常数按酸性削弱的顺

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序，以pKI'、pK2'、pK3,表示。氨基在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应

酸可作为缓冲溶液，在pK'处的缓冲能力最的苯乙内酰硫胭衍生物（PTH-AA）o这些衍

强，pl处的缓冲能力最弱。生物是无色的，可用层析法加以分离鉴定,

氨基酸的滴定曲线如图。这个反应首先为Edman用来鉴定蛋白质的

（二）化学性质N.末端氨基酸，在蛋白质的氨基酸顺序分析

1.氨基的反应方面占有重要地位。

（1）酰化（5）磺酰化

氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酎在碱氨基酸与5-（二甲胺基）奈-1-磺酰氯

性溶液中反应，生成酰胺。该反应在多肽合（DNS-C1）反应，生成DNS-氨基酸。产物在酸

成中可用于保护氨基。性条件下（6NHCD100C也不破坏，因此可R]

（2）与亚硝酸作用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有强荧光，

氨基酸在室温下与亚硝酸反应，脱氨，激发波长在360nm左右，比较灵巧，可用于

生成羟基竣酸和氮气。因为伯胺都有这个反微量分析。

应，所以赖氨酸的侧链氨基也能反应，但速（6）与DNFB反应

度较慢。常用于蛋白质的化学修饰、水解程氨基酸与2,4・二硝基氟苯（口W8）在弱碱

度测定及氨基酸的定量。性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP

（3）与醛反应氨基酸）。这一反应是定量改变的，产物黄色,

氨基酸的a-氨基能与醛类物质反应，生可经历酸性100C高温。该反应曾被英国的

成西佛碱-C二N-。西佛碱是氨基酸作为底物的Sanger用来测定胰岛素的氨基酸顺序，也叫

某些酶促反应的中间物。赖氨酸的侧链氨基桑格尔试剂，现在应用丁蛋白质N-末端测定。

也能反应。氨基还可以与甲醛反应，生成羟（7）转氨反应

甲基化合物。因为氨基酸在溶液中以偶极离在转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨芯,

子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。变成相应的酮酸。

与甲醛反应后，氨基酸不再是偶极离子，其2.竣基的反应

滴定尽头可用普通的酸碱指示剂指示，因而峻基可与碱作用生成盐，其中重金属盐

可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨不溶于水。粉基可与醇生成酯，此反应常用

基酸。于多肽合成中的陵基保护。某些酯有活化作

（4）与异硫银酸苯酯（PIT。反应用，可增强竣基活性，如对硝基苯酯。将氨

a.氨基与PITC在弱碱性条件下形成相基保护以后，可与二氯亚碉或五氯化磷作用

应的苯氨基硫甲酰衍生物（PTCAA）,后者生成酰氯，在多肽合成中用于活化粉基。在

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脱救酶的催化下，可脱去竣基，形成伯胺。含疏基的酶失活。

3玮三酮反应5.以下反应常用于氨基酸的检验：

氨基酸与荀三酮在微酸性溶液中加热，1酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反

最后生成蓝色物质。而脯氨酸生成黄色化合应(Pauly反应)，可用于定性、定量测定。组

物。按照这个反应可通过二氧化碳测定氨基氨酸生成棕纥色的化合物，酪氨酸为桔黄色。

酸含量。1精氨酸在氢氧化钠中与1-蔡酚和次

4.侧链的反应浪酸钠反应，生成深红色，称为坂口反应，

丝氨酸、苏氨酸含羟基，能形成酯或昔。用于弧基的鉴定。

半胱氨酸侧链筑基反应性高：1酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚

(1)：硫键(disulfidebond)硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热后变红，

半胱氨酸在碱性溶液中容易被氧化形成称为米伦反应，是鉴定酚基的特性反应。

二硫键，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫键在1色氨酸中参加乙醛酸后再缓慢参加

形成蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂浓硫酸，在界面会浮上紫色环，用于鉴定口引

和还原剂都可以打开二硫键。在研究蛋白质口朵基。

结构时，氧化剂过甲酸可以定量地拆开二硫在蛋白质中，有些侧链基团被包裹在蛋

键，生成相应的磺酸。还原剂如臻基乙醇、白质内部，因而反应很慢甚至不反应。

臻基乙酸也能拆开二硫键，生成相应的藻基三、色谱与氨基酸的分析分离

化合物。因为半胱氨酸中的疏基很不稳定，1.色谱(chromatography)的发展史

极易氧化，因此利用还原剂拆开二硫键时，最早的层析实验是俄国植物学家IIBe

往往进步用碘乙酰胺、氯化苇、N-乙基丁T在1903年用碳酸钙分离叶绿素，属丁吸附

烯二亚酰胺和对氯汞苯甲酸等试剂与疏基作层析。4()年代浮上了分配层析，50年代浮上

用，把它保护起来，防止它重新氧化。了气相色谱，60年代浮上HPLC,80年代浮

(2)烷化上了超临界层析，90年代浮上的超微量

半胱氨酸可与烷基试剂，如碘乙酸、碘HPLC可分凄ng级的样品。

乙酰胺等发生烷化反应。2.色谱的分类：

半胱氨酸与丫丙咤反应，生成带正电的按流动相可分为气相、液相、超临界色

侧链，称为S-氨乙基半胱氨酸(AECys)o谱等；

(3)与重金属反应按介质可分为纸层析、薄层层析、柱层

极微量的某些重金属离子，如Ag+、析等；

Hg2+,就能与臻基反应，生成硫醇盐，导致按分离机制可分为吸附层析、分配层析、

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分子筛层析等肽键象酰胺键一样，因为键内原子处于

3.色谱的应用共振状态而表现出较高的稳定性。在肽键中

可用于分离、制备、纯度鉴定等。C-N单键具有约40%双键性质，而C=O双

定性可通过保留值、内标、标准曲线等键具有40%单键性质。这样就产生两个重要

主意，定量普通用标准曲线法。结果：（1）肽键的亚氨基在pH0-14的范围

氨基酸的分析分离是测定蛋白质结构的内没有显然的解离和质子化的倾向；（2）肽

基础。在分配层析和离子交换层析法开始应键中的C-N单键不能自由旋转，使蛋白质

用于氨基酸成分分析之后，蛋白质结构的研能折叠成各种三维构象。

究才取得了显著的成就。现在这些主意已自除了蛋白质部分水解可以产生各种容易

动化。的多肽以外，天然界中还有长短不等的小肽,

氨基酸从强酸型离子交换柱的洗脱顺序它们具有异常的生理功能。

如下：动植物细胞中含有一种三肽，称为谷胱

Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,甘肽，即6-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含

Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,（NH3）,Arg有筑基，故常以GSH来表示。它在体内的氧

第三节蛋白质的一级结构化还原过程中起重要作用。脑啡肽是天然止

蛋白质是生物大分子，具有显然的结痛剂。肌肉中的鹅肌肽是一个二肽，即B■丙

构层次性，由低层到高层可分为一级结构、氨酰组氨酸。肌肽可作为肌肉中的缓冲剂，

二级结构、三级结构和四级结构。缓冲肌肉产生的乳酸对pH的影响。一种抗

一、肽键和肽菌素叫做短杆菌酪肽，由12种氨基酸组成，

个氨基酸的瘦基与另个氨基酸的氨其中有几种是D・氨基酸。这些天然肽中的非

基缩水形成的共价键，称为肽键。在蛋白质蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。许

分子中，氨基酸借肽键衔接起来，形成肽链。多激素也是多肽，如催产素、加压素、舒缓

最容易的肽由两个氨基酸组成，称为二激肽等。

肽。含有三、四、五个氨基酸的肽分离称为二、肽的理化性质

三肽、四肽、五肽等。肽链中的氨基酸因为小肽的理化性质与氨基酸类似。许多小

形成肽键时脱水，已不是残破的氨基酸，所肽已经结品。品体的熔点很高，说明是离子

以称为残基。肽的命名是按照组成肽的氨基品体，在水溶液中以偶极离子存在。肽键的

酸残基来决定的。普通从肽的氨基端开始，亚氨基不解离，所以肽的酸碱性取决于肽的

称为某氨基酰某氨基酰…某氨基酸。肽的书末端氨基、竣基和侧链上的基团。在长肽或

写也是从氨基端开始。蛋白质中，可解离的基团主要是侧链上的,

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肽中末端竣基的pK'比自由氨基酸的稍大，

而末端氨基的pK'则稍小。侧链基团变化不3.肽链的一部分样品举行彻低水解，测

大。定其氨基酸组成和比例。

肽的滴定曲线和氨基酸的很相似。肽的4.肽链的另一部分样品举行N末端和C

等电点也可以按照它的pK'值决定。末端的鉴定。

普通小肽的旋光度等于各个氨基酸旋光5.拆开肽链内部的二硫键。

度的总和，但较大的肽或蛋白质的旋光度不6.肽链用酶促或化学的部分水解主意

等于其组成氨基酸的旋光度的容易加和。降解成一套大小不等的肽段，并将各个肽段

肽的化学性质和氨基酸一样，但有一些分离出来。

异常的反应，如双缩服反应。普通含有两个7.测定每个肽段的氨基酸顺序。

或两个以上肽键的化合物都能与CuSO4碱8.从第二步得到的肽链样品再用另一种

性溶液发生双缩服反应而生成紫红色或蓝紫部分水解主意水解成另一套肽段，其断裂点

色的复合物。利用这个反应可以测定蛋白质与第五步不同。分离肽段并测序。比较两套

的含量。肽段的氨基酸顺序，按照其重叠部分拼凑出

囱冏肽链的氨基酸顺序。

三、一级结构的测定9.测定本来的多肽链中二硫键和酰胺

（-）一级结构基的位置。

蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组（三）常用主意

成及其罗列顺序。氨基酸序列是蛋白质分子1.末端分析

结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。（1）N木端

级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符蛋白质的末端氨基与2,4-二硝基氟苯

号表示，从N・末端向C-末端书写。采用三字（DNFB）在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯

母符号时，氨基酸之间用连字符（一）隔开。基蛋白质（DNP-蛋白质）。产物黄色，可经

（二）测定步骤历酸性100℃高温。水解时，肽链断开，但

测定蛋白质的一级结构，要求样品必须DNP基并不脱落。DNP・氨基酸能溶于有机溶

是均一的（纯度大于97%）而且是已知分子剂（如乙醛）中，这样可与其他氨基酸和£

量的蛋白质。普通的测定步骤是：-DNP赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层

1.通过末端分析决定蛋白质分子山几条析，可以鉴定黄色的DNP氨基酸。

肽链构丹磺酰氯法是更灵巧的主意。蛋白质的

2.将每条肽链分开，并分离提纯。末端氨基与5-（二甲胺基）茶磺酰氯

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(DNS-C1)反应,生成DNS-蛋白质。DNS-氨C末端氨基酸的罗列顺序。粉肽酶A水解除

基酸有强荧光，激发波长在36()nm左右，比精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，装肽

DNFB法灵巧100(go酶B水解精氨酸和赖氨酸。

目前应用最广泛的是异硫制酸苯酯2.二硫键的拆开和肽链的分离

(PITC)法。末端氨基与PITC在弱碱性条件下普通情况下，蛋白质分子中肽链的数目

形成相应的苯氨基硫中酰衍生物，后者在硝应等于N末端氨基酸残基的数目，可按照末

基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的茉端分析来决定一种蛋白质由几条肽链构成，

乙内酰硫眠衍生物而从肽链上掉下来。产物必须设法把这些肽链分离开来，然后测定每

可用气-液色谱法举行鉴定。这个主意最大的条肽链的氨基酸顺序。倘若这些肽链之间不

优点是剩下的肽链仍是残破的，可依照此法是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或

重复测定新生的N末端氨基酸。现在已经有其他变性剂史理蛋白质，把肽链分开。倘若

全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含2()个肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有链为

以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。缺点是不二硫键，则必须用氧化或还原的主意将二疏

如丹磺酰氯灵巧，可与之结合使用。键拆开。最普遍的主意是用过量的疏基乙醇

N末端氨基酸也可用酶学主意即氨肽酶处理，然后用碘乙酸保护生成的半胱氨酸的

法测定。筑基，防止重新氧化。二硫键拆开后形成的

(2)C末端个别肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、

a)C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成电泳等主意举行分离。

相应的。氨基醇。肽链水解后，再用层析法3.肽链的彻低水解和氨基酸组成的测

鉴定。有断裂干扰。定。

b)另一个主意是朋解法。多肽与肺在无在测定氨基酸顺序之前，需要知道多肽

水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C链的氨基酸组成和比例。普通用酸水解，得

末端氨基酸外，其他氨基酸都改变为相应的到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前

酰肿化合物。脱解下来的C末端氨基酸可用用氨基酸自罚分析仪，2—4小时即可完成。

纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨蛋白质的氨基酸组成.，普通用每分子蛋

酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类

c)也可用竣肽酶法鉴定。将蛋白质在pH的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。

8.0,30℃与峻肽酶一起保温，按一定时光间4.肽链的部分水解和肽段的分离

隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，当肽链的氨基酸组成及N末端和C末端

按照氨基酸的量与时光的关系，就可以知道已知后，随后的步骤是肽链的部分水解。这

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是测序工作的关键步骤。这一步通常用专一以.上主意中，酶不能水解脯氨酸参加形

性很强的蛋白酶来完成。成的肽键。

最常用的是胰蛋白酶（trypsin）,它专门多肽部分水解后，降解成长短不一的小

水解赖氨酸和精氨酸的竣基形成的肽键，所肽段，可用层析或电泳加以分离提纯。常常

以生成的肽段之一的C末端是赖氨酸或精氨用双向层析或电泳分离，再用苛三酮显色.

酸。用丫丙咤处理，可增强酶切位点（半胱所得的图谱称为肽指纹谱。

氨酸）；用马来酸酊（顺丁烯二酸酎）保护赖5.多肽链中氨基酸顺序的测定

氨酸的侧链氨基，或用1,2.环己二酮修饰精从多肽链中部分水解得到的肽段可用化

氨酸的胭基，可减少酶切位点。学法或酶法测序，然后比较用不同主意获得

常常使用的还有糜蛋白酶，水解苯丙氨的两套肽段的氨基酸顺序，按照它们彼此重

酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的竣基形成叠的部分，决定每个肽段的适当位置，拼凑

的肽键。其他疏水残基反应较慢。出囱冏多肽链的氨基酸顺序。

用漠化新处理，可断裂甲硫氨酸的按基6.二硫键位置的决定

形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基改变为C普通用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白

末端高丝氨酸残基。以上三种主意常常使用。质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽

胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。前者水解疏段，再拆开二硫键，将两个肽段分离测序，

水残基之间的肽键，后者水解疏水残基的氨再与囱冏多肽链比较，即可决定二硫键的位

基形成的肽键。置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的

金葡菌蛋白酶，乂称谷氨酸蛋白酶或V8肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条

蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的瘦基形成

件下作用（PH2）,此时二硫键稳定。肽段的

的肽键，但受缓冲液影响。在醋酸缓冲液中分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的

只水解谷氨酸，在磷酸缓冲液中还可水解天中央，在pH6.5举行第一次电泳，然后用过

冬氨酸。甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变

梭状芽胞杆菌蛋白酶，水解精氨酸粉基成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转90

形成的肽键，乂称精氨酸蛋白酶。耐变性剂,度后在相同条件下举行第二次电泳，多数肽

可经历6M尿素2小时。可用于水解不易溶段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨

解的蛋白。磺酸的肽段因负电荷增强而偏离对角线。用

凝血酶，水解Arg-Gly肽键。前三酮显色，分离，测序，与多肽链比较，

羟胺可水解Asn-Gly,但Asn-Leu和即可决定二硫键位置。

Asn-Ala也能部分裂解。四、多肽合成

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朽木易折，金石可镂

多肽的人工合成有两种类型，一种是由保证氨基在自山状态即可。

不同氨基酸按照一定顺序罗列的控制合成，近年来因相多肽合成疾驰发展。在固相

另一种是由一种或两种氨基酸聚合或共聚合成中，肽链的逐步延伸是在不溶的聚苯乙

合。控制合成的一个艰难是举行接肽反应所烯树脂小圆珠上举行的。合成多肽的按基端

需的试剂，能同时和其他官能团反应。因此先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应，形成节酯，

在按肽以前必须首先将这些基团加以封闭或第二个氨基酸的氨基用叔丁氧甲酰基保护

保护，肽键形成后再除去保护基。这样每衔后，以DCCI为缩合剂，接在第一个氨基酸

接一个氨基酸残基都要经过几个步骤，要得的氨基上。重复这个主意，可使肽链按一定

到较长的肽链就必须每步都有较高的产率。顺序延伸。最后把树脂悬浮在无水三瓶乙酸

倘若每一步反应产率都是90%,那么3()次反中，通入干燥HBr,使多肽与树脂分离，同

应后总产率惟独4.24%。时除去保护基。囱冏合成过程现在已经可以

保护基必须在接肽时起保护作用，在接在自动化固相多肽合成仪上举行。平均合成

肽后容易除去，又不引起肽键断裂。最常用每个肽键只需三小时。此法可用于医药工业。

的氨基保护基Y是节氧甲酰基，可用催化加人工合成的催产素没有混杂的加压素，比提

氢或用金属钠在液氨中处理除去。其他还有取的天然药品好。已经胜利合成含124个残

三苯甲基、叔丁氧甲酰基等，可用稀盐酸或基的蛋白。

乙酸在室温下除去。第四节蛋白质的高级结构

竣基保护基Z通常用烷基，如乙基，可蛋白质的多肽链并不是线形舒展的，

在室温下皂化除去。如用节基，可用催化加而是按一定方式折叠盘绕成特有的空间结

氢除去。构。蛋白质的三维构象，也称空间结构或高

肽键不能自发形成，常用缩合剂促进肽级结构，是指蛋白质分子中原子和基团在三

键形成。接肽用的缩合剂最有效的是N,N'-维空间上的罗列、分布及肽链的走向。高级

二环己基碳二亚胺(DCCI)。DCCI从两个氨结构是蛋白质表现其生物功能或活性所必须

基酸分子中夺取一分子水，自身变为不溶的的，包括二级、三级和四级结构。Primary

N,N'一二环己基眼，从反应液中沉淀出来，structure,secondary,tertiary,quaternary

可过滤除去。接肽反应除用缩合剂以外，还structure

可用分离活化参加形成肽键的峻基和氨基的一、有关概念

主意。陵基活化可用叠氮化物法和活化酯法1.构型configration与构象conformation

(对硝基苯酯)等；氨基活化普通不需异常构型指立体异构体中取代原子或基团在

手段，通常在接肽时参加有机碱，如三乙胺,空间的取向，构型的改变必须通过共价键的

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千里之行，始于足下

断裂。构象是指这些取代基团当单键旋转时La螺旋（a-helix）a螺旋模型是

可能形成的不同的立体结构，构象的改变不Pauling和Ccrey等研究a-角蛋白时于1951

涉及共价键的改变。年提出的。角蛋白是动物的不溶性纤维状蛋

2.二面角白，是由动物的表皮衍生而来的。它包括皮

因为肽键不能自由旋转，所以肽键的四肤的表皮以及毛发、鳞、羽、中、蹄、角、

个原子和与之相连的两个o碳原子共处一个丝等。角蛋白可分为两类，一类是Q角蛋白，

平面，称肽平面。肽平面内的C=O与N-H胱氨酸含量丰盛，如角、甲、蹄的蛋白胱氨

呈反式罗列，各原子间的键长和键角都是固酸含量高达22%；另一类是B角蛋白，不含

定的。肽链可看作由一系列刚性的肽平面通胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的含量

过。碳原子衔接起来的长链，主链的构象就很高，蚕丝丝心蛋白就属于这一类。。角蛋

是由肽平面之间的角度决定的。主链上惟独白，如头发，裸露于湿热环境中几乎可以伸

a碳原子衔接的两个键是单键，可自由旋转。长一倍，冷去】干燥后又收缩到本来长度。B

绕CQ-N1旋转的角称①，而绕Ca-C2角蛋白则无此变化。

旋转的角称中。这两个角称为二面角。规定a角蛋白的X射线衍射图案极其相似，

当旋转键两侧的肽链成顺式时为。度。取值沿长轴方向都有一个大周期结构或重复单

范闱是正负18（）度，当二面角都是180度时位,其长度为5—5.5埃。Pauling等考虑到肽

肽链彻低舒展。因为空间位阻，实际的取值平面向多肽链构象的限制作用，设计了多肽

范闱是很有限的。链折耸的各种可能模型，发现其中一种a螺

二、二级结构旋模型能很好地说明a角蛋白的X射线衍射

（）二级结构是肽链的空间走向图案中的5-5.5埃重复单位。在这个模型口，

蛋白质的二级结构是指肽链主链的空间每隔3.6个氨基酸残基螺旋升高一圈，相当

走向（折叠和盘绕方式），是有规矩重复的构于向上平移5.4埃。螺旋的直径是11埃。螺

象。肽链主链具有重复结构，其中氨基是氢旋升而时，每个氨基酸残基沿轴旋转100°,

键供体，线基是氢键受体。通过形成链内或向上平移1.5埃，比彻低舒展的构象压缩2.4

链间氢键可以使肽链卷蜿蜒叠形成各种二级倍。这与衍射图案中的小周期彻低一致。其

结构单元。复杂的蛋白质分子结构，就由这二面角中二57度，甲=-48度。在a螺旋中氨

些比较容易的二级结构单元进一步组合而基酸残基的侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间

成。形成链内氢键，氢键的取向几乎与中央轴平

（二）肽链卷蜿蜒叠形成四种二级结构行。氢键是由肽键中氮原子上的氢与其N端

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