湖南省猪、鸡源粪肠球菌的多点位序列分型分析

湖南省猪、鸡源粪肠球菌的多点位序列分型分析MULTIPOINTSEQUENCETYPINGOFENTEROCOCCUSFAECALISFROMPIGSANDCHICHENSINHUNANPROVINCE目录摘要……………1关键词…………11前言………………22材料与方法………………………22.1菌株来源……………………2试剂和仪器…………2方法…………………22.3.1细菌核酸的提取…………………22.3.2MLST基因检测……………………22.3.3统计学分析………………………23结果与分析……………33.1粪肠球菌7个管家基因的PCR扩增结果………………33.2多位点序列分型结果……………33.3eBURST软件分析结果……………53.4不同地区、不同动物来源粪肠球菌的ST型比较………………6参考文献………………………8致谢………………8湖南省猪、鸡源粪肠球菌的多点位序列分型分析摘要：目的对湖南省猪、鸡源粪肠球菌进行多位点序列分型分析（MLST）,分析湖南省地区的猪、鸡源粪肠球菌的分子分型情况。方法对实验室收集的湖南省常德、浏阳、衡阳、宁乡的猪、鸡源粪肠球菌共35株，通过对猪鸡源粪肠球菌的7个管家基因序列对35株粪肠球菌进行多位点序列分型分析。结果35株测试的粪肠球菌一共分为21个ST型，在这21个ST型中，17个猪源粪肠球菌分离株共分为11个ST型，18个鸡源粪肠球菌分离株共包含10个ST型。21个粪肠球菌ST型分为了3个组别与10个独立型，ST16处于核心位置，是eBURST经运算推测的试验菌株的祖先ST。试验的优势CC群包括4个，包括CC16、CC480、CC476及CC4，位于CC16的6个ST型（16、363、372、541、265、553）在本次实验中所覆盖的粪肠球菌数量最多，总共包含10株菌，占总数的28.6%（10/35），且大多为猪源粪肠球菌（7/10），位于CC480的3个ST型总共包括6株菌，其中，宁乡猪源含2株、鸡源含1株，衡阳鸡源1株，常德鸡源2株；位于同一CC群的ST476与ST828，共包含5株菌，且均来自猪源；位于CC4的菌株有4株，且均为鸡源关键词：猪、鸡源粪肠球菌；多位点序列分析Multipoint

sequence

typing

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens

in

Hunan

ProvinceAbstract:ObjectiveAnalysis

of

multiple

site

sequence

typing

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens

in

Hunan

Province

(MLST),Analysis

of

molecular

typing

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens

in

Hunan.Methods

35

strains

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens

pigs

and

chickens,

Liuyang,

Hengyang

and

Ningxiang

of

Hunan

Province

were

analyzed

by

multi-site

sequence

typing

of

7

housekeeping

gene

sequences

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens.Results

Thirty-five

strains

of

Enterococcus

faecalis

were

divided

into

21

ST

strains,

of

which

17

were

divided

into

11

ST

isolates

and

18

were

composed

of

10

ST

isolates.

The

21

ST

types

were

divided

into

3

groups

and

10

independent

types,

ST16

were

in

the

core

position

and

were

the

ancestor

ST

of

the

tested

strains

eBURST

calculated.The

dominant

CC

groups

in

the

experiment

included

4,

including

6

ST

types

(16,363,372,541,265,553)

located

in

the

CC16,

covering

the

largest

number

of

Enterococcus

faecalis

in

this

experiment,

containing

a

total

of

10

strains,

accounting

for

28.6%

of

the

total

(10/35).Most

of

them

were

Enterococcus

faecalis

(7/10),

and

the

three

ST

types

located

in

CC480

included

6

strains

in

total.There

were

2

strains

in

Ningxiang

,1

strain

in

chicken

,1

strain

in

Hengyang

and

2

strains

in

Changde.

There

were

5

strains

in

ST476

and

ST828,

in

the

same

CC

group,

all

from

pig.Four

strains

were

located

in

the

CC4,

all

of

which

were

chickenderivedKeywords:Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens；Multiple-site

sequence

analysis1前言肠球菌原属于链球菌属,是一种革兰阳性菌REF_Ref41248041\r[1],广泛分布于多种生物体内体外,对高温，强酸，高盐浓度环境有较强的耐受性REF_Ref41249241\r[2]REF_Ref41249243\r[3]。肠球菌引发多种食源性动物疫病,能引起动物腹泻,给养殖业造成巨大打击,并威胁人类的公共卫生健康REF_Ref41251258\r[4]REF_Ref41251261\r[5],临床分离的肠球菌中,粪肠球菌约占80%~90%,而屎肠球菌只占5%~10%。粪肠球菌是肠球菌属中重要的感染致病菌，可以引起皮肤感染REF_Ref41252396\r[6]，尿路感染等疾病REF_Ref41252413\r[7]REF_Ref41252414\r[8]，通过对猪、鸡源粪肠球菌的多位点序列分型，了解粪肠球菌的来源和遗传背景，为畜禽养殖业中粪肠球菌感染提供预防治疗措施，减少畜禽养殖业的损失，粪肠球菌是表示抗菌药物耐药性水平的一种革兰氏阳性指示菌,因此有必要对猪、鸡源分离粪肠球菌的基因序列情况进行分析和研究REF_Ref41252451\r[9]。另外粪肠球菌也是重要的益生菌，生长繁殖快，能耐受胃肠道环境对大肠杆菌O1和O78有一定的抑制作用REF_Ref41252474\r[10]，其中菌株DY-F03具有重要的益生性能和抗逆性,为开发优良的微生态制剂提供菌种资源REF_Ref41252490\r[11]。目前，在人类社会公共安全问题上，粪肠球菌已经成为医院感染的一种重要病原，近年在临床上由粪肠球菌引起的感染有逐年上升趋势,已成为呼吸系统、泌尿系统、伤口感染、院内感染的常见菌,并对多种抗菌药物耐药REF_Ref41253021\r[12]REF_Ref41253023\r[13]REF_Ref41253024\r[14]REF_Ref41253025\r[15]REF_Ref41253027\r[16]，在动物领域，近年来,猪、鸡感染粪肠球菌发病和死亡的报道越来越多REF_Ref41253052\r[17]REF_Ref41253053\r[18]REF_Ref41253054\r[19]REF_Ref41253055\r[20]。.2材料与方法2.1菌株来源实验室收集的湖南省常德、衡阳、浏阳、宁乡的猪、鸡源粪肠球菌共35株2.2试剂和仪器PCR扩增仪，全自动凝胶成像系统，Vitek-2Compack全自动微生物分析系统，恒温金属浴，PCR扩增试剂盒2.3方法2.3.1细菌核酸提取：在1ml的PE管中加入100μl的无菌水，选取10个单一菌落与EP管内，100℃金属浴煮12min，1200r/min离心5min，取上清作为PCR扩增的模板，放置在-20℃冰箱中保存待用。2.3.2MLST基因检测：粪肠球菌的7对管家基因（aroE；gdh；gki；gyd；pstS；xpt；yqiL）进行PCR扩增，PCR扩增7个管家基因的目的片段。PCR程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s；按照各管家基因特异性引物要求的退火温度设置，时间为30s，72℃延伸40s（35个循环）；72℃7min。PCR扩增产物经纯化后，进行测序。将7个管家基因序列的测序结果在MLST网站数据库上进行对比，获得每一个管家基因的等位号码，综合起来所以的等位号码来确认序列的型号，2.3.3统计学分析将测序的产物序列提交至MLST数据库进行比对，确定菌株的各个等位基因的序号并提交数据库可得到菌株确定的序列型，即ST型。应用eBURST软件分析所有菌株的MLST结果及其在整个粪肠球菌数据库中的分布情况，通过绘制聚类分析图来研究各个实验菌株ST型之间的亲缘关系。3结果与分析3.1粪肠球菌7个管家基因的PCR扩增结果35株分离菌的7个管家经PCR扩增、1%的凝胶电泳后，均得到清晰且单一的目的条带，部分分离株的电泳结果见图1。图1部分菌株7个管家基因扩增结果Table5-1Amplificationresultsof7housekeepinggenesinpartialstrains注：M为DNA分子Marker；1-aroE；2-gdh；3-gki；4-gyd；5-pstS；6-xpt；7-yqiL3.2多位点序列分型结果35株粪肠球菌一共分为21个ST型，其中包括ST32型3株，ST16型4株，ST4763株，ST480型4株；ST828、ST903、ST553、与ST416型各包含两株；除此之外，其余序列型在本次试验中均只包含1个菌株。在本次试验的ST型中，ST16型与ST553、ST541、ST265、以及ST363型之间存在6个相同的等位基因序列号，仅在一个位点存在差异，与ST372型也只存在2个位点的差异；ST480与ST663型仅在gdh基因处存在不同，与ST846仅在gdh和yqiL基因处存在不同；ST476与ST828也只有一处等位基因不同。35株粪肠球菌分型结果具体见表1。表1粪肠球菌15个ST型的等位基因谱Table5-2Allelespectrumof15STtypesinEnterococcusfaecalis菌株编号ST型等位基因编号gdhgydpstSgkiaroExptyqiLJY15ST165113776LX1ST165113776A29ST165113776X7ST165113776JY8ST-328795441JY23ST-328795441BY5ST-328795441B3ST-37251137769Q4ST-903982932431727B9ST-3348175441A30ST-4761721314141LX16ST-4761721314141A20ST-4761721314141X13ST-5535113476B2ST-4801122227176A22ST-4801122227176A24ST-4801122227176Q7ST-4801122227176X15ST-538127317625SM3ST-2655113976B3ST-55512137815B15ST-416115116111310Q29ST-416115116111310X16ST-828421314141SM15ST-828421314141Q16ST-36320113776B6ST-618149181016212A23ST-82346748120JH11ST-82617171314101B8ST-903982932431727LX4ST-4943771411Q9ST-84611222271769JH16ST-5535113476JY28ST-66383122227176X20ST-54151131763.3eBURST软件分析结果本次研究通过该软件成功构建了21个ST型的克隆图谱（图1），由图可知，21个ST型分为了3个组别与10个独立型。图中ST16处于核心位置，是eBURST经运算推测的试验菌株的祖先ST型（即Founder），ST553、ST363、ST265、ST372以及ST541型以它为中心，与该型的亲缘关系较近。组别2由ST480、ST663及ST846组成，组别3由ST476和ST828组成。10个独立序列型分别为ST538、ST823、ST903、ST494、ST556、ST416、ST334、ST32、ST826和ST618，它们的亲缘关系较为疏远。图135株粪肠球菌21个ST型的eBRUST图pig5-1TheeBURSTmapabout21STsof35Enterococcusfaecalis注：圆圈及数字代表具体ST型，圆圈的大小代表位于该ST型的菌株数，线段连接的ST型代表位于同一CC群到目前为止，粪肠球菌PubMLST数据中已发现的ST型共913种（/efaecalis/），将本试验的21个ST型与整个数据库的ST型一起导入该软件进行分析，结果见图2。在7个管家基因中，拥有5个及5个以上相同等位基因编号的ST属于同一个复合克隆群（ClonalComplex，CC），本次试验的优势CC群包括4个，包括CC16、CC480、CC476及CC4。图中ST型16及其周围的变异体组成的克隆群为CC16，该克隆群中ST16型占据核心位置，为该子群的祖先序列型，且根据粪肠球菌数据库的相关信息，ST16型的菌株在世界范围内均有分布，且这些菌株的来源包括人及动物。ST663与ST846位于克隆复合群480（CC480），ST32与ST334位于克隆群4（CC4），ST828与ST476也属于同一克隆群476（CC476）。除优势CC群外，位于CC6、CC403、CC259、CC59等群中粪肠球菌在本次试验中也有少数分布。还有部分ST型较为独立，如ST826等，不形成复合克隆群。图2粪肠球菌MLST全局分布图Pig5-2MLSTglobaldistributionmapofEnterococcusfaecalis注：图中红色圆圈标注的为本实验和粪肠球菌数据库中共有的ST型，位于中心的蓝色圆圈为该克隆群的祖先ST型，线段连接的ST型位于同一克隆复合群3.4不同地区、不同动物来源粪肠球菌的ST型比较对35株粪肠球菌的ST型进行比较得出，不同地区不同动物来源的粪肠球菌拥有丰富的ST型。其中，17个猪源分离株共分为11个ST型，18个鸡源分离株共包含10个ST。位于CC16的6个ST型（16、363、372、541、265、553）在本次实验中所覆盖的粪肠球菌数量最多，总共包含10株菌，占总数的28.6%（10/35），这些菌株在宁乡、衡阳等地区均有分布，且大多为猪源粪肠球菌（7/10）。位于CC480（ST480、ST663、ST846）的3个ST型总共包括6株菌，其中，宁乡猪源含2株、鸡源含1株，衡阳鸡源1株，常德鸡源2株；位于同一CC群的ST476与ST828，共包含5株菌，且均来自猪源；位于CC4（ST32、ST334）的菌株有4株，且均为鸡源。除此之外，其它CC群以及余下的独立ST型在不同地区的猪、鸡源分离株中均有少量分布。表2部分ST型在不同地区、不同来源粪肠球菌中的分布情况Table5-2DistributionofpartialSTtypesindifferentregionsanddifferentsourcesofEnterococcusfaecalis序列型菌株数量总计宁乡猪源鸡源衡阳猪源鸡源常德猪源鸡源浏阳猪源鸡源ST16201100004ST363000001001ST372010000001ST541100000001ST265000010001ST553101000002ST480100001114ST663000100001ST846000001001ST476201000003ST828000010102ST32020100003ST334010000001参考文献幸文定.江西部分地区猪源粪肠球菌耐药性及毒力基因检测与分析[D].江西农业大学,2016.PissettiC,CamposT,WerlangGO,etal.AntimicrobialresistanceinEscherichiacoliandEnterococcussp.isolatedfromswinecarcassesatthepre-chillstage[Z].SafeporkProc,2013:203-206.TremblayC,LetellierA,QuessyS,etal.Antibiotic-resistantEnterococcusfaecalisinabattoirpigsandplasmidcolocalizationandcotransferoftet(M)anderm(B)genes[J].JFoodProt,2012,75(9):1595-1602.NamHM,LimSK,MoonJS,etal.AntimicrobialresistanceofenterococciisolatedfrommastiticbovinemilksamplesinKorea[J].ZoonosesandPublicHealth,2009,57(7-8):e59-e64.BeshiruA,IgbinosaIH,OmejeFI,etal.Multi-antibioticresistantandputativevirulencegenesignaturesinEnterococcusspeciesisolatedfrompigfarmsenvironment[J].MicrobPathog,2017,104:90-96.张凡,邝捷.皮肤粪肠球菌感染一例[J].实用皮肤病学杂志,2015,8(06):465-466.杨仁国,王蜀强,龙姗姗,喻华,黄仁刚,林健梅,徐开菊,杨兴祥.复杂性尿路感染243例病原菌构成及药敏分析[J].中国抗生素杂志,2017,42(12):1050-1055.李金磊,董鹏,狄元冉,方忠意,高延玲,周红霞,吴志明.河南省部分地区猪和鸡源粪肠球菌的分离鉴定与耐药性分析[J].动物医学进展,2018,39(04):122-127.朱娜,方超,周成捷,等.湖南省猪源肠球菌的分离鉴定[J].湖南畜牧兽医,2016(2):41-44.鲍延娥,董晓芳,佟建明,高玉鹏,刘炎.粪肠球菌益生特性的体外评价[J].西北农业学报,2013,22(11):202-207.胡红伟,段明房,闫凌鹏,麻啸涛,陈茹茹,赵帅,李自茹.产细菌素粪肠球菌的分离、鉴定及体外益生特性研究[J].饲料广角,2017(11):27-32刘凤强,姬生瑞.检出160株肠球菌的分布及耐药性分析[J].中国热带医学,2005(09):1879+1874.商军,顾欣,张文刚,姜芹,孙冰清.猪、鸡源分离粪肠球菌的核糖体分型及耐药性分析[J].中国抗生素杂志,2017,42(03):230-236.王送林,李芸芳,刘秋菊,朱娜,蒋伟,邓治邦,黎满香.湖南省猪源粪肠球菌耐药性分析[J].中国动物传染病学报,2015,23(02):41-46.施宏,陈书韵,杨狄,任绪义.浙江地区临床分离粪肠球菌的多位点序列