首医大临床生物化学实验课件16-ck的测定

实验二十一血清肌酸激酶的测定

【目的要求】1、掌握血清CK测定的原理。2、熟悉半自动生化分析仪的应用。一、概述肌酸激酶（Creatinekinase，CK，EC2.7.3.2）全称腺苷三磷酸：肌酸N-磷酸转移酶，催化肌酸（Cr）和ATP或磷酸肌酸（CrP）和ADP之间磷酸转移的可逆反应。肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP+H+CK偏碱pH有利于顺向反应进行，中性pH倾向逆向反应，一般逆向反应较顺向反应快2~6倍；Mg2+是CK的必需激活剂，但过量反而抑制；肌酸激酶(CK)催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之间的磷酸转移的可逆性反应，所产生的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。CK广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑。

CK是由M和B两类亚基组成的二聚体。在细胞质内存在3种同工酶，即CK-BB(CK1)，CK-MB(CK2)和CK-MM(CK3)。在细胞线粒体内还存在另一CK同工酶，即所谓线粒体CK(CK-Mt)，也称CK4。各种CK同工酶还可进一步根据所带电荷和等电点不同分离数目不等的亚型。CK测定方法比色法酶偶联法荧光法比色法1、测磷法CrP在酸液中易水解成Cr及无机磷酸。（ATP与ADP在酸性条件下较稳定）

2、酶偶联-丙酮酸测定法

肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP

ADP+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸+ATP丙酮酸+2，4-二硝基苯肼丙酮酸-2，4-二硝基苯腙CK丙酮酸激酶利用逆向反应CrP+ADPCr+ATPCr+双乙酰+α-萘酚红色化合物Mg2+作激活剂；半胱氨酸供给巯基；氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并终止反应。CK逆向反应的速度较快，敏感性较高，成为目前国内推荐的主要方法。必须用中性或偏碱的蛋白沉淀剂以防止底物CrP在酸性蛋白沉淀剂中非酶性水解成Cr。酶偶联法多利用逆向反应，是国际最常用方法CrP+ADPCr+ATPATP+GluADP+6-P-Glu6-P-Glu+NADP+6-P-GA+NADPH+H+

可在340nm波长下测定NADPH生成速率而计算CK活性浓度。

CK己糖激酶G-6-PD全部反应最适pH为6.8~6.9；主要干扰因素①谷光甘肽还原酶②腺苷酸激酶荧光法利用逆向反应生成的Cr在强碱性溶液中与茚三酮反应产生荧光复合物，测其荧光强度，经与同样处理的Cr标准管比较，可计算CK活力。优点：快速、敏感，巯基化合物不产生干扰，试剂易得，操作条件易于掌握。缺点：需精密荧光分光光度计，不适宜基层单位使用。血清CK同工酶测定临床常规测定CK同工酶多用电泳和免疫抑制法，但两法均会受溶血和巨CK的干扰，免疫抑制法还会受到CK-BB的干扰。因此现在推荐用免疫化学方法直接测定CK—MBmass，可不受溶血和巨CK的干扰。CK同工酶亚型(CK-MM型和CK-MB型)多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。【原理】

磷酸肌酸和ADP在CK的作用下生成肌酸和ATP，ATP与葡萄糖在己糖激酶的作用下生成ADP与6磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖与氧化型辅酶2在6磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下生成6磷酸葡糖酸和还原性辅酶2。磷酸肌酸+ADP

CK

肌酸+ATPD-葡萄糖+ATPHKADP+葡萄糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸+NADPG-6-PDH6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H

利用酶偶联反应原理连续监测氧化型辅酶还原生成还原性辅酶，后者引起340nm吸光度的增高，在340nm监测单位时间内生成的还原性辅酶2的生成量（ΔA/min），可计算出CK的活性浓度。【操作】1，吸应用试剂1ml，加入测定管中，放入37度水浴至少5分钟。2，加血清50ul，混匀。3，上机测定。【计算】CK＝ΔA/min*106/6220*2.1/0.1【参考范围】男性：38-174，女性26-140临床意义

CK及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断和鉴别诊断及预后判断。

心肌梗死会出现血清CK活性明显变化。心肌梗死发病的早期，即发病后2-4小时此酶即开始升高，12-48小时达高峰，可高达正常上限的10-12倍，在2-4天降至正常水平。此酶对诊断心肌梗死较其他的心肌酶谱AST、LD的阳性率高，特异性强，是用于心肌梗死的早期诊断，估计病情和判断预后的较好指标。病毒性心肌炎时CK也有明显升高。而且样品溶血情况下不影响CK活性测定

CK极度升高(>3000U／L)主要见于全身疾病，特别是肌肉疾病，此时CK测定有助于肌萎缩病因的鉴别，如进行性肌萎缩时可见CK显著升高。此外，病毒、细菌、寄生虫感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。但神经疾病引起的肌萎缩，CK活性一般正常。。CK-MM亚型测定对早期AMI的检出更为敏感，一般以CK-MM3／CK-MM1>1.0作为诊断AMI的标准，但必须排除急性骨骼肌损伤。AMI发病2～4hCK-MM3／CK-MM1即开始升高，8～12h达峰值。CK-MB2亚型在AMI早期诊断和判断有无再灌注上有很高的灵敏度和特异性。一般CK-MB2>1.0U／L或CK-MB2／CK-MBl>1.5可作为AMI的诊断标准之一注意事项1、线性达300U/L，更高活性的血清用已知CK活性正常的血清稀释后再用。试剂空白速率小于0.001。2、EDTA有利于试剂的稳定。3、红细胞及所有组织的AK的影响，标本应避免严重溶血。4、血清检测。样