CBJY-PCR-SOP-018 室内质控品配制作业指导书

CBJY-PCR-SOP-018室内质控品配制作业指导书1目的规范聚合酶链式反应（PCR）检测实验室室内质控品的配制流程，确保质控品的均一性、稳定性和准确性，为PCR检测结果的质量控制提供可靠保障，保障检测过程的规范性和结果的可信度。2范围本作业指导书适用于CBJY-PCR实验室所有常规PCR检测项目对应的室内质控品（包括阳性质控品、阴性质控品、临界值质控品）的配制、分装、储存及使用前验证等相关操作。3职责3.1实验室负责人负责审批本作业指导书，确保配制所需的人员、设备、试剂等资源配备到位，监督本SOP的严格执行。3.2质控人员负责按照本SOP要求执行室内质控品的配制、分装、标识、储存及验证工作，及时记录相关数据，发现异常情况及时上报。3.3检测人员负责正确使用配制好的室内质控品，配合质控人员完成验证相关的检测工作，反馈质控品使用过程中出现的问题。4定义与术语4.1室内质控品由实验室自行配制或外购后分装的，用于监控PCR检测全过程（包括核酸提取、扩增、检测）质量的物质，分为阳性质控品、阴性质控品和临界值质控品。4.2阳性质控品含有目标检测核酸序列的质控物质，用于验证PCR检测体系的扩增效率和特异性，确保检测过程中阳性样本能够被准确检出。4.3阴性质控品不含有目标检测核酸序列的质控物质，用于监控PCR检测过程中的污染情况，确保检测结果不会出现假阳性。4.4临界值质控品含有低浓度目标检测核酸序列（浓度接近检测方法的临界值）的质控物质，用于监控PCR检测方法的灵敏度和稳定性。5作业流程5.1配制前准备5.1.1人员准备操作人员需经过PCR实验室相关培训并考核合格，熟悉本SOP要求，穿戴好个人防护装备（PPE），包括实验服、一次性手套、口罩、帽子，必要时佩戴护目镜。5.1.2环境准备配制操作需在PCR实验室的试剂准备区进行，提前对实验台面进行消毒（使用75%乙醇擦拭），确保环境清洁、无灰尘、无污染源，温湿度控制在实验要求范围内（温度18-25℃，相对湿度40%-60%）。5.1.3设备与试剂准备设备：检查移液器（不同量程）、电子天平、离心机、涡旋振荡器、冰箱（-20℃、-80℃）、超净工作台等设备是否正常运行，定期校准的设备需在校准有效期内；试剂：根据质控品类型准备对应的原料（如阳性模板、无核酸酶水、生理盐水、胎牛血清等）、防腐剂（如叠氮钠，按需添加），所有试剂需在有效期内，储存条件符合要求，打开后需标注开启日期；耗材：准备无核酸酶离心管、吸头，提前进行高压灭菌或选用无菌无酶耗材，耗材外包装完好无破损。5.2质控品配制操作5.2.1阴性质控品配制选取无核酸酶水或生理盐水作为阴性质控品基质，若模拟临床样本（如血液、痰液），可选用不含目标核酸的对应临床样本基质（需经检测确认无目标核酸）；在超净工作台内，用经消毒的移液器吸取适量基质至无菌离心管中，如需添加防腐剂（如叠氮钠终浓度0.02%-0.05%），准确量取防腐剂溶液加入后，置于涡旋振荡器上充分混匀1-2分钟；配制完成后，标记质控品名称、浓度（阴性）、配制日期、配制人。5.2.2阳性质控品配制根据检测项目的目标核酸序列，选取对应的阳性模板（如质粒、体外转录RNA、阳性临床样本提取的核酸）；使用电子天平或移液器准确量取阳性模板和稀释液（无核酸酶水或对应的样本基质），按照预设浓度进行梯度稀释，例如：将高浓度阳性模板稀释至1×10⁶copies/μL作为储备液，再进一步稀释至1×10³-1×10⁴copies/μL作为工作液；稀释过程中，每一步稀释后均需涡旋混匀1-2分钟，必要时离心（3000rpm，1分钟）收集液体；若需长期储存，可添加适量保护剂（如50%甘油），充分混匀后标记质控品名称、目标序列、浓度、配制日期、配制人。5.2.3临界值质控品配制以阳性质控品储备液为原料，采用无核酸酶水或对应样本基质进行梯度稀释；通过预实验确定临界值浓度范围（通常为检测方法检出限的1-2倍），将阳性模板稀释至该范围内，多次稀释后混匀，确保浓度均匀；配制完成后，标记质控品名称、目标序列、临界浓度、配制日期、配制人。5.3分装与储存将配制好的各类质控品在超净工作台内进行分装，根据日常使用量，分装至无菌无酶离心管中，每管体积建议为20-100μL，避免反复冻融；分装完成后，立即加盖密封，再次核对并完善标签信息（包括质控品类型、名称、浓度、配制日期、有效期、配制人、实验室标识）；将分装后的质控品置于-20℃冰箱短期储存（1个月内使用），长期储存（超过1个月）需置于-80℃冰箱；阴性质控品若为液体基质，可根据需求冷藏（2-8℃）储存，但需定期检测稳定性；储存时需分类存放，避免与样本、其他试剂混放，防止交叉污染，冰箱内放置温度计，定期记录温度。5.4配制后验证5.4.1均一性验证从分装后的同一批次质控品中随机抽取3-5管，采用对应的PCR检测方法进行检测，记录检测结果（如Ct值、荧光强度）。阳性质控品和临界值质控品的检测结果变异系数（CV）应≤5%，阴性质控品应无扩增信号，确保质控品均一性合格。5.4.2稳定性验证短期稳定性：将质控品在-20℃储存1个月后，随机抽取3管进行检测，与配制完成时的检测结果对比，阳性质控品Ct值变化≤1.0，临界值质控品Ct值变化≤1.5，阴性质控品无扩增；长期稳定性：每3个月从-80℃储存的质控品中随机抽取3管进行检测，监测结果变化，若出现Ct值显著变化（超过上述范围）或阴性质控品出现扩增，需重新配制该批次质控品；反复冻融稳定性：将质控品进行3-5次冻融循环后检测，结果变化应符合短期稳定性要求，否则需优化储存方式（如增加分装量，减少冻融次数）。5.4.3特异性验证采用非目标序列的PCR检测体系对阳性质控品进行检测，应无扩增信号；阴性质控品在目标序列检测体系中无扩增信号，确保质控品特异性合格。6注意事项配制过程中严格遵守PCR实验室分区管理要求，试剂准备区、样本处理区、扩增区严格分开，避免交叉污染；所有操作均需在超净工作台内进行，移液器使用前需用75%乙醇消毒，吸头一次性使用，避免重复使用导致污染；配制过程中需及时、准确填写《室内质控品配制记录》，包括配制日期、质控品类型、原料信息、浓度、分装数量、储存条件、验证结果等，记录需完整、清晰、可追溯；质控品有效期需根据稳定性验证结果确定，超过有效期的质控品禁止使用，需按实验室废弃物处理规定进行无害化处理；若配制过程中出现试剂污染、设备故障等异常情况，需立即停止操作，对环境、设备进行彻底消毒，排查原因并记录，重新进行配制；防腐剂（如叠氮钠）具有毒性，操作时需严格遵守安全规范，避免直接接触皮肤和黏膜，若发生接触，立即用大量清水冲洗；定期对配制的室内质控品进行回顾分析，总结稳定性数据，优化配制方案。7记录与表单7.1《室内质控品配制记录表》（附录A）7.2《室内质控品验证记录表》（附录B）7.3《冰箱温度记录表》8附录附录A《室内质控品配制记录表》记录编号质控品名称/类型目标序列原料信息（名称、批号、厂家）配制浓度配制体