CN110393712B 从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位及其制备方法和应用 （浙江中医药大学）

(19)国家知识产权局(65)同一申请的已公布的文献号(43)申请公布日2019.11.01(73)专利权人浙江中医药大学地址310053浙江省杭州市滨江区滨文路548号(72)发明人杨波赵华军王伟倩朱智慧(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200专利代理师陈升华A61K31/365(2006.01)A61P35/00(2006.01)A61P15/14(2006.01)滕飞等.浙江香茶菜属植物抗肿瘤活性成分的比较研究及药效物质的快速发现.《浙江中医药大学学报》.2020,第44卷(第03期),297-302.IsolatedfromIsolationofGuaiaglehninA,StructureRevisionofHiyodorilactoneB,andGeneticComparison.《Chem.Pharm.Bull.》.2008,第56卷(第5期),677-681.cytotoxicityofsesquiterpenelactoneseupatoriopicrin.《Phytotherapy.1988,第2卷(第3期),109-114.(续)从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位及其制备方法和应用本发明公开了一种从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位及其制备方法和应用，该抗肿瘤有效部位包括hiyodorilactoneD、3β-Hydroxyl-8β-sarracinolyoxycostuhiyodorilactonetlgloylcostunohde,依次通过渗漉、粗提物与探压柱层析等方法，对大麻叶泽兰进行提取、分离纯化得到。该有效部位可用于乳腺癌的治疗。该方法制备的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位，生BB时间(天)[转续页]2BoYang等.Precisedisactivityofanti-triple-negative9.EdnaRibeiro-Varandas等.CytoofEupatoriumcannabinumLAliceGRIGORE等.EvaluationofantiproliferativeandprotectivofEupatoriumcannabinumL.extracts.卷477-486.ZhihuiZhu等.Eucannabinolide,anovelsesquiterpenelactone,sgrowth,metastasisandBCSCS-liketraitsYingyingWei等.EupaformosaninBarbaraMichalak等.EupatoriInhibitsPro-inflamm31.一种从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步(1)将大麻叶泽兰药材粉碎、过筛，用乙醇溶液浸泡24～48h后，然后用乙醇渗漉提取，收集渗漉液；(2)将步骤(1)的渗漉液减压回收乙醇，所得浸膏用水混悬后，再用乙酸乙酯萃取3～5(3)大麻叶泽兰乙酸乙酯粗提物与探针孵育，所选的探针为还原型谷胱甘肽，通过UPLC-MS分析孵育前后色谱图的变化，精准识别乙酸乙酯提取物中含亲电倍半萜的部位；(4)大麻叶泽兰乙酸乙酯粗提物上正相氧化铝色谱柱或100～200目正相硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，在步骤(3)分析结果的指导下，收集含经孵育实验精准识别出来的含亲电倍半萜的流分，得到含有抗肿瘤有效部位的流分，将流(5)将步骤(4)制备得到的有效部位粗产物，进行中压柱层析分离，进一步收集富含亲电倍半萜的抗肿瘤有效部位的流分，减压回收溶剂，即得到从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位；从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位，其活性成分包括式A结构的hiyodorilactone4C5D442.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的乙醇溶液的体积百分含量为75～95%,所述的乙醇溶液的体积用量与大麻叶泽兰药材的质量之比为10L～20L:3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，混悬所用的水的体积用量与浸膏质量之比为3L～10L:1kg;萃取所用的乙酸乙酯的体积用量与浸膏质量之比为3L～10L:1kg。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，孵育的探针采用溶液的形式，还原型谷胱甘肽用Tris-HCl缓冲液溶解，配5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中酸乙酯体积比为2:1～1:4的流分。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的中压柱层析分离采用40～60μm的十八烷基键合相硅胶作为填料，上样后用体积分数40%～100%范围的甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱3～5个柱体积。5从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于中药及天然药物的研究与开发技术领域，涉及从中药中提取、制备有效部位及其应用的领域，尤其是涉及一种从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位及其制备方法和应用。背景技术[0002]菊科(Compositae)泽兰属(Eupatoriu物具有悠久的用药历史。[0003]大麻叶泽兰为菊科泽兰属植物大麻叶泽兰(EupatoriumcannabinumLinn.)的干燥地上部分，据中国植物志记载：该种遍布欧洲及北非洲，苏联西伯利亚地区、高加索地区也有分布。我国仅在江苏宜兴、浙江杭州有记录，可能是引种归化的种。课题组经野外资源[0004]泽兰属中药：野马追被2015版中国药典收载，现已有制剂用于临床；泽兰属中药：华泽兰在民间亦有较多应用，且中国多个研究团队对其化学成分进行过较系统的研究(岳1530-1536;尉小琴，J.Nat.Prod,2018,81,85-91)。大麻叶泽兰与野马追、华泽兰为同属不同种，亲缘关系较近的植物。课题组研究表明：大麻叶泽兰亦含有泽兰属植物特有的吉玛烷型的倍半萜，该类倍半萜报道具有：抗肿瘤、抗菌、杀虫、抗炎和镇痛等活性(吴双庆，HelveticaChimicaActa,2012,95,1637-44;[0005]课题组对大麻叶泽兰化学成分及药理研究的文献进行了调研，结果显示：仅我国台湾省ChenJJ课题组对该药用植物做过一些研究(ChenJJ,ChemBiodivers,2014,11,1374-80;ChenJJ,JNatProd,2011,74,1021-7)且该课题组关注的是大麻叶泽兰中的：百里酚、苯并呋喃类、苯丙醇类的成分。国外多个课题组对大麻叶泽兰进行过较系统的研究(WoerdenbagHJ,PharmWeekblSci,1986,8,245-51),关注较多的是其含有的倍半萜内酯类成分及其生物活性。同一个种的大麻叶泽兰，由于中国与国外分布的大麻叶泽兰的生长环境、气候等的差异，其成分一般会有较大的差异。项目组实验研究证实：大麻叶泽兰富含兰为“引种归化的种”,大麻叶泽兰生长的地理、气候等条件的差异，酯结构、含量、各组分间的天然比例，亦会与国外课题组报道的有较大差异。研究在中国地域分布较窄，野生资源丰富，且具有较高潜在药用价值的大麻叶泽兰具有重要意义。[0006]大麻叶泽兰在中国的分布范围较窄，但其野外资源丰富，提示如果该植物药确实核试剂发生迈克尔加成反应，属于亲电天然产物或迈克尔受体分子，也可称之为“亲电倍半6萜”。国内、外学者选亲核探针，快速发现亲电天然产物、迈克尔受体分子(马忠俊，些课题组关注的是用探针去发现单体化合物、先导化合物。目前，尚未有以亲核探针去精准发现有效部位或有效组分群，以减少分离、纯化的工作量，提高有效部位活性的报道。探针的使用，能最大限度保留有效部位中能与探针反应的成分，剔除不能反应的成分，使得大麻叶泽兰有效部位的成分均为亲电倍半萜。中药多具有：多组分、多靶点协同作用的特点，所以精准发现富含亲电倍半萜的有效部位，更符合中药起效及用药的特点，亦可大大减小后续药效物质研究的工作量。[0008]在泽兰属倍半萜抗肿瘤研究方面，岳建民等报道泽兰属华泽兰中的倍半萜类成分具有抗肿瘤活性(岳建民，J.Nat.Prod,2004,67,638-643);吴双庆等报道泽兰属野马追中的倍半萜类成分具有抗肿瘤活性(吴双庆，HelveticaChimicaActa,2012,95,1637-44),本发明关注的是亲电倍半萜有效部位，有效部位由多个亲电倍半萜组成，各组分间协同，可以起到增效减毒的效果，也较易以此为中间体制备抗肿瘤有效部位类的创新中药新药，其研发难度、成本较单一成分新药的研究均具有比较优势。[0009]倍半萜内酯类成分为大麻叶泽兰重要生理活性成分。迄今为止，虽然国外学者研究报道，对大麻叶泽兰进行了较系统的化学成分研究，已从大麻叶泽兰中提取、分离得到了一系列新颖倍半萜内酯类化合物，并且鉴定了其化学结构；文献亦报道该植物中的多个倍半萜内酯类化合物体外具有抗肿瘤活性。但迄今未有对中国国内分布的大麻叶泽兰中含有的亲电倍半萜类有效部位的研究报道，亦没有提供一种工艺科学合理，有效部位性能稳定、药效物质明确、纯度高、生物活性强的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位的制备方法，及其在临床发病率高的乳腺癌治疗方面的应用。[0010]在泽兰属倍半萜纯化工艺方面，硅胶柱层析法应用较多。该法对大麻叶泽兰亲电[0011]在大麻叶泽兰亲电倍半萜应用方面，文献报道该属植物药的倍半萜内酯可用于抗肿瘤方面的应用，但文献多集中在倍半萜内酯单体的体外抗肿瘤活性，倍半萜内酯单体开发抗肿瘤新药具有高成本、高风险等缺陷。亲电倍半萜有效部位，具有体内、外抗肿瘤活性确切，药效物质明确，质量稳定、可控等优势，且有效部位具有多组分协同，增效减毒等优势，亦符合中药多组分、多靶点协同发挥药效的特色。亲电倍半萜有效部位可用于制备中药有效部位类创新抗肿瘤新药，符合中国新药研发的特色与优势。发明内容[0012]本发明的目的是针对上述问题，提供一种从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位及其制备方法和应用，该制备方法科学合理，工艺操作简单从菊科泽兰属中药大麻叶泽兰中提取亲电倍半萜有效部位。所述大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位(即从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位)药效物质明确，纯度高，大麻叶泽兰亲电倍半萜协同，亦符合中药多组分、多靶点协同发挥药效的优势及特点，其对发病率较高的乳腺癌的体内、外抑制活性亦预示其具有重要的应用价值。[0013]一种从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位，其活性成分包括式A结构的7Eucannabinolide、式D结构的Eupaformosanin、式E结构的hiyodorilactoneB和式F结构的ACBD[0015]一种从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位的制备方法，包括以下步骤：[0016](1)将大麻叶泽兰药材粉碎、过筛，用乙醇溶液浸泡24～48h后，然后用乙醇渗漉提取，收集渗漉液；[0017](2)将步骤(1)的渗漉液减压回收乙醇，所得浸膏用水混悬后，再用乙酸乙酯萃取3~5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到大麻叶泽兰乙酸乙酯粗提物；[0018](3)大麻叶泽兰乙酸乙酯粗提物与探针(亲核试剂)孵育，通过UPLC-MS(超高效液相色谱-质谱联用)分析孵育前后色谱图的变化，精准识别乙酸乙酯提取物中含亲电倍半萜的部位；[0019](4)大麻叶泽兰乙酸乙酯粗提物上正相氧化铝色谱柱或100～200目正相硅胶柱，8以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，在步骤(3)分析结果的指导下，收集含经孵育实验精准识别出来的含亲电倍半萜的流分，得到含有抗肿瘤有效部位的流分，[0020](5)将步骤(4)制备得到的有效部位粗产物，进行ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)中压柱层析分离，进一步收集富含亲电倍半萜的抗肿瘤有效部位的流分，减压回收溶剂，即得到从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位。下操作，亦不会造成热敏性有效成分的破坏或降解。所用大麻叶泽兰药材为菊科泽兰属植物大麻叶泽兰(EupatoriumcannabinumLinn.)的地上部分和或全草。大麻叶泽兰在杭州、[0022]作为优选，步骤(1)中，所述的乙醇溶液(即乙醇水溶液中乙醇)的体积百分含量为75～95%,用量为大麻叶泽兰药材质量的10～20倍，即所述的乙醇溶液的体积用量与大麻叶泽兰药材的质量之比为10L～20L:1kg。作为进一步的优选，步骤(1)浸泡和渗漉所用溶剂为95%乙醇。该提取溶剂的性质非常适合于提取大麻叶泽兰的全草和/或地上部分，能够更加高效、完全地获取药用部位中所述亲电倍半萜类活性成分，且能避免大量极性较大的非亲电倍半萜类杂质被提取出来。[0023]步骤(2)中，乙酸乙酯极性大于现有技术中的石油醚，能够将大麻叶泽兰乙醇提取物中亲电倍半萜类成分萃取完全；乙酸乙酯萃取，亦剔除了大麻叶泽兰醇提物中极性较大步骤(2)中，混悬所用的水的量为浸膏质量的3～10倍，即混悬所用的水的体积用量与浸膏质量之比为3L～10L:1kg,萃取所用的乙酸乙酯的量为浸膏质量的3～10倍，即萃取所用的乙酸乙酯的体积用量与浸膏质量之比为3L～10L:1kg。[0024]作为优选，步骤(3)中，通过超高效液相色谱(UPLC)分析，比较孵育前后色谱峰的消失或色谱峰面积的减小，精准识别富含所需分离、纯化的亲电倍半萜的部位。[0025]所选的探针(亲核试剂)为还原型谷胱甘肽(GSH),孵育的探针采用溶液的形式，还原型谷胱甘肽用Tris-HC1缓冲液溶解，配成浓度为3～10mmol/L,孵育时间为1～5小时。GSH能与大麻叶泽兰中的亲电倍半萜类成分发生亲电加成反应，通过UPLC-MS分析孵育前后大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物化学成分的变化，能精准识别所述亲电倍半萜。[0026]硅胶柱层析后，通过UPLC-MS分析所得流分，并将流分分析结果与(3)分析的结果进行比较，找到富含亲电倍半萜的流分，即：收集石油醚-乙酸乙酯体积比为：分。所述洗脱溶剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、药理活性好的富含大麻叶泽兰亲电倍半萜的有效流分。洗脱溶剂有比较严格的要求，并对体积比有限定，所述洗脱溶剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、药理活性好的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效流分。大麻叶泽兰倍半萜类成分几乎全部位于由体积比为2:1～1:4的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得大麻叶泽兰有效流分中亲电倍半萜类活性成分含量更高，分布更加集[0027]作为优选，步骤(5)中，将步骤(4)制备得到的有效部位粗产物，进行ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)中压柱层析分离，通过UPLC分析监测，进一步收集富含所述亲电倍半萜(孵育实验识别出来的色谱峰会消失或色谱峰面积会减小)的流分，剔除没有该特征的成分的9流分，减压回收溶剂，即得到从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位。[0028]中压柱层析分离采用40～60μm的十八烷基键合相硅胶作为填料，上样后用体积分数40～100%范围的甲醇水溶液梯度洗脱，即上样后分别用体积分数45%,55%,65%,100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱约3～5个柱体积。通过薄层色谱及UPLC检识，并与(3)分析的结果进行比较分析，收集富含能与GSH反应的流分，合并流分，减[0029]利用常规中药化学研究方法，提取、分离，并对主要有效成分进行结构鉴定，研究并阐明了有效部位的药效物质。[0030]一种从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤有效部位特别适合用于乳腺癌的治疗，特别适合用于制备治疗乳腺癌药物。[0031]该大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位体外对人源三阴性乳腺癌细胞株，具有一定的抑制作用。以MTT法对得到的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位，进行了抑制人源乳腺癌细胞MDA-MB-231两种人源乳腺癌细胞株具有显著的抑制作用，半数抑制浓度IC₅₀约为：1.53~3.30μg/mL。上述细胞株可采用市售产品，如：可采用美国模式培养物集存库ATCC(Americantypeculturecollection)的各种细胞株。[0032]该大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位体内对较难治疗的人源三阴性乳腺癌裸鼠异种移植瘤，亦具有一定的抑制作用。以人源肿瘤裸鼠移植瘤实验法对得到的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位，进行了体内抑制人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤增殖活性研究，结果显示，本发明制备的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位，给药剂量15mg/kg,给药为：56%。[0033]本发明大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位可与市售或者常用的载体结合，可用于制备预防或者/和治疗，或者/和协同治疗乳腺癌的药物。所述的药物可以为脂肪乳剂、注射[0035]按照本发明方法制备所得的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位，生物活性强，含有多个在生物医药领域具有广阔应用前景的倍半萜内酯类成分。多个亲电倍半萜天然组合物针、UPLC-MS分析、反相中压柱色谱，配合有效部位的药效物质研究，及体外抗乳腺癌活性研究，分离、纯化得到了由大麻叶泽兰多个特定倍半萜内酯：hiyodorilactoneD、3β-Hydroxyl-8β-sarracinolyoxycostunolide、Eucannabinolide、Eupaformosanin、廉价易得，毒性较低。正相色谱及反相中压柱色谱均适合进行工业化生产，制得的有效部位纯度更高，抗乳腺癌活性更强。本发明大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位的制备方法科学合附图说明[0036]图1为大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物与GSH孵育前后UPLC色谱图，其中，图1(A)为大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物与GSH孵育前UPLC色谱图，[0037]图1(B)为大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物与GSH孵育后UPLC色谱图。图，A为有效部位UPLC-MS分析的总离子流色谱图(TIC);B为有效部位UPLC-MS分析的UPLC色分别为有效部位中所鉴定的六个化合物对照品的UPLC色谱图。hiyodorilactoneD保留时间对应质谱图。Eucannabinolide保留时间对应质谱图。Eupaformosanin保留时间对应质谱图。hiyodorilactoneB保留时间对应质谱图。[0045]图9、图10和图11为大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位体内对人源三阴性乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤的抑制作用，其中，图9为生理盐水组与大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位给药组瘤块对比图；图10为给药后隔天监测裸小鼠的瘤块体积曲线；图11为生理盐水空白组与大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位组平均瘤块质量的对比图。具体实施方式[0046]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于[0048]大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位的制备方法包括下述步骤：95%乙醇冷浸48h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的20倍量(总计用去95%的乙醇40L),得到渗漉液。混悬至1.5L(混悬所用的水的体积用量与浸膏质量之比为5L:1kg),用1.5L的乙酸乙酯、1.5L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到大麻叶泽兰乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通过体外抗乳腺癌活性追踪，大麻叶泽兰抗乳腺癌有效成分主要集中在乙酸乙酯萃取液中，得到大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物154.2g。[0051]C、UPLC-MS分析：取40μL大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物的甲醇溶液(40mg/mL),加入112.5-7min40%A,7-7.5min40%-50%A,7.5-9min50%A,9-9.5min50%-60%A,9.5-11min60%A,11-12min60%-30%A,30%A再洗脱3min。进样体积1μL,流速0.25mL/min,柱温和样品室温度分别为30与25℃。紫外检测波长：220nm。质谱条件为：扫描模式：正离子模式，扫描范围：m/z200-800,喷雾电压：5.5KV,帘气：40psi,雾化气：55p离子源温度：550℃。大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物与GSH孵育前后UPLC色谱图如图1所示。25:1,20:1,5:1,2:1,3:2,1:1,2:3,1:2,1:3,1:4,0:1,并按极性由小到大的顺序依次进行以45%、55%,65%,100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个溶剂梯度洗脱约600mL(4个柱体积),100mL/瓶，所得流分进行UPLC分析，并将分析结果与大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物与GSH孵育前后UPLC-MS分析结果进行比较分析，收集富含亲电倍半萜的流分，合并，减压回收溶剂，即得所述大麻叶泽兰倍半萜内酯有效部位，约1.15g。[0054]F、大麻叶泽兰倍半萜内酯有效部位药效物质研究：按照常规中药化学研究方法，通过反相中压柱层析、制备型高效液相柱层析，核磁共振波谱、质谱等，从大麻叶泽兰倍半萜内酯有效部位中分离鉴定了六个倍半萜内酯类化合物，分别为：hiyodorilactoneD、3β-hiyodorilactoneB和9β-hydroxy-8β-0-tlgloylcostunohde。六个化合物的化学结构式、[0055]取上述制备的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位约10mg,精密称定，用甲醇定容至2mL容量瓶中，配成约5mg/mL的样品，样品10000r/min离心10min,取上清液，备用。取上述样谱质谱条件与步骤C中所述一致。其UPLC-MS分析的总离子流色谱图，UPLC色谱图，六个化合[0057]实施例1所得大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物，直接进行体外抗乳胰腺癌活性评价。结果显示：乙酸乙酯提取物抗乳腺癌活性，较实施例1所得大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位活性显著下降。UPLC分析大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物也显示，乙酸乙酯提取物化学成分类别复杂，需花较多精力去阐明其物质基础，亦很难做到质量稳定、可控。[0059]以氧化铝为填料，取大麻叶泽兰乙酸乙酯提取物样品上正相柱进行分离，结果显示大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位得率与实施例1接近，故正相柱填料用氧化铝及100~200目硅胶均可。[0061]大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位体外抗乳腺癌实验：取对数生长期的人源乳腺癌细胞株，消化计数后，按6～9×10³个细胞/100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁后，用不同浓度的实施例1制备的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位处理，每孔设三个复孔。药物与肿瘤细胞孵育48h后，加MTT,37℃继续孵掉培养液，加入DMSO(150μL/孔),振摇均匀后，用酶标仪在570nm处测定每个孔的光密度OD[0062]抑制率=(1-给药孔平均光密度值/对照组平均光密度值)×100%。根据抑制率计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅0),IC₅₀用origin软件计算。实验重复3次，IC₅₀取自ATCC,具体结果如表1所示。表1的结果显示，大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位体外对两株人源乳腺癌细胞株均具有显著的抑制作用。[0064]表1:大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位对人源乳腺癌细胞株的半数抑制浓度IC₅0值[0065]乳腺癌细胞株细胞来源IC₅₀值(Hg/mL)MDA-MB-468乳腺癌1.53±0.21MDA-MB-231乳腺癌3.30±0.68[0066]实施例5[0067]大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位体内抗乳腺癌实验：将人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞传代后，调整细胞密度为：2.5×10⁷上。在SPF级动物房里，裸小鼠在背部皮下接种肿瘤细胞。约7天左右，待肿瘤生长至50mm³,开始测量肿瘤体积，将裸小鼠随机分成两组，每组10只，一组是生理盐水对照组，另一组是大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位给药组，给药剂量为15mg/kg,每天给药一次，持续给药14结束后，处死裸小鼠后解剖裸小鼠取出肿瘤组织，并称取肿瘤重量。体积计算公式：体积=1/2×a×b²计算，其中a为肿瘤的最长长度，b为肿瘤的最短长度。相对肿瘤体V₀。其中V₀为分笼给药时候所测量的肿瘤体积，V为每次实验时肿瘤体积。具体结果如图9、图10和图11所示。图9、图10和图11所示的结果显示，大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位体内对人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤具有显著的抑制作用，15mg/kg剂量，给药14天，抑制率约为56%。[0068]本发明制备得到的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位可与市售或者常用的载体结[0069]本发明大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将本发明制备的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中，pH通常约5～8,较佳的pH约为6～8,pH可根据所选辅料、基质及治疗疾病病症的不同而有所变化。配制好的药物可以通过常规途径给药，包括(但并不限于):肌肉、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。所用载体介质包括(但并不限发明大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡糖糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊剂之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明制备的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位，还可以与其它抗乳腺癌药物协同使用。[0070]当本发明大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位被用做药物时，可将治疗有效剂量的大麻叶泽兰亲电倍半萜有效部位施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少10μg/kg体重，而且在大多数情况下不超过50mg/kg体重，较佳的给药剂量约为10μg/kg体重～30mg/kg体重。具体剂量还应考虑给药方式、病人健康状况等因素，这些属熟练医师技能范畴以内。[0071]本发明中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。1/15页A1/15页A说明书附3-Hydroxy-8B-saracinolyoxycot3-Hydroxy-8B-saracinolyoxycot9β-hydroxy-8p-O-tlgloylcosBEucaD3β-Hydroxyl-8β-sarracinolyoxyEEucannabinEEucannabinH