CN110760599A 大麻哈鱼微卫星分子标记位点及多态性引物和应用 （吉林省水产科学研究院）

1195号(72)发明人郑伟韩叶闫春梅万限公司37201大麻哈鱼微卫星分子标记位点及多态性引本发明公开了大麻哈鱼的微卫星分子标记位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性21.大麻哈鱼微卫星分子标记位点的序列，其特征在于，该序列为SEQID:1-10。2.如权利要求1所述微卫星分子标记位点序列，其特征在于，该微卫星分子标记位点两端的侧翼序列上设计的引物序列为SEQID:11-30。3.权利要求2所述的引物序列SEQID:11-30的筛选方法，其特征在于，该筛选方法基于全基因组的简化基因组测序后进行多态性筛选。4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法具体为：先用酶切法建库，然后进行测序，对读到的序列进行微卫星分析，先选出微卫星重复单元比较多的序列，再对比基因组文库筛选得到了多个微卫星分子标记位点，并根据相关位点，设计引物并予以合成；再在大麻哈鱼多个个体中进行PCR扩增验证，筛选出扩增产物正确的引物对，再对产物正确的引物对进行筛选，最终从中筛选出10对多态性良好的微卫星引物序列SEQID:11-5.权利要求1所述的微卫星分子标记位点序列SEQID:1-10在大麻哈鱼亲缘鉴定中的应用。6.权利要求2所述的引物序列SEQID:11-30在大麻哈鱼亲缘鉴定中的应用。7.如权利要求7所述的应用，其特征在于，该应用的具体亲缘鉴定方法包括以下步骤：2)荧光引物合成：对得到的10对引物序列SEQID:11-30进行荧光引物合成；性分析鉴定亲缘关系。3大麻哈鱼微卫星分子标记位点及多态性引物和应用技术领域[0001]本发明属于分子生物学DNA分子标记技术领域，具体涉及大麻哈鱼微卫星分子标记的开发技术。背景技术[0002]大麻哈鱼Oncorhynchusketa(Walbaum)隶属鲑科太平洋鲑属，具溯河洄游性，即为江里生、海里长又回原产地河流产卵繁殖。大麻哈鱼系世界名贵经济鱼类，其卵也是著名麻哈鱼也是吉林省长白山地区图们江流域著名的冷水性鱼类。但是，由于近些年其生存环境恶化，致使其资源急剧减少，目前已处于濒危状态，亟需大力开展水产种质资源保护工利影响导致水生生物灭绝的事例越来越多，且一经灭绝无法修复，因此保护大麻哈鱼等鱼类资源势在必行，有条件的国家也都采取人工增殖放流措施，并将此作为分配海洋捕捞份额的依据，而开展大麻哈鱼人工增殖放流属地的追踪调查研究是其中最首要的一环。[0003]即，如何建立微卫星分子标记方法鉴定亲子关系，有效地追踪大麻哈鱼人工增殖放流属地是当前亟需解决的问题。发明内容[0004]本发明的目的是提供大麻哈鱼微卫星分子标记位点以及其多态性引物，并提供具体的应用方法，以弥补现有技术的不足。[0005]微卫星标记(SSRs:simplesequencerepeats)是由2-6bp碱基组成的一个多次串联重复序列，又称为短序列重复(Shorttandemrepeats,STRS),是一种广泛应用在遗传学领域的DNA分子标记。STRS普遍存在于真核生物的基因组中，平均每10kb就出现一个STR位点，重复数为10-20次，其中动物体中以双核苷酸(CA/GT)n最为常见提供的遗传信息多，PCR扩增效果重复性好，以及在基因组中分散分布等优点，常用于群体遗传学分析、基因图谱分析及亲缘关系等研究，但是，微卫星标记研究和应用难点在于难以筛选合适的标记位点。[0006]为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：[0007]大麻哈鱼微卫星分子标记位点的序列为SEQID:1-10。[0008]所述微卫星分子标记位点序列SEQID:1-10的微卫星两端的侧翼序列上设计的引物序列为SEQID:11-30。[0009]所述微卫星分子标记位点序列SEQID:1-10及引物序列SEQID:11-30的筛选是基于全基因组的简化基因组测序后进行多态性筛选。[0010]进一步的，所述具体的筛选方法为：先用酶切法建库，然后进行测序，对读到的序列进行微卫星分析，先选出微卫星重复单元比较多的序列，再对比基因组文库筛选得到了50个微卫星分子标记位点，并根据相关位点，设计引物并予以合成；再在大麻哈鱼多个个体4中进行PCR扩增验证，筛选出扩增产物正确的引物对，再对产物正确的引物对进行筛选，最终从中筛选出10对多态性良好的微卫星引物序列SEQID:11-30,再反向得到相对应的微卫星分子标记位点序列SEQID:1-10。[0011]所述微卫星分子标记位点，对应的位点序列和对应的引物信息如表1:[0012]表1[0013]位点微卫星序列正向引物序列反向引物序列[0014]所述的微卫星分子标记位点序列SEQID:1-10能够用于大麻哈鱼亲缘鉴定。[0015]所述的引物序列SEQID:11-30能够用于大麻哈鱼亲缘鉴定。[0016]进一步的，所述亲缘鉴定方法具体包括以下步骤：[0017]1)样品基因组DNA提取；[0018]2)荧光引物合成：对得到的10对引物进行荧光引物合成；[0019]3)PCR扩增，产物分析检测；[0020]4)对上述检测数据分析，计算等位基因、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量，多态性分析鉴定亲缘关系。[0021]本发明的优点和技术效果：[0022]本发明从大麻哈鱼基因组DNA中筛选出10个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获得引物的扩增结果具有多态性和稳定性，可适用于大麻哈鱼亲缘关系鉴定，种群遗传多样性检测，以及分子辅助育种领域。[0023]大麻哈鱼微卫星分子标记位点及引物的开发，能够应用于建立大麻哈鱼DNA条形编码，在子二代F2繁殖洄游的年份和季节，对捕获的大麻哈鱼进行遗传多样性分析并逐一的亲缘关系认定。利用本发明能够更加准确掌握我国内陆水域自然江河中放流大麻哈鱼的资料，进一步调整保护措施，同时在河口捕获大麻哈鱼的放流来源的确定将有利地支持我国海洋捕捞权利。本发明为大麻哈鱼的亲缘关系的鉴定以及遗传多样性提供资料，能够更加准确评估大麻哈鱼增殖放流效果。[0024]说明书附图[0025]图1为实施例中部分引物扩增效果图一。[0026]图2为实施例中部分引物扩增效果图二。5具体实施方式[0027]实施例1微卫星分子标记的筛选[0028]本发明根据构建的大麻哈鱼鳍条组织基因组文库中进行的SSR分析，对比基因组文库筛选得到了50个微卫星分子标记位点，并根据相关位点，设计了50对筛选引物序列，在大麻哈鱼16个个体中进行验证。[0029]实施例2微卫星引物的验证[0030]以大麻哈鱼基因组为模板，用50对引物序列进行温度梯度PCR以摸索出最佳退火温度，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。的条带的引物对。[0032]实施例3微卫星引物多态性验证[0033]对实施例2得到有条带的引物进行荧光引物合成，在其中1条引物的5'加FAM/HEX/系扩增，能够得到非常好的引物扩增效果。×50cycle,(94℃30s,50℃30s,72℃30s)×30cycle,72℃5min.产物用ABI3730DNA测序仪分析。软件Cervus3.0进行遗传指标(等位基因(na:0bservednumberofalleles)、观测杂合度(Ho:0bservedheterozygosity)、期望杂合度(HE:Expectedheterozygosity)、多态信息含量(PIC:polymorphisminformationcontent))计算，最终得到如下表2的。[0035]表2:10个微卫星位点的重复单位、引物的相关信息6位点单元引物序列大小7050705070440505500547090775081208600968000PIC为多态信息含量。[0039]本发明的10对引物序列对50个大麻哈鱼基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从5到14不等，平均等位基因数为9.2,平均观望杂合度0.698,平均期望杂合度为0.8046。[0040]实施例4:亲缘鉴定方法[0041]选取327尾大麻哈鱼鳍条样本进行基因组DNA提取，用此10对微卫星引物进行PCR×50cycle,(94℃30s,50℃30s,72℃30s)×30cycle,72℃5min产物上3730x1基因分析仪检测；8位点单元引物序列大小17646917703340618032751619287701681566[0045]本发明的10对引物对327个大麻哈鱼基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明：10个微卫星位点的平均等位基因数为15.3,平均观望杂合度0.769,平均期望杂合度为0.798.PIC平均0.774。[0046]上述实施例说明了本发明的微卫星标记位点和相应的引物序列能够用于大麻哈鱼遗传多样性检测以及家系和个体鉴定。[0047]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。序列表<110>吉林省水产科学研究院<120>大麻哈鱼微卫星分子标记位点及多态性引物和应用<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)aaccaaaagcttgcactttgttttcttgctagttctgacatgctgctgctacagatttgtgtggcctgttgctgttcataatagcccatgtgtgtgttgcgctagcctgctaacctcctcagcacctt230<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)tcaaacaatggttttgctaattaaaaatagctgatagaatattctacacagtgcctttgcatctctctctc<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)ttacaaggcttctgcccacctctgtagaccttcctgcccattttccaactttataccctc6011agtagagccctctgcacaccagatttggtttcactactgtgtttgtagaaagcggacgaggcagcgttggcaggcgctagaagcagagcgggagcgt<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)agggtgtctgttgtgccagtgacagacgagaaaccctctcattccatgtcattccagctagcattagcattagcagcagcagtgca<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)tctcctctctttccttctatatcctcccctctcttc<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)atggccattacatgccgtccgagtgtcctcaagggatgtgtgtgtgttgcccatttccctttcagatgagctgttatctcagagagagagagaaggagaggcatcaccccctctaacacacac<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)gagaaagagagagagatggaggcagtggattcatgaaccgtttccagtttacatagagtccagtgaagttctttcagggccga224<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)<213>大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)aacctcccccatgtttcttgaatcttgttttctatgcaatgttgagaatccacataactctgtgtgcgtgtgtttgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttattttaaaaatgtgcaagggtgccaatacatttggccagaactataaccaagatttttc