CN110878010A 一种大麻萜酚的提取分离方法 （云南绿新生物药业有限公司）

(10)申请公布号CN110878010A(21)申请号201911290578.4(71)申请人云南绿新生物药业有限公司地址655000云南省曲靖市沾益区城西工业园区(72)发明人刘胜贵王钲霖蒋永昌付彬彬李智高孔令羽(54)发明名称一种大麻萜酚的提取分离方法(57)摘要本发明公开了一种大麻萜酚的提取分离方法，该方法采用乙醇水溶液提取后，用有机溶剂萃取富集大麻萜酚，活性炭脱色后经聚酰胺树脂柱、中性氧化铝和键合硅胶柱纯化富集，最后再经聚酰胺类填料制备色谱柱分离，获得的目标段2(1)以大麻的花叶部位为原料，粉碎制成30-50目颗粒后采用质量浓度60-80%的乙醇溶液热回流提取2-3次，每次回流提取1-3小时，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得乙醇提取浓缩液；(2)待步骤(1)乙醇提取浓缩液冷却至常温后，加入一定量的正己烷萃取，将大麻萜酚萃取到有机溶剂相层中，收集合并有机溶剂相层，回收有机溶剂，得大麻萜酚萃取浓缩液；(3)在步骤(2)的大麻萜酚萃取浓缩液中加入一定量的活性炭，升温搅拌，静置2分钟后(4)在步骤(3)的大麻萜酚粗膏中加入质量浓度20-30%的乙醇，加热搅拌形成混悬液，静置冷却后取上清液过聚酰胺树脂柱，上样完后用纯净水洗脱杂质至流出液为无色，然后用质量浓度30-42%乙醇溶液洗聚酰胺树脂柱至流出液为无色，再用质量浓度55-60%的乙醇溶液洗脱至无杂质，最后用质量浓度65-80%的乙醇溶液洗脱收集大麻萜酚，分瓶收集，薄层鉴别后合并含有大麻萜酚目标物的洗脱液，减压浓缩回收乙醇，得聚酰胺层析大麻萜酚粗(5)将步骤(4)聚酰胺层析大麻萜酚浓缩物用中性氧化铝干法拌样，上中性氧化铝柱，干法上样后，用氯仿-正己烷溶液洗脱除杂，然后用氯仿-乙酸乙酯-乙醇胺液洗脱大麻萜酚，收集含大麻萜酚目标物洗脱液，浓缩得大麻萜酚半成(6)将步骤(5)大麻萜酚粗品用甲醇溶解，过氨基键合硅胶柱、氰基键合硅胶柱或苯基键合硅胶柱用质量浓度20%的甲醇溶液平衡后，使用质量浓度30%-42%的甲醇溶液洗2-3个柱体积，然后用质量浓度52-65%的甲醇溶液洗脱，最后用质量浓度72-85%的甲醇溶液洗脱，薄层层析鉴别，洗脱至无大麻萜酚斑点为止，对浓度72-85%的甲醇洗脱液进行薄层层析鉴别，合并含有大麻萜酚的洗脱液，浓缩得大麻(7)将步骤(6)中浓缩物用层析溶剂溶解，过聚酰胺类填料制备色谱柱，收集大麻萜酚(8)步骤(7)中得到的浓缩液冷冻结晶，过滤；得到的晶体再用二次重蒸丙酮水溶解结2.根据权利要求1所述的一种大麻萜酚的提取分离方法，其特征在于，所述步骤(1)中回流提取第一次提取添加原料质量7-9倍的乙醇溶液，其余提取添加原料质量4-5倍的乙醇溶液，浓缩温度75-80℃,真空度0.06-0.078MPa,浓缩至1/10体积。3.根据权利要求1所述的一种大麻萜酚的提取分离方法，其特征在于，所述步骤(2)加入正己烷萃取，正己烷加入量为乙醇提取浓缩液的2-3倍，萃取次数为2-3次，合并萃取液浓缩至乙醇提取浓缩液体积的1/5。4.根据权利要求1所述的一种大麻萜酚的提取分离方法，其特征在于，所述步骤(3)加入活性炭的量为大麻萜酚萃取浓缩液的2-8%,升温至40-50℃,搅拌15-20min。5.根据权利要求1所述的一种大麻萜酚的提取分离方法，其特征在于，所述步骤(5)用正己烷-氯仿是正己烷、氯仿按体积比10:1溶液洗脱除杂；然后用氯仿-乙酸乙酯-乙醇胺溶液洗脱大麻萜酚，是氯仿、乙酸乙酯和乙醇胺按体积比10:1:1的比例混合制得。6.根据权利要求1所述的一种大麻萜酚的提取分离方法，其特征在于，所述步骤(8)中3浓缩液冷冻结晶，冷冻温度为-15—-10℃,结晶时长18-24h;二次重蒸丙酮水的配比为4:4一种大麻萜酚的提取分离方法技术领域[0001]本发明涉及一种大麻萜酚的提取分离方法，属于植物化学成分提取领域。背景技术[0002]火麻，又称汉麻、工业大麻，是我国传统的药材和保健食品原料之一。国家卫生部2002年文件将火麻仁列入“既是药品又是食品的物品名单”,这就使火麻食品的开发与利用有了法规保障。这也使得对火麻植物花叶的开发提供了条件与支撑。近年来，随着人们对火麻认识的加深，以及对其加工产品所具有的较强的生理功能研究的深入，各国普遍重新放开对火麻及其产品开发的限制。随之而来的就是，火麻的种植面积的不断扩大和火麻产量的逐年提升。作为火麻植物的副产物，火麻花叶除了可以作为秸秆燃烧作肥外，还含有丰富的具有较强生理活性的大麻酚类物质，尤其是大麻二酚(CBD)。如何对火麻花叶进行高附加值的利用，是当前迫切需要解决的一个技术与环境问题。目前关于大麻二酚的利用与提取报道颇多，在医药行业和人类大健康行业中大麻二酚已经充分体现出它独特的价值。作为大麻素类的大麻萜酚，在结构上不仅与大麻二酚具有相似的化学结构，在大麻花叶中同样具有可提取的价值。本发明采用乙醇水溶液提取配合柱层析分离纯化，对汉麻叶中大麻萜酚的提取工艺进行探寻及优化，以寻找汉麻叶中大麻萜酚的最适提取条件及工业可行性，目的在于研发一个适合工业化大规模生产的工艺，旨在为充分利用汉麻叶中的生物活性成分，实现汉麻资源的综合利用和效益最大化提供指导。发明内容[0003]为充分利用汉麻叶中的生物活性成分，探寻汉麻叶中大麻萜酚的可利用度，本发明提供了一种收率高、产品纯度高的大麻萜酚的提取分离方法。[0004]本发明方法具体步骤如下：(1)以大麻的花叶部位为原料，粉碎制成30-50目颗粒后采用质量浓度60-80%的乙醇溶液热回流提取2-3次，每次回流提取1-3小时，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得乙醇提取浓缩液。[0005](2)待步骤(1)乙醇提取浓缩液冷却至常温后，加入一定量的正己烷萃取，将大麻萜酚萃取到有机溶剂相层中，收集合并有机溶剂相层，回收有机溶剂，得大麻萜酚萃取浓缩[0006](3)在步骤(2)的大麻萜酚萃取浓缩液中加入一定量的活性炭，升温搅拌，静置2分[0007](4)在步骤(3)的大麻萜酚粗膏中加入质量浓度20-30%的乙醇，加热搅拌形成混悬液，静置冷却后取上清液过聚酰胺树脂柱，上样完后用纯净水洗脱杂质至流出液为无色，然后用质量浓度30-42%乙醇溶液洗聚酰胺树脂柱至流出液为无色，再用质量浓度55-60%的乙醇溶液洗脱至无杂质，最后用质量浓度65-80%的乙醇溶液洗脱收集大麻萜酚，分瓶收集，薄5层鉴别后合并含有大麻萜酚目标物的洗脱液，减压浓缩回收乙醇，得聚酰胺层析大麻萜酚粗品。[0008](5)将步骤(4)聚酰胺层析大麻萜酚浓缩物用中性氧化铝干法拌样，上中性氧化铝柱，干法上样后，用氯仿-正己烷溶液洗脱除杂，然后用氯仿-乙酸乙酯-乙醇胺液洗脱大麻[0009](6)将步骤(5)大麻萜酚粗品用甲醇溶解，过氨基键合硅胶柱、氰基键合硅胶柱或苯基键合硅胶柱，加压柱层析。键合硅胶柱用质量浓度20%的甲醇溶液平衡后，使用质量浓度30%-42%的甲醇溶液洗2-3个柱体积，然后用质量浓度52-65%的甲醇溶液洗脱，最后用质量浓度72-85%的甲醇溶液洗脱，薄层层析鉴别，洗脱至无大麻萜酚斑点为止，对浓度72-85%的甲醇洗脱液进行薄层层析鉴别，合并含有大麻萜酚的洗脱液，浓缩得大麻萜酚半纯品。[0010](7)将步骤(6)中浓缩物用层析溶剂溶解，过聚酰胺类填料制备色谱柱，收集大麻萜酚段洗脱液，浓缩回收溶剂，即得到单体大麻萜酚溶液。[0011](8)步骤(7)中得到的浓缩液冷冻结晶，过滤；得到的晶体再用二次重蒸丙酮水溶[0012]所述步骤(1)中回流提取第一次提取添加原料质量7-9倍的乙醇溶液，其余提取添加原料质量4-5倍的乙醇溶液，浓缩温度75-80℃,真空度0.06-0.078MPa,浓缩至1/10体积。[0013]所述步骤(2)加入正己烷萃取，正己烷加入量为乙醇提取浓缩液的2-3倍，萃取次数为2-3次，合并萃取液浓缩至乙醇提取浓缩液体积的1/5。[0014]所述步骤(3)加入活性炭的量为大麻萜酚萃取浓缩液的2-8%,升温至40-50℃,搅拌15-20min。[0015]所述步骤(5)用正己烷-氯仿是正己烷、氯仿按体积比10:1溶液洗脱除杂；然后用氯仿-乙酸乙酯-乙醇胺溶液洗脱大麻萜酚，是氯仿、乙酸乙酯和乙醇胺按体积比10:1:1的比例混合制得。[0016]所述步骤(8)中浓缩液冷冻结晶，冷冻温度为-15—-10℃,结晶时长18-24h;;二次重蒸丙酮水的配比为4:1(丙酮：水)。[0017]本发明方法的优点和技术效果：本发明方法中采用醇提浓缩后，正己烷萃取，利用了目标物极溶的特性，将目标物尽可能的萃取到正己烷中，同时将大部分杂质留在水中，大大提高了粗提物的纯度；在得到的萃取浓缩液中加入活性炭，使得萃取浓缩液中的色素和其他杂质明显减少，更加方便了后续的分离纯化。采用聚酰胺树脂柱层析纯化基本不存在死吸附，样品很少损失，而现有的硅胶工艺死吸附太大，样品损失太多，并且用有机溶剂洗脱成本太高；利用中性氧化铝对酚类物质的死吸附，把目标物死吸附在柱子，先溶剂过柱除杂再用碱性溶剂洗脱氧化铝死吸附的大麻萜酚，有效富集大麻萜酚，达到较好的除杂效果；采用色谱柱分离得到了高纯度的大麻萜酚；本发明方法操作简单，目标物质在整个工艺中流失量小，杂质去除完全，获得的产品纯度高大于98%,收率高。具体实施方式[0018]为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合6本大麻萜酚的提取分离方法步骤如下：(1)以大麻的花叶部位为原料，粉碎制成40目颗粒，加入质量浓度80%的乙醇溶液热回一次提取添加原料质量8倍的乙醇溶液，其余提取添加原料质量4倍的乙醇溶液，浓缩温度78℃,真空度0.06-0.078MPa。[0020](2)待步骤(1)乙醇提取浓缩液冷却至常温后，加入乙醇提取浓缩液的2倍的正己烷萃取，萃取2次，将大麻萜酚萃取到有机溶剂相层中，收集合并有提取浓缩液体积的1/5,得大麻萜酚萃取浓缩液。[0021](3)在步骤(2)的大麻萜酚萃取浓缩液中加入大麻萜酚萃取浓缩液的8%的活性炭，升温至42℃,搅拌20min,静置2分钟后用玻砂漏斗过滤，滤液浓缩抽干，得到大麻萜酚粗膏。[0022](4)在步骤(3)的大麻萜酚粗膏中加入质量浓度20%的乙醇，加热60℃搅拌形成混悬液，静置冷却后取上清液过聚酰胺树脂柱，上样完后用纯净水洗脱杂质至流出液为无色，然后用质量浓度30%乙醇溶液洗聚酰胺树脂柱至流出液为无色，再用质量浓度55%的乙醇溶液洗脱至无杂质，最后用质量浓度80%的乙醇溶液洗脱收集大麻萜酚，分瓶收集，薄层鉴别后合并含有大麻萜酚目标物的洗脱液，减压浓缩回收乙醇，得大麻萜酚浓粗品。[0023](5)将步骤(4)聚酰胺层析大麻萜酚浓缩物用中性氧化铝干法拌样，上中性氧化铝柱，干法上样后，用体积比10:1的正己烷、氯仿溶液洗脱除杂，然后用体积比乙酸乙酯-乙醇胺液洗脱大麻萜酚，收集含大麻萜酚目标物洗脱液，浓缩得大麻萜酚半成[0024](6)将步骤(5)大麻萜酚粗品用甲醇溶解，过氨基键合硅胶柱、氰基键合硅胶柱或苯基键合硅胶柱，加压柱层析，键合硅胶柱用质量浓度20%的甲醇溶液平衡后，使用质量浓度36%的甲醇溶液洗3个柱体积，然后用质量浓度60%的甲醇溶液洗脱，最后用质量浓度85%的甲醇溶液洗脱，薄层层析鉴别，洗脱至无大麻萜酚斑点为止，对浓度85%的甲醇洗脱液进[0025](7)将步骤(6)中浓缩物用30%的丙酮水溶解，过聚酰胺类填料制备色谱柱。上样完后用质量浓度42%丙酮溶液洗至流出液为无色，再用质量浓度57%的丙酮溶液洗脱，最后用质量浓度80%的丙酮溶液洗脱，收集大麻萜酚段洗脱液，将丙酮浓缩至尽，即得到单体大麻萜酚溶液。[0026](8)步骤(7)中得到的浓缩液放入冷冻柜中，温度设为-15—-10℃,结晶24h,玻砂漏斗过滤；得到的晶体再用4:1(丙酮：水)二次重蒸丙酮水溶解，结燥得到大麻萜酚成品，含量98.2%,收率77%。[0027]实施例2本大麻萜酚的提取分离方法步骤如下：(1)以大麻的花叶部位为原料，粉碎制成40目颗粒，加入质量浓度80%的乙醇溶液热回一次提取添加原料质量8倍的乙醇溶液，其余提取添加原料质量4倍的乙醇溶液，浓缩温度78℃,真空度0.06-0.078MPa。[0028](2)待步骤(1)乙醇提取浓缩液冷却至常温后，加入乙醇提取浓缩液的2倍的正己7提取浓缩液体积的1/5,得大麻萜酚萃取浓缩液。[0029](3)在步骤(2)的大麻萜酚萃取浓缩液中加入大麻萜酚萃取浓缩液的8%的活性炭，升温至42℃,搅拌20min,静置2分钟后用玻砂漏斗过滤，滤液浓缩抽干，得到大麻萜酚粗膏。[0030](4)在步骤(3)的大麻萜酚粗膏中加入质量浓度20%的乙醇，加热60℃搅拌形成混悬液，静置冷却后取上清液过聚酰胺树脂柱，上样完后用纯净水洗脱杂质至流出液为无色，然后用质量浓度35%乙醇溶液洗聚酰胺树脂柱至流出液为无色，再用质量浓度60%的乙醇溶液洗脱至无杂质，最后用质量浓度80%的乙醇溶液洗脱收集大麻萜酚，分瓶收集，薄层鉴别后合并含有大麻萜酚目标物的洗脱液，减压浓缩回收乙醇，得大麻萜酚浓粗品。[0031](5)将步骤(4)聚酰胺层析大麻萜酚浓缩物用中性氧化铝干法拌样，上中性氧化铝柱，干法上样后，用体积比10:1的正己烷、氯仿溶液洗脱除杂，然后用体积比乙酸乙酯-乙醇胺液洗脱大麻萜酚，收集含大麻萜酚目标物洗脱液，浓缩得大麻萜酚半成[0032](6)将步骤(5)大麻萜酚粗品用甲醇溶解，过氨基键合硅胶柱、氰基键合硅胶柱或苯基键合硅胶柱，加压柱层析，键合硅胶柱用质量浓度20%的甲醇溶液平衡后，使用质量浓度40%的甲醇溶液洗3个柱体积，然后用质量浓度55%的甲醇溶液洗脱，最后用质量浓度80%的甲醇溶液洗脱，薄层层析鉴别，洗脱至无大麻萜酚斑点为止，对浓度85%的甲醇洗脱液进[0033](7)将步骤(6)中浓缩物用30%的丙酮水溶解，过聚酰胺类填料制备色谱柱。上样完后用质量浓度40%丙酮溶液洗至流出液为无色，再用质量浓度55%的丙酮溶液洗脱，最后用质量浓度75%的丙酮溶液洗脱，收集大麻萜酚段洗脱液，将丙酮浓缩至尽，即得到单体大麻萜酚溶液。[0034](8)步骤(7)中得到的浓缩液放入冷冻柜中，温度设为-15—-10℃,结晶24h,玻砂漏斗过滤；得到的晶体再用4:1(丙酮：水)二次重蒸丙酮水溶解，结燥得到大麻萜酚成品，含量98.6%,收率79%。[0035]实施例3本大麻萜酚的提取分离方法步骤如下：(1)以大麻的花叶部位为原料，粉碎制成40目颗粒，加入质量浓度80%的乙醇溶液热回一次提取添加原料质量8倍的乙醇溶液，其余提取添加原料质量4倍的乙醇溶液，浓缩温度78℃,真空度0.06-0.078MPa。[0036](2)待步骤(1)乙醇提取浓缩液冷却至常温后，加入乙醇提取浓缩液的2倍的正己提取浓缩液体积的1/5,得大麻萜酚萃取浓缩液。[0037](3)在步骤(2)的大麻萜酚萃取浓缩液中加入大麻萜酚萃取浓缩液的8%的活性炭，升温至42℃,搅拌20min,静置2分钟后用玻砂漏斗过滤，滤液浓缩抽干，得到大