2025年分子PCR试题及答案

2025年分子PCR试题及答案一、单项选择题（每题2分，共30分）1.关于PCR反应体系的组成，下列哪项描述错误？A.dNTPs是合成DNA的原料，浓度过高会抑制Taq酶活性B.Mg²+浓度过低会导致引物与模板结合效率下降C.引物浓度过高可能引发非特异性扩增D.TaqDNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性，可校正碱基错配答案：D（Taq酶不具有3'→5'外切酶活性，无校正功能，易错配）2.逆转录PCR（RT-PCR）中，若以总RNA为模板直接进行PCR扩增，最可能出现的结果是？A.扩增出目的cDNAB.扩增出基因组DNA污染片段C.无扩增产物D.扩增出mRNA的二级结构片段答案：C（RNA不能直接作为PCR模板，需先逆转录为cDNA）3.荧光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenI染料的作用原理是？A.与双链DNA小沟结合，激发荧光B.与引物5'端标记的荧光基团发生FRET效应C.特异性识别目标序列的茎环结构D.嵌入单链DNA的磷酸骨架，稳定双链结构答案：A（SYBRGreenI特异性结合双链DNA小沟，游离状态荧光弱，结合后荧光增强）4.多重PCR技术的核心难点在于？A.提高Taq酶的热稳定性B.设计多对引物时避免引物间相互作用C.优化dNTPs的浓度配比D.缩短变性时间以减少模板降解答案：B（多重PCR需多对引物同时扩增，引物间易形成二聚体或竞争模板，设计难度大）5.数字PCR（dPCR）与qPCR的主要区别是？A.dPCR无需标准曲线，通过绝对计数实现定量B.dPCR使用荧光探针，qPCR使用染料C.dPCR扩增效率更高，灵敏度可达单拷贝D.dPCR仅用于病原体检测，qPCR用于基因表达分析答案：A（dPCR通过微滴化将模板分配到独立反应单元，通过阳性微滴比例绝对定量，无需标准曲线）6.PCR扩增时，若退火温度过高，最可能导致？A.引物与模板结合不充分，无扩增产物B.非特异性扩增增多C.延伸时间延长，产物量增加D.Taq酶失活，反应终止答案：A（退火温度过高，引物与模板的氢键难以形成，结合效率下降，可能无产物）7.某实验室使用PCR检测结核分枝杆菌，阳性对照扩增正常，但临床样本均无扩增条带，最可能的原因是？A.样本中结核分枝杆菌载量过高B.样本处理时核酸提取失败C.Taq酶保存温度为-20℃（正确保存条件）D.引物退火温度比理论Tm值低5℃答案：B（阳性对照正常说明试剂和扩增条件无问题，样本无条带多因核酸提取失败或样本中无目标核酸）8.实时荧光定量PCR中，Ct值（循环阈值）与初始模板量的关系是？A.Ct值越大，初始模板量越多B.Ct值越小，初始模板量越多C.Ct值与初始模板量呈指数正相关D.Ct值与初始模板量无关答案：B（Ct值是荧光信号达到阈值时的循环数，初始模板量越多，达到阈值所需循环数越少，Ct值越小）9.用于检测RNA病毒（如流感病毒）的PCR技术是？A.常规PCRB.巢式PCRC.RT-PCRD.touchdownPCR答案：C（RNA病毒需先通过逆转录提供cDNA，再进行PCR扩增）10.PCR反应中，延伸步骤的温度通常设置为？A.94-98℃B.50-65℃C.70-75℃D.37-42℃答案：C（Taq酶最适延伸温度为72℃，通常设置70-75℃）11.引物设计时，GC含量建议控制在？A.10%-20%B.20%-30%C.40%-60%D.70%-80%答案：C（GC含量过低影响引物与模板结合稳定性，过高易形成二级结构，40%-60%为理想范围）12.下列哪种PCR技术可用于基因突变检测？A.多重PCRB.等位基因特异性PCR（AS-PCR）C.原位PCRD.热启动PCR答案：B（AS-PCR通过设计针对突变位点的特异性引物，仅当模板存在突变时才扩增）13.PCR产物电泳后出现smeared条带（拖尾），可能的原因是？A.引物浓度过低B.模板浓度过高C.退火温度过高D.dNTPs浓度过低答案：B（模板浓度过高会导致扩增产物过多，电泳时出现拖尾；或延伸时间过长、酶量过多）14.热启动PCR的主要目的是？A.提高扩增效率B.减少非特异性扩增C.延长Taq酶寿命D.降低反应成本答案：B（热启动PCR通过抑制低温下酶的活性，避免引物与非特异性模板结合引发的预扩增）15.数字PCR中，微滴化处理的主要作用是？A.提高反应体系的热传导效率B.将模板分子分配到独立微滴，实现单分子扩增C.减少荧光染料的非特异性结合D.降低Taq酶的用量答案：B（微滴化使每个微滴成为独立反应单元，单个模板分子在微滴内扩增，通过计数阳性微滴实现绝对定量）二、填空题（每空1分，共20分）1.PCR反应的三个基本步骤是______、______、______。答案：变性；退火；延伸2.逆转录PCR（RT-PCR）中，常用的逆转录酶有______（如M-MLV）和______（如AMV）。答案：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶；禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶3.荧光定量PCR的定量方法包括______（需标准曲线）和______（通过内参基因校正）。答案：绝对定量；相对定量4.引物设计时，应避免在3'端出现______（如连续G/C），否则易导致非特异性扩增。答案：碱基堆积5.TaqDNA聚合酶缺乏______外切酶活性，因此PCR产物通常带有______（A/T/C/G）突出末端，可用于TA克隆。答案：3'→5'；A6.多重PCR需使用______（高/低）浓度的引物，且各引物的Tm值应______（相近/差异大），以保证同步扩增。答案：低；相近7.数字PCR的结果分析基于______分布原理，通过计算阳性微滴比例推导初始模板浓度。答案：泊松8.PCR扩增失败时，若阴性对照出现条带，提示______污染；若阳性对照无条带，提示______失效。答案：试剂（或交叉）；引物/酶/模板9.实时荧光定量PCR中，常用的荧光标记方法包括______（如SYBRGreenI）和______（如TaqMan探针）。答案：染料法；探针法10.巢式PCR通过______轮扩增提高特异性，第一轮使用______引物，第二轮使用______引物。答案：两；外；内三、简答题（每题8分，共40分）1.简述引物设计的基本原则。答案：（1）长度：18-25个核苷酸，过短特异性差，过长扩增效率低；（2）GC含量：40%-60%，避免过高（易形成二级结构）或过低（结合不稳定）；（3）Tm值：引物与模板的解链温度，上下游引物Tm值差异不超过5℃，通常55-65℃；（4）避免二级结构：引物内部避免发夹结构（ΔG＜-5kcal/mol），引物间避免二聚体（尤其是3'端互补）；（5）3'端特异性：3'端碱基尽量为G/C，避免连续相同碱基（如CCC），且不能与非目标序列互补；（6）特异性：通过BLAST比对确保引物仅与目标序列结合，避免扩增基因组重复序列。2.比较SYBRGreenI染料法与TaqMan探针法荧光定量PCR的优缺点。答案：（1）SYBRGreenI法：优点是成本低（无需定制探针）、操作简单（仅需引物）；缺点是特异性差（染料结合所有双链DNA，可能扩增非特异性产物导致假阳性）、无法区分不同扩增子（多靶点检测需电泳验证）。（2）TaqMan探针法：优点是特异性高（探针与目标序列特异性杂交，结合Taq酶的5'→3'外切活性切割探针释放荧光）、可进行多重检测（不同探针标记不同荧光基团）；缺点是成本高（需定制探针）、设计复杂（探针需避免二级结构，与引物位置匹配）。3.分析PCR扩增中出现非特异性条带的可能原因及解决措施。答案：可能原因：（1）引物设计不当（如引物与非目标序列互补、引物二聚体）；（2）退火温度过低（引物与模板非特异性结合）；（3）模板浓度过高（杂质干扰或过多非目标序列）；（4）Taq酶用量过多（催化非特异性反应）；（5）Mg²+浓度过高（增强酶活性，降低引物结合特异性）。解决措施：（1）重新设计引物（BLAST验证特异性，避免二聚体）；（2）提高退火温度（根据引物Tm值调整，或使用touchdownPCR）；（3）稀释模板（降低杂质和非目标序列浓度）；（4）减少Taq酶用量（常规反应1-2.5U即可）；（5）优化Mg²+浓度（通常1.5-2.5mM，可通过梯度实验确定）。4.简述逆转录PCR（RT-PCR）的操作流程及关键注意事项。答案：操作流程：（1）RNA提取：使用TRIzol或柱式试剂盒提取总RNA，确保无DNA污染（可通过DNaseI处理）；（2）逆转录反应：加入随机引物/oligo(dT)/特异性引物，在逆转录酶（如M-MLV）作用下合成cDNA；（3）PCR扩增：以cDNA为模板，加入目标基因引物进行常规PCR或qPCR。关键注意事项：（1）RNA易降解，需全程保持无RNase环境（使用DEPC水、RNase抑制剂）；（2）逆转录前需检测RNA质量（通过A260/A280比值＞1.8，电泳观察28S/18S条带比例）；（3）避免基因组DNA污染（可设置无逆转录酶的对照，若该对照扩增出条带，说明DNA污染）；（4）逆转录引物选择：检测特定mRNA用特异性引物，检测未知RNA用随机引物，检测全长mRNA用oligo(dT)。5.数字PCR（dPCR）的技术原理及在临床检测中的应用优势。答案：技术原理：将反应体系分割成数万个微滴（或微腔），每个微滴包含0或1个模板分子；进行PCR扩增后，通过荧光检测统计阳性微滴数；根据泊松分布公式（λ=-ln(1-p)，其中p为阳性微滴比例）计算初始模板浓度（拷贝数/μL）。临床应用优势：（1）绝对定量：无需标准曲线，直接输出拷贝数，适用于病原体载量监测（如HIV病毒载量）；（2）高灵敏度：可检测单拷贝模板，用于癌症早期液态活检（如ctDNA突变）；（3）抗干扰能力强：微滴分隔减少抑制物影响，适合复杂样本（如血液、组织）；（4）精准定量：不受扩增效率影响（qPCR依赖扩增效率一致性），结果重复性高。四、案例分析题（10分）某实验室使用qPCR检测患者痰液中的结核分枝杆菌（MTB），实验步骤如下：①痰液样本经NaOH消化处理后，用柱式试剂盒提取DNA；②以提取的DNA为模板，加入MTB特异性引物（Tm=60℃）、SYBRGreenI染料、PCR反应液（含2mMMg²+、0.2mMdNTPs、1UTaq酶）；③扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；④熔解曲线分析：95℃15s，60℃1min，然后以0.5℃/s升温至95℃，连续采集荧光。结果显示：阳性对照（已知MTBDNA）的熔解曲线在82℃有单一峰，Ct=22；阴性对照（无模板）无荧光信号；但5份临床样本中，3份的熔解曲线在82℃有峰（Ct=30-35），2份无峰（Ct＞40）。问题：（1）如何解释临床样本Ct值（30-35）与阳性对照（Ct=22）的差异？（2）2份无峰样本可能的原因是什么？（3）若怀疑样本中存在PCR抑制物，可采取哪些验证方法？答案：（1）Ct值差异主要由初始模板量不同导致。阳性对照为已知高浓度MTBDNA，扩增时荧光信号早于阈值（Ct=22）；临床样本中MTB载量较低（可能为轻症或治疗后患者），需更多循环（Ct=30-35）才能达到荧光阈值。（2）2份无峰样本可能的原因：①样本中无MTB（真阴性）；②核酸提取失败（如痰液消化不彻底，DNA未释放）；③抑制物残留（