化学仪器分析小结

高效液相色谱分析法

一、高效液相色谱仪的结构与功能组成

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分别系统、检测系统和数据处理系统，下

面将分别叙述其各自的组成与特点。

1.进样系统

一般采纳隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品

的重复性是有益的。

2.输液系统

该系统包括高压泵、流淌相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为1.47~4.4X107Pa,

流速可调且稳定，当高压流淌相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在

柱中的移动速度，这对提高辨别率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流淌相

贮存错和梯度仪，口「使流淌相随固定相和样品的性质而变甲，包括变更洗脱液的极性、离子

强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的

差别或是同分异构体）都能获得有效分别。

3.分别系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10〜50cm（须要两根连用时，

可在二者之间加•连接管），内径为2〜5mm,由“优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料

制成，住内装有直径为5〜10用】1粒度的固定相（由基质和固定液构成）.固定相中的基质是

由机械强度高的树脂或硅狡构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多

孔性（孔径可达1000）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定

相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或

各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好

的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的

种糖蛋白分别出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到匀称、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度

小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高辨别率是有益的。依据柱

效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高辨

利率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度，缩短分析时间，

就可增加层析柱的效率。

4.检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有汲取性能样品的检测。其特点：运用面广（如蛋白

质、核酸、氨基酸、核苜酸、多肽、激素等均可运用）；灵敏度高（检测卜限为

线性范围宽；对温度和流速变更不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流淌相折光率不同的样品组分，均可运用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物

的检测大多运用此检测系统。这一系统通用性强、操作简洁，但灵敏度低（检测下限为

10-7g/ml）,流淌相的变更会引起折光率的变更，因此，它既不适用于痕量分析•，也不适用

于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在肯定条件下，其放射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一

检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烧、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质

等）的测定，其灵敏度很高•（检测下限为10-12〜10-14g/ml）,痕量分析和梯度洗脱作品的检

测均可采纳。

（5）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分别、制备或鉴

定工作能正确开展。

二、液相色谱柱的正确安装和运用说明

液相色谱仪由岛・压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装

和运用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确牢靠的试验数据的必经之路。

（-）液相色谱柱的安装：

1、液相色谱柱的结构：

a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

柱接头采纳低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端

是3/16英寸的内螺纹（国内外已规范化）。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管（①6.35mm）连接，

中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸（①1.57mm）的连接管连接，中间也放

置压环用于柱接头的密封，为了尽量削减柱外死体积，在安装色谱柱时，用中1.57mm连接

管通过空心螺钉压环后要尽量插究竟，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧

箍在连接管上（连接管通过压环后露出的管长度应严格限制在2.5mm长或其他固定尺寸）。

在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片（或滤网），用于封堵柱填料不被流淌

相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316“不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯

化物的溶剂对其有肯定的腐蚀性，故运用时要留意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，

以避开腐蚀。

b、柱填料：

液相色谱柱的分别作用是在填料与流淌相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而

定。

正相柱：多以硅胶为柱填料。依据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10即1

的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合一CN,-NH?等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：主要是以硅狡为基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非极性填料。也

有无定型和球型方分。

常用的其他的反相填料还有键合金、G、C,、苯基等，其颗粒粒径在3—10内n之间，

2,色谱柱的安装：

a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。

b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。

c、按柱管上标示的流淌相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接（如

条件允许，建议在柱前运用爱护柱）；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57皿、内

径为0.1-0.3nmi的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时肯定要设

法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插究竟，然后顺时针拧紧空心螺

钉，直到拧不动为止，再用扳手接着顺时针拧1/4T/2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通

过流淌相加压后有漏液现象，请用扳手接着顺时针拧1/4圈，直至不漏液为止。

（-）液相色谱柱的运用：

色谱柱在运用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变

更的参考。但要留意：柱性能可能由于所运用的样品、流淌相、柱温等条件的差异而有所不

同；另外，在做柱性能测试时是依据色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所运用的条件

是最佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。

1、样品的前处理：

a、最好运用流淌相溶解样品。

b、运用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不行逆吸附的杂质。

c、运用0.45阿1的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流淌相的配制：

液相色谱是样品组分在柱填料与流淌相之间质量交换而达到分别的目的，因此要求流淌

相具备以下的特点：

a、流淌相对样品具有肯定的溶解实力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在

柱中）。

b、流淌相具有肯定惰性，与样品不产生化学反应（特殊状况除外）。

c、流淌相的黏度要尽量小，以便在运用较长的分析柱时能得到好的分别效果；同时降

低柱压降，延长液体泵的运用寿命（可运用提高温度的方法降低流淌相的黏度）。

d、流淌相的物化性质要与运用的检测器相适应。如运用UV检测器，最好运用对紫外汲

取较低的溶剂配制。

。、流淌相沸点不要太低，否则简洁产牛气泡,导致试验无法进行c

f、在流淌相配制好后，肯定要进行脱气。除去溶解在流淌相中的微量气体既有利于检

测，还可以防止流淌相中的微量氧与样品发生作用。

3、流淌相流速的选拦：

因柱效是柱中流淌相线性流速的函数，运用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特

定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好运用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一•般选

择lml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为住“

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采纳变更流淌相的洗涤强度的方法以缩短分

析时间（如运用反相柱时，可适当增加甲醇或乙懵的含量）。

三、高效液相色谱仪操作步骤：

1.过滤流淌相，依据须要选择不同的滤膜.

2.对抽滤后的流淌相进行超声脱气10-20分钟。

3.打开hplc工作站（包括il算机软件和色谱仪），连接好流泄相管道，连接检测系统。

4.进入hplc限制界面主菜单，点击manual,进入手动菜单。

5.有一段时间没用，或者换了新的流淌相，须要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，干脆在泵的

出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，须要在manual菜单下，先点击purge,再点击slan,冲

洗时速度不要超过10ml/min。

6.调整流量，初次运用新的流淌相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要

超过20（）0。点击injure,选用合适的流速，点击on,走基线，视察基线的状况。

7.设计走样方法。点击file,选取se-lectusersandmethods,可以选取现有的各种走样方法。

若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取须要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，

依据须要而不同。选完后，点击protocol。•个完整的走样方法须要包括：a.进样前的稳流,

一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不

同。

8.进样和进样后操作。选定走样方法，点击Siam。进样，全部的样品均需过滤。方法走完

后，点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线,

洗掉剩余物。

9.关机时，先关计算机，再关液相色谱。

10.填写登记本，由负责人签字。

II.留意事项：

I）流淌相均需色谱纯度,水用20m的夫离子水.脱气后的流淌相要当心振动尽量不引起气

泡。

2）柱子是特别脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3）全部过柱子的液体均需严格的过滤。

4）压力不能太大，最好不要超过2000psi。

四、毛细管电泳仪的运用

（-）打算工作

I.毛细管的制备：

①剪略长尸须要长度的毛细管（运用专用的裁剪纱布），断端利用镒子当心移除。

②烧窗：从毛细管进液端起先到试验者须要长度的位置烧窗，窗口尽量小，过程中可

用防护工具对窗口两端的毛细管进行防护，烧好的窗需用粘有酒精的棉花擦拭。

注：检测的有效长度为从毛细管进液端到检测窗之间的距离，这个距离一般依据试验者

的须耍自口驾驭。

③取出卡槽：打开安放卡槽区域的门，旋转固定卡槽的杠杆90度，按卡槽中心的释放

按钮，握住卡槽的两端向上抽出卡槽。

④安装毛细管：将进液端的毛细管当心的从k槽的出口插入，进入时可轻轻旋转。当

窗口到达检测点时停止插入，将游离的进液端毛细管从卡槽的入口引出，并固定好毛细管外

端的橡胶管。

注：插入毛细管时当心操作，窗口位置的毛细管特别简洁裂开，需特别谨慎，过程中切

忌运用暴力。

⑤安放卡槽：用与取出的步骤相反依次的操作安放卡槽。

2.添加样品，缓冲液及冲洗液：

①为了削减样品及缓冲液的挥发，在插入加液管前可在加样管固定器的小孔内加入少

量的ddH20o

②已添加好的加液管，在插入转盘上的固定槽前先离心2min,加液时留意加样枪头紧贴

管壁，防止气泡的产生。

③为了削减虹吸作用,须要保持入口处和出口处的runningbuffer量一样,对于500ul

体积的加液管，举荐加入500ul的剂量：对1.5ml体积的加液管，举荐1.3向的剂量。

④举荐加入样品的最小剂量为50ul,检测须要的最小剂量为15ul。

⑤在出口处的waste管中加入503的ddH20,可以防止检测端的毛细管被冲洗液的残

留污染.

（二）电泳仪的操作

1.插上电源，检查电泳仪的连接状况，检查制冷区小槽内水量是否足够，打开电脑，

打开电泳仪的开关（两扇门都须要关闭），在电脑桌面点开BioFocus的图标，进入到BioFocus

的限制界面。

2.设置程序：

①点击Reagents键，在已有的ReagentsDataBase中查看是否含有须要运用的配液，

有可点击该配液查看，或运用edit键进行修改；没有则点击add进行编辑添加。添加之后留

意命名名称的唯一性。

②点击Cartridges键,对卡槽的相关参数进行查看，修改。如CartridgesDataBase中

没有和试验要求匹配的配置参数则点击Add进行添加。留意须要激活相应的或者设置的卡

槽。

⑤点击Configuraliuns—>Dcfinc;添加须耍的信息:cunfiguialiunID;Configuration

description;selectthecartridge—>Continuc:Regent双击左卜角regentdatabase中须要选择的

regent;双击屏幕右边你须要放置该regent的InletCarouselPosition—>Sample:命名，同样的

方式从左下角的Reagents中添加到右侧相应的位置上->点击empty，然后点击须要删除的

Regent;点击clear,清除全部设置的Regenl摆放次序->OK。

注：在以上几步中，记得同时设置好中止的清洗程序，及Shutdown程序，ddH2O清

洗5分钟，氮气吹干。

④点击Methods:选择设置好的程序—Define:填写MethodID,Description—>Inlet

Regent,选择电泳中须要的Runningbuffer—>OutletRegent,选择电泳中须要的Running

buffersVoltageMode填写须要的电压，电流，正负极，设定电泳时毛细管须要的温度，以

及电泳时间一Add:添加在电泳前后须要灌注的洗液等，填写灌注的时间一Injection:选择电

压或者气压的进液方式；前者需选择恒压或者恒流，以及进液时间的长短；后者需选择压力

*时间的进液常数iDetector:DelectorParameters:设置波长，时间，通道，AU范围；Display

parameters:设置波长，AU范围，偏移;Oplions:设置RiseTime,Turnofflampatrunend；

Designation:该设者存储的位置-OK

⑤点击AutoSeqs:选择须要的程序一Define查看，编辑须要调整的程序，如States显

示Conflict则须要对相应的设置进行调整，知道状态显示Pending—>Pending,Ready

—>0K—>Start

(三)停止,存储，杳看文件

①等待全部的程序完成后(包括运行程序及情节程序)，要停止运行的程序，则可点击

屏幕左上角的Slop键选择须要中止运行的某一步(AbcrlCurrentRunOnly),某一组(Aborl

CurrentRunGroup)或全部编辑的程序(AbortAutomationSequence)—>0K—+存储在指定盘上

(Yes),自定义盘(NO)->须要取出加液管及转盘(YES),不须要(NO)

注：在全部的对话框消逝之前，以及转盘没有回到初始位置之前，不能打开电泳仪的门。

(四)操作要点：

1.将毛细管电泳仪放置于有空调的房间，保持室温恒定。同时，操作中限制毛细管及

仪器恒温。

2.缓冲液加压一段时间后，淌度和电渗流会变更，要常常更换。

3.缓冲液要用0.45mm微孔滤膜过滤后运用。

4.对未涂渍的毛细管柱每天运用前先用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水及运行缓冲液各冲

洗lOiuin平衡后运用。更换缓冲液时，耍用水冲洗3inin后，再用缓冲液冲洗10小山平衡后进

样。

5.样品宜溶于稀释5~1()倍的运行缓冲液中，以获得好的峰形。

6.为提高定量精确性，宜加入一内标。在保证峰形的前提下，样品宜用高浓度，进样

时间应大于5psixsec。

7.摸索试验条件时，可先用一短柱，用磷酸盐、硼砂或Tris在不同的pH值条件下试验，

当选定缓冲液种类时，可先变更pH值获得最佳分别，再变更浓度以获得较好的峰形及柱效。

为使分析高效、快速，电压一般可用18~20kv。

8.每次作完试验后，用水冲洗5min,可将毛细管两端置于水中保存，也可用氮气吹干后

保存。

气相色谱分析法

一、气相色谱的主要组成和其工作原理

气相色谱是对气体物质或可以在肯定温度下转化为气体的物质进行检测分析。由于物质

的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的女排系数不同，当汽化后的试样被载

气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次安排，由于固定相对各组份的

吸附或溶解实力不同，虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过肯

定时间的流淌后，便彼此分别，按依次离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记

录器卜描绘出各绢份的色谱峰C

主要组成：气相色谱种类许多，性能也各有差别。主要包括两个系统。即气路系统和电

路系统。气路系统主要有玉力表、净化器、稳压阀、稳流阀、转子流量计、六通进样阀、进

样器、色谱柱、检测器等；电子系统包括各用电部件的稳压电源、温控装置、放大线路、自

动进样和收集装置、数据处理机和记录仪等电子器件。

依据功能单元分有：

(1)载气系统。包括气源、气体净化、气体流速限制和测量。

(2)进样系统。包括进样器、汽化室一一将液体样品瞬间汽化为蒸气。

(3)色谱柱和柱温。包括恒温限制装置一一将多组分样品分别为单个。

(4)检测系统。包括检测器，控温装置。

(5)记录系统。包括放大器、记录仪、有的仪器还有数据处理装置，为便于精确快速检测，

GC-MS和GC-FTIR也是常用的联合检测组成。

二、气相色谱柱的安装

色谱柱的正确安装才能保证发挥其最佳的性能和延长运用寿命。

正确的安装请参考以下步骤：步骤1.检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等检查气体过

滤器和进样垫，保证协助气和检测器的用气畅通有效。假如以前做过较脏样品或活性较高的

化合物，须要将进样口的衬管清洗或更换。步骤2.将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色

谱柱两端要当心切平步骤3.将色谱柱连接于进样口上色谱柱在进样口中插入深度依据所

运用的GC仪器不同而定。正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常来说，

色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，当进样针穿过隔垫完全插入进样口后假如针尖与色

谱柱入口相差-2cm,这就是较为志向的状态。（详细的插入程度和方法参见所运用GC的随

机手册）避开用力弯曲挤压毛细管柱，并当心不要让标记牌等有锐利边缘的物品与毛维柱接

触摩擦，以防柱身断裂受损。将色谱柱正确插入进样口后，用手把连接螺母拧上，拧紧后（用

手拧不动了）用扳手再多拧"47/2圈，保证安装的密封程度。因为不紧密的安装，不仅会

引起装置的泄漏，而且有可能对色谱柱造成永久损坏。步骤4.接通载气当色谱柱与进样口

接好后，通载气，调整柱前压以得到合适的载气流速。柱前压设置为Psi15m25m30m

50m100m0.20mm10-1523-3018-3040-6080-1200.25mm8-1213-2215-2528-4555-90

0.32mm5-108-1510-2016-3032-600.53mm1-22-32-44-86-14（以上仅为建议的起

始设置，详细数值要依据实际的载气流速。）将色谱柱的出口端插入装有己烷的样品瓶中，

正常状况下，我们可以望见瓶中稳定持续的气泡。假如没有气泡，就要重新检查一下载气装

置和流量限制器等是否正确设置,并检杳一下整个气路有无泄漏“等全部问题解决后,将色

谱柱出口从瓶中取出，保证柱端口无溶剂残留，再进行下一步的安装。步骤5.将色谱柱连

接于检测器上其安装和所需留意的事项与色谱柱与进样口连接大致相同。假如在应用中系统

所运用的是ECD或NPI）等，则在老化色谱柱时，应当将柱子与检测器断开，这样检测相可能

会更快达到稳定。步骤6.确定载气流量，再对色谱柱的安装进行检查留意：假如不通入载

气就对色谱柱进行加热，会快速且永久性的损坏色谱柱。步骤7.色谱柱的老化色谱柱安装

和系统检漏工作完成后，就可以对色谱柱进行老化了。对色谱柱升至一恒定温度，通常为

其温度上限。特殊状况下，可加热至高于最高运用温度10-20℃左右，但是肯定不能超过色

谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后，记录并视察基线。初始阶段基

线应持续上升，在到达老化温度后5To分钟起先下降，并且会持续30-9（）分钟。当到达一个

固定的值后就会稳定下来，假如在2-3小时后基线仍无法稳定或在15-20分钟后仍无明显的下

降趋势，则有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的状况，应马上将柱温降到40C以下，

尽快的检直系统并解决相关的问题。假如还是接着的老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得

不到正常稳定的基线。一•般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长，而弱

极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而PLOT色谱柱的老化方法有各不相同.PLOT

柱的老化步骤:HLZPora系列250℃,8小时以上Molesieve（分子筛）300℃12小时

Alumina（氧化铝）2（）0℃8小时以上由于水在氧化铝和分子筛PLOT柱中的不行逆吸附，使得

这两种色谱柱简洁发生保留行为漂移。当柱子分别过含有高水分样品后，须要将色谱柱重

新老化，以除去固定相中吸附的水分。步骤8.设置确认载气流速对于毛细管色谱柱，我气

的种类首选高纯度氮气或氢气。载气的纯度最好大于99.995斩而其中的含氧量越少越好。

假如您运用的是毛细管色谱柱，则依照载气的平均线速度(cm/sec)，而不是利用载气流量

(ml/min)来对载气做出评价。因为柱效的计算采纳的是载气的平均线速度。举荐平均线速

度值：氮气：10T2cm/sec氢气：20-25cm/sec载气杂质过滤器在载气的管线中加入气体过

滤装置.不仅可以延长色谱柱寿命，而且很大程度的降低了背景噪音。建议最好安装一个高容

量脱氧管和一个载气净化器。运用ECD系统时，最好能在其协助气路中也安装一个脱氧管。

步骤9.柱流失检测在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验(不进样)。一

般是以lOC/min从50℃升至最高运用温度，达到最高运用温度后保持lOmin。这样我们就会

的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和试验问题的解决有帮助。在空白试验的

色谱图中，不应当有色谱峰出现。假如出现了色谱峰，通常可能是从进样口带来的污染物。

假如在正常的运用状态下，色谱柱的性能起先下降，基线的信号值会增高。另外，假如在很

低的温度下，基线信号值明显的大干初始值,则有可能是色谱样和GC系统有污染.其他：

色谱柱的保存用进样垫将色谱柱的两端封住，并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截

去一部分，保证没有进样垫的碎屑残留于柱中。留意：当空气中氢气的含量在4T0%时，就

有爆炸的危急。所以肯定要保证明验室有良好的通风系统。

三、气相色谱仪操作规程

1、色谱室应选在无腐蚀气体源的环境中，室内温度+5〜35℃范围内，环境湿度085%相对湿

度，室内应保持空气流通。

2、仪器室电源不应与大功率耗电最设备共用一条线路，接地和接零严格分开，三相进户单

相三线制供电。

3、色谱气源必需采纳高纯气体，严禁采纳任何塑料管道输气，进入仪器前要加具变色分子

筛的净化系统，对载气还应串接脱氧管，不同种可燃气体不能放置同一气源室内。

4、任何采纳钢瓶供气之气源，运用之最低气压不得＜1MP、必需刚好更换，换瓶时逆时针方

向松开减压器支头螺丝，顺时针关闭瓶头阀，拆下钢瓶减压器，换上同种满瓶气开启瓶头阀，

顺时针旋进支头螺丝至所需压力。必需特殊提示，在每次打开钢瓶瓶头阀时，首先必需检查

支头螺丝是否松开(逆时针旋转为松开)。只有在确认支头螺丝是松开的状态下方能打开瓶

头阀，否则钢瓶减压器在打开瓶头阀时，高压打在低压调整器上，一次即可把减压器击坏。

凡遇以上状况作责任事故处理。

5、运用TCD检测器时，应先开载气，并确认整个系统无泄漏状况下再把汽化室，柱室，检

测室温度升至所需值，然后开启桥路电流，关机时则先关桥路电流，再降温至60-C,最终

关闭载气。当运用氢做载气时，应用管道把放空气接至室外。

6、运用FID检测器时，开启载气，把检测器温度升至所需值，点火、然后把汽化室，柱箱

温度升到位，关机时先关闭氢气、空气熄火，然后降温至60C,停载气。

7、更换填充柱时，对填充柱干脆插入汽化室的仪器，应考虑留5CM试样汽化空间。当采

纳玻璃填充柱时，只能运用He.N.Ar做载气。填充柱运用前必需在低于固定液最高运用温度

20〜30C,载气流速5ml/min的条件下。老化8—16小时在基线无噪声时方可作样品分析

8、更换毛细管色谱柱时，当毛细管穿过石墨垫时头应向下，穿过以后用毛细管割刀切去2〜

3cm,应严格按仪器说明书规定插入汽化室，检测室之距离。用手旋上毛细管固定螺帽呈水

平状至紧，用小扳手顺时针旋转1/4圈，检查不漏气即可，千万不要扳的过紧。

9、分析样品瓶和进样注射器只能放置在250x160x35mm有盖的搪瓷盘中，严禁放在仪器顶

部或试验台上。

四、气相色谱常识

（一）气相色谱法有哪些特点？

气相色谱是色谱中的一种，就是用气体做为流淌相的色谱法，在分别分析方面，具有如下一

些特点：

1、灵敏度：可检出10"克的物质，可作超纯气体、高分子单体的痕迹量杂质分析和空气中

微量毒物的分析。

2、高选择性：可有效地分别性质极为相近的各种同分异构体和各种同位素°

3、高效能：可把组分困难的样品分别成单组分。

4、速度快：一般分析、只需几分钟即可完成，有利于指导和限制生产。

5、应用范围广：即可分析低含量的气、液体，亦可分析高含量的气、液体，可不受组分含

量的限制。

6、所需试样量少：一般气体样用几亳升，液体样用几微升或几十微升。

7、设备和操作比较简洁仪器价格便宜。

（二）气相色谱的分别原理为何？

气相色谱是一种物理的分别方法。利用被测物质各组分在不同两相间安排系数（溶解度）的

微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的安排，使原来只有微小

的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分别。

（三）何谓气相色谱？它分几类？

凡是以气相作为流淌相的色谱技术，通称为气相色谱。一般可按以下几方面分类:

1、按固定相聚集态分类：（1）气固色谱：固定相是固体吸附剂，（2）气液色谱：固定相

是涂在担体表面的液体。

2、按过程物理化学原理分类：（1）吸附色谱：利用固体吸附表面对不同组分物理吸附性能

的差异达到分别的色谱。（2）安排色谱：利用不同的组分在两相中有不同的安排系数以达到

分别的色谱。（3）其它：利用离子交换原理的离子交换色谱：利用胶体的电动效应建立的电

色谱•；利用温度变更发展而来的热色谱等等。

3、按固定相类型分类：11）柱色谱：固定相装于色谱柱内，填充柱、空心柱、毛细管柱

均属此类。（2）纸色谱：以滤纸为载体，（3）薄膜色谱：固定相为粉末压成的薄漠。

4、按动力学过程原理分类：可分为冲洗法，取代法及迎头法三种。

（四）气相色谱法简洁分析装置流程是什么？

气相色谱法简洁分析装置流程基本由四个部份组成：1、气源部分，2、进样装置，3、

色谱朴，4、鉴定器和记录器.

（五）气相色谱法的一些常用术语及基本概念说明？

1、相、固定相和流淌相：一个体系中的某一匀称部分称为相；在色谱分别过程中，固定不

动的一相称为固定相；通过或沿着固定相移动的流体称为流淌相。

2、色谱峰：物质通过色谱柱进到鉴定器后，记录器上出现的一个个曲线称为色谱。

3、基线：在色谱操作条件下，没有被测组分通过鉴定器时，记录器所记录的检测器噪声随

时间变更图线称为基线.

4、峰高与半峰宽：由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰

高，一般以h表示。色谱峰高一半处的宽为半峰宽，一股以xl/2表示。

5、峰面积：流出曲线（色谱峰）与基线构成之面积称峰面积，用A表示。

6、死时间、保留时间及校正保留时间：从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间，

以td表示。从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称保留时间，以tr表示。保留时间与死

时间之差称校正保留时间，以Vd表示。

7、死体积，保留体积与校正保留体积：死时间与载气平均流速的乘枳称为死体积，以Vd

表示，载气平均流速以Fc表示，Vd=tdxFc0保留时间与载气平均流速的乘积称保留体积,

以Vr表示，Vr=trxFco

8、保留值与相对保留值：保留值是表示试样中各组分在色谱柱中的停留时间的数值，通常

用时间或用将组分带精彩谱柱所需载气的体积来表示。以一种物质作为标准，而求出其他物

质的保留值对此标准物的比值，称为相对保留值。

9、器噪音：基线的不稳定程度称噪音。10、基流：氢焰色谱，在没有进样时，仪器本身存

在的基始电流（底电流），简称基流。

（六）•■般选择载气的依据是什么？气相色谱常用的载气有哪些？

作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；纯度高；价格便宜并易取得；能适合于所

用的检测器。常用的载气有氢气、氮气、氯气、氨气、二氧化碳气等等。

（七）载气为什么要净化？应如何净化？

所谓净化，就是除去载气中的一些有机物、微量氧，水分等杂质，以提高载气的纯度。不纯

净的气体作载气，可导致柱失效，样品变更，氢焰色谱可导致基流噪音增大，热导色谱可导

致鉴定器线性变劣等，所以载气必需经过净化。一般均采纳化学处理的方法除氧，如用活性

铜除氧；采纳分子筛、活性碳等吸附剂除有机杂质；采纳矽胶，分子筛等吸附剂除水分。

（A）试样的进样方法有哪些？

色谱分别要求在最短的时间内，以“案子”形式打进肯定量的试样，进样方法可分为：

1、气体试样：大致进样方法有四种：（1）注射器进样，（2）量管进样，（3）定体积进样,

（4）气体自动进样。一般常用注射器进样及气体自动进样。注射器进样的优点是运用敏捷,

方法简便，但进样量重复性较差。气体自动进样是用定量阀进样，重复性好，且可自动操作。

2、液体试样：一般用微量注射器进样，方法简便，进样快速。也可采纳定量自动进样，此

法进行重复性良好。

3、固体试样：通常用溶剂将试样溶解，然后采纳和液体进样同样方法进样。也有用固体进

样器进样的。

（九）简述在气相色谱分析中柱长、柱内径、柱温、载气流速、固定相、进样等操作条

件对分别的影响？

操作条件对于色谱分别有很大影响。

1、柱长，柱内径：一般讲，柱管增长，可改善分别实力，短则组分偏出的快些；柱内径小

分别效果好，柱内径大处理量大，但柱内径过大，将导致担体不能匀称地分布在色谱柱中。

分析用柱管一般内径为3—6亳米，柱长为1—4米。

2、柱温：是一个重要的操作变数，干脆影响分别效能和分析速度。选择柱温的依据是混合

物的沸点范围，固定液的配比和鉴定器的灵敏度。提高柱温可缩短分析时间；降低柱温可使

色谱柱选择性增大，有利于组分的分别和色谱柱稳定性提高，柱寿命延长。一般采纳等于或

高于数十度于样品的平均沸点的柱温为较合适，对易挥发样用低柱温，不易挥发的样品采纳

茴柱温。

3、载气流速：载气流速是确定色谱分别的重要缘由之一。一般讲流速高色谱峰狭，反之则

宽些，但流速过高或过低对分别都有不利的影响。流速要求要平稳，常用的流速范围每分钟

在10-100亳升之间。

4、固定相：固定相是由固体吸附剂或涂有固定液的担体构成。（1）固体吸附剂或担体粗

细：一般采纳40—6（）目、60—80目、80—100目。当用同等长度的柱子，颗粒细的分别效

率就要比粗的好些。（2）固定液含量：固定液含量对分别效率的影响很大，它与担体的重

量比一般用15%—25%。比例过大有损于分别，比例过小会使色谱峰拖尾。

5、进样：一般讲进样快，进样量小，进样温度高其分别效果好。对进液体样，速度要快,

汽化温度要高于样品中高沸点组分的沸点值，一次汽化，保证色谱峰形不致展宽、使柱效高。

当进样量在肯定限度时，色谱峰的半峰宽是不变的。若进样量过多就会造成色谱柱超载。一

般讲柱长增加四倍，样品的许可量增加一倍。对于常规分析，液体进样展为1-20微升；气

体进样量为0.1—5亳升。

（十）色谱柱管材料应依据什么原则选择？常用的柱管是由什么材质制成的？

对色谱柱管材质，应按如下要求选择：

1、应与固定相、试样、载气不起化学反应。

2、要易于加工成型。

3、管内壁应光滑，横截面应匀称呈圆形。一般色谱柱管形态呈U型或螺旋形，大多由铜、

不锈钢，玻璃等材质制成，

（十一）新的色谱柱管（铜或不锈钢管）应怎样处理后方能运用？

新柱管应先用稀酸或稀碱（1:1盐酸或氢氧化钠）洗涤，以除去油污等脏垢，而后用自来

水冲洗，继而用蒸储水冲洗至中性，再用干净的空气吹洗并烘干后，即可运用了。

（十二）什么叫担体？对担体有哪些要求？

担体是一种多孔性化学惰性固体，在气相色谱中用来支撑固定液。对担体有如下几点要求：

1、表面积较大，般应在0.5—2米/克之间：

2、具有化学惰性和热稳定性；

3、有肯定的机械强度，使涂渍和填充过程不引起粉碎；

4、有适当的孔隙结构，利于两相间快速传质；

5、能制成匀称的球状颗粒，利于气相渗透和填充匀称性好；

6、有很好的浸润性，便于固定液的匀称分布。完全满足上述要求的担体是困难的，人们在

实践中只能找由性能比较优良的担体o

（十三）担体分几类？其特点如何？

通常分为硅藻土和非硅藻土两大类，每一类又有种种小类。

1、硅藻土类型：（1）白色的：表面积小，疏松，质脆，吸附性能小，经适当处理，可分

析强极性组分；（2）红色的：有较大的表面积和较好的机械强度，但吸附性较大。

2、非硅藻土类型：（1）氟担体：表面惰性好，可用来分析高极性和腐蚀性物质，但装柱

不易，柱效率低些。（2）玻璃微球：表面积小，用它做担体柱温可以大大降低，而分别完

全且快速。但涂渍困难，柱效低。（3）多孔性高聚物小球：机械强度高，热稳定性好，吸

附性低，耐腐蚀，分别效率高，是一种性能优良的新型色谱固定相。（4）炭分子筛：中性,

表面积大，强度高，祛寿命长，在微量分析上有无比的优越性。（5）活性炭：可以单独做

为固定相。（6）沙：主要用于分别金属。

（十四）一般常用的担体有哪几种？各属哪类？

101担体：为白色硅藻土相体：102担体：为白色硅藻土担体：celite545：为白色硅藻土相

体；201担体：为红色硅藻土担体；6201担体：为红色硅藻土担体；C-22保温砖：为红色

硅藻上担体；chromosorb：为红色硅藻土担体。

（十五）运用担体为何要进行处理？一般处理的方法有哪些？

常用的担体表面并非惰性，它具有不同程度的催化作用和吸附性（特殊是固定液含量低时和

分别极性物质时）造成峰拖尾和柱效下降，保留值变更等影响，因而须要预处理。现招一般

处理方法简述如卜.：

1、酸洗法：用浓盐酸加热处理担体20—30分钟，然后用自来水冲洗至中性，再用甲醇漂

洗，烘干备用。此法主要除去担体表面的铁等无机物杂质。

2、碱洗法：用10%的氢氧化钠或5%的氢氧化钾一甲酥溶液浸泡或【可流担体，然后用水冲

洗至中性，再用甲醉漂洗，烘干备用。碱洗的目的是除去表面的三氧化二铝等酸性作用点，

但往往在表面上残留微量的游离碱，它能分解或吸附一些非碱性物质，运用时要留意。

3、硅烷化：用硅烷化试剂和担体表面的硅醉、硅醛基团起反应，除去表面的氢键结合实力，

可以改进担体的性能。常用的硅烷化试剂有二甲基二氯硅烷和六甲基二硅胺。

4、釉化：把欲处理的担沐在2~3%的碳酸钠一碳酸钾（1：1）水溶液中浸泡一天，烘干

后先在870度下燃烧3~5小时，然后升温到980度燃烧约40分钟。经过这样处理，担体表

面形成一层玻璃化的釉质，故称“釉化担体这种担体的吸附性能小，强度大，当固定液中

加入少量的去尾剂后，能分析如醉、酸等极性较强的物质。但对非极性物质柱效能则稍有下

降。此外甲呼和甲酸等物质在釉化担体上有肯定的不行逆化学吸附，化定量分析时应予以留

意。

5、其他纯化方法：凡是用化学反应来除去活性作用点或用物理复盖以达到纯化担体表面性

质的方法都可以运用。

（十六）常用的担体目数为多少？

常用的4—6毫米内径的色谱柱：对于较长色谱柱，选用担体目数一般为40—80E；对

于较短色谱柱选用担体目数一般为80-100目（每英寸内的筛孔数目为目）。

（十七）常用的担体怎样选择？

各种担体，名目繁多。在常用硅藻土担体中:红色担体（如6201、201）,可用于非极性或弱

极性物质的分别。白色担体（如101）可用于极性物质或碱性物质。釉化红色担.体（如301）

可用于中等极性物质。硅烷化白色担体可用于强极性氢键型物质如废水测定。分别酸性物质，

如酚类，要用酸洗处理的田体。分别碱性物质，如乙醇胺，要用碱洗处理的担体。微晶分析

要用硅烷化的相体。有些特殊的状况下要用特殊的担体,如氟相体分别异氨酸酯类。但是在

一般的常量分析中，对担体可以不必过份讲究，甚至如耐火碗粉粒，玻璃珠砂和海沙也可以

运用。

（十八）何谓固体固定相？大体可分为几类？

指干脆装填到色谱柱中作为固定相的具有活性的多孔性固体物质。固体固定相大体可分为三

类：第一类是吸附剂。如：分子筛、硅胶、活性炭、氧化铝等；其次类是高分子聚合物。如

国内的GDX型高分子多孔微球，国外Porapak系列等；三类是化学键合固定相。在气相色

谱中，通常是将固定液涂敷在载体表面上。采纳化学键合固定相分析极性或非极性物质通常

都能够得到对称峰，柱效很高，固定相的热稳定性也有所改善。

（十九）什么是固定液？对固定液有哪些要求？

一般是一种高沸点的有机物的液膜，通过对不同组份的不同分子间的作用，使组份在色谱

柱中得到分别。对气相色谱用的固定液，一般有如下几点要求：1、在操作温度下蒸气压低,

热稳定性好，与被分析物理或载气不产生不行逆反应；2、在操作温度下呈液态，而且粘度

愈低愈好。物质在高粘度的固定液中传质速度慢，柱效率因而降低。这确定固定液的最低运

用温度；3、能坚固地附着在载体上，并形成匀称和结构稳定的薄层；4、被分别的物质必

需在其中有肯定的溶解度，不然就会很快地被载气带走而不能在两相之间进行安排；5、对

沸点相近而类型不同的物质有分别实力，即保留一种类型化合物的实力大于另一种类型。这

种分别实力即是固定液的选择性。

（二十）固定液的选择原则畲哪些？

依据被分别组分和固定液分子间的相互作用关系，固定液的选择一般依据所谓的“相像性原

则”，即固定液的性质与被分别组分之间的某些相像性，如官能团、化学键、极性、某些化

学性质等，性质相像时，两种分子间的作用力就强，被分别组分在固定液中的溶解度就大，

安排系数大，因而保留时间就长；反之溶解度小，安排系数小，因而能很快流精彩谱柱。下

面就不同状况进行探讨：a、分别极性化合物，采纳极性固定液。这时样品各组分与固定液

分子间作用力主要是定向力和诱导力，各组分出峰次序按极性依次，极性小的先出峰，极性

越大，出峰越慢；b、分别非极性化合物，应用非极性固定液，样品各组分与固定液分子间

作用力是色散力，没有特殊选择性，这时各组分按沸点依次山峰，沸点低的先山峰。对于沸

点相近的异构物的分别，效率很低；c、分别非极性和极性化合物的混合物时，可用极性固

定液，这时非极性组分先诩出，固定液极性越强，非极性组分越易流出；d、对于能形成

氢键的样品。如醇、酚、胺和水的分别，一般选择极性或氢键型的固定液，这时依组分和固

定液分子间形成氨犍实力大小进行分别。”相像相容性原则”是选择固定液的一般原则，有时

利用现有的固定液不能达到满足的分别结果时，往往采纳“混合固定液”，应用两种或两种以

上性质各不相同的，按适合比例混合的固定液，使分别有比较满足的选择性，又不致使分析

时间延长。然而，在实际工作中选择固定液往往是参考受料或文献介绍的实例来选用固定液

的。

（二十一）混合固定液的处理方法有几种？

混合固定液的处理方法有三种：1、分别涂渍于担体后走混合；2、将固定液混合后再涂溃，

留意这时所用的固定液都应溶解在同一个溶剂里；3、分别涂渍，分别填装入按比例长短的

色谱柱，最终再将它们串接起来。上述三种处理方法，结果基本相同，但对于特殊的分别，

有些也会有差异。

（二十二）常用的固定液涂量为多少合适？

由于固定液含量对分别效率的影响很大。所以它与担体的重量比例，低比例为5%,一般用

15%—25%。液体比例再大，则被分析的样品在比较厚的液膜上有扩散现象，有损于分别；

液体比例太低时，则由于液膜太薄，担体表面上残余的吸附实力会显示出来，使色谱峰拖尾。

由于低比例能促进平衡的建立，可以用较高的载气流速，所以用低的液体比例，再加上少量

样品，能缩短分析时间。对硅藻土担体固定液含量可大些15-30%；由于嬴担体表面积较

小，所以最多只能10%;至于玻璃微球由于表面积特小，固定液含量便只能保持在025%

左右。

（二十二）配柱时常用的固定液溶剂有哪些？选用溶剂的原则是什么？

常用的溶剂有：甲醉、乙醉、乙醛、丙酮、正丁醉、正己烷、石油醛、苯、甲苯和氯仿等等。

选用的原则是：1、溶解性好，2、不与固定液起化学反应，3、沸点低，4、毒性小。

（二十四）配柱时在担体上涂渍固定液采纳的常规方法是什么？

一般配常用的色谱柱，大都采纳“常规”涂渍法，其简要操作为：取所需量的固定液，用适量

（能浸过担体）的溶剂溶解，将担体缓缓倒入其中，随到随搅，而后用红外灯照耀（或用水

浴蒸发）以赶走溶剂，则固定液就附着于担体上了。

（二十五）色谱柱的常用填充方法有哪些？

固定相填充的好坏，将干脆影响柱效率.通常多用泵抽填充法，即把色谱柱的一端塞上玻璃

棉，接真空泵，另一端接一漏斗，在抽吸下加入固定相，边装边敲打色谱柱，至固定相不再

进入为止。装好后，塞上玻璃棉。装柱要求要填充得匀称，紧密，切忌有空隙。

紫外分光光度法

一、基本概念

1分光光度法：测定被测物质在特定波特长或肯定波长范围内对光的汲取度，对物质进行定

性、定量分析的方法称为分光光度法。

2紫外光：波长在200〜400nm范围内的光称为紫外光。

3可见光：波长在400〜760nm范围内的光称为可见光。

4紫外-可■见汲取光谱：物质汲取紫外线和可见光区的电磁波而产生的汲取光谱称为紫外-可

见汲取光谱。

5紫外-可见分光光度法（UV）：利用紫外-可见汲取光谱进行定性和定量分析的方法，称为

紫外-可见分光光度法。紫外-可见分光光度法可用于药物的鉴别、检查和含量测定，是药品

检验中应用特别广泛的一类仪器分析方法。《中国药典》附录收教有紫外分光光度法。

二、基本原理及组成

1.基本原理

（1）紫外-可见光谱的性质：分子的价电子汲取了光的能量，由低能量的基态转变为高能量

的激发态的过程称为跃迁。被测物分子的价电子汲取紫外光或可见光，从低能级跃迁到高能

级，产生汲取光谱。

（2）紫外-可见分光光度法的分析步骤：供试品制成溶液，放入比色皿中，置于紫外-可见

分光光度计，绘得汲取图谱。

（3）定性依据：被测物的结构不同，具电子跃迁方式不同，则产生不同的汲取光谱。依据

图谱中的峰位（即最大汲取波长入max）、谷位（即最小汲取波长大min）、最大汲取波特长的

汲取系数（即El%lcn认max）、有无肩峰、特定波特长的汲取度比值等，可以对被测物进行

定性。

（4）定量依据-Lambert-Beer定律:A=-lgT=-lg（I/IO）=ECL

式中，A为供试液的汲取度；T为透光率；E为被测物的汲取系数；C