利奈唑胺注射液中有关物质的研究进展

利奈唑胺注射液中有关物质的研究进展摘要噁唑烷酮类抗菌药是一种治疗细菌感染的新型合成化学药物。利奈唑胺是噁唑烷酮类药物中第一个用于临床治疗革兰氏阳性球菌感染的抗菌药，于2007年在我国批准上市，目前主要剂型有注射剂和片剂。注射剂的生产成本高、质量要求比较严格例如无菌、无热原等甚至连注射用水都有要求，但其研制和生产过程复杂，极易引入杂质，所以对利奈唑胺注射液的有关物质研究显得尤为重要。因此本文针对利奈唑胺注射液的有关物质进行综述，分析其杂质来源及其降解产物以及检测方法，为该药物的应用提供依据。关键词：利奈唑胺注射液；有关物质；杂质

ResearchprogressofrelatedsubstancesinlinezolidinjectionAbstractOxazolidoneisanewsyntheticdrugforthetreatmentofbacterialinfection.Linezolidisthefirstoxazolidoneantibioticusedinclinicaltreatmentofgram-positivecoccalinfection.ItwasapprovedandmarketedinChinain2007.Currently,themaindosageformsareinjectionandtablet.Theinjectionhashighproductioncostandstrictqualityrequirements,suchasasepsis,nopyrogen,andevenwaterforinjection.However,thedevelopmentandproductionprocessoftheinjectionarecomplicatedandimpuritiesareeasilyintroduced,soitisparticularlyimportanttostudytherelatedsubstancesoflinezolidinjection.Therefore,thispapersummarizedtherelatedsubstancesoflinezolidinjection,analyzedthesourcesofimpurities,degradationproductsanddetectionmethods,andprovidedabasisfortheapplicationoflinezolidinjection.Keywords：Linezolidinjection；relatedsubstance；impurities

前言青霉素自1928年被发现以来,抗生素就成为临床上治疗疾病的“网红药品”。抗生素的种类繁多，从青霉素开始到现在已经有数不清的抗生素被批准上市，同时在各种客观因素和人为因素的作用下，药物的非合理利用情况增加例如过度滥用、长期使用、合并用药，不管是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌在临床上都发现许多新型的耐药菌。2006年，一篇药物科学的报道中[1]，一株在实验室保存了近80年的金黄色葡萄球菌对临床上现有的抗生素都敏感，而另一株金黄色葡萄球菌是从患者身上分离的，它几乎对90%的抗生素耐药，而这种耐药性在同一细菌内，呈现出对不同类的抗生素的多重耐药机制。据报道，全球每天约有4万名病人死亡，他们都是因为患上了感染性疾病，这样看来感染性疾病已经严重威胁到了人类的健康生存和持续发展，多重耐药菌的耐药问题已经成为人类高度重视的对象。传统的糖肽类药物，例如万古霉素就具有潜在的毒副作用，而且最近出现了对万古霉素具有耐药性的金黄色葡萄球菌[2]。Moise—BroderPA证实了万古霉素治疗甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染失败率与最低抑菌浓度（MIC）值有着密切联系,当MIC为0.5ug/mL时，治疗失败率为48％；当MIC值为2ug/mL时，治疗失败率甚至达到92%，MRSA对万古霉素MIC越高，治疗感染失败率越高。而最近几年，万古霉素的最低抑菌浓度值逐年上升，利奈唑胺作为一种全新型的药物替代了糖肽类药物来治疗日益蔓延的MRSA[3]。人类近30年研发出来的新型抗菌药--噁唑烷酮类抗菌药，它具有抑制耐药菌革兰阳性菌的功效[3]。以前的抗菌药物都没有通过阻止70S起始复合物的形成来抑制细菌蛋白的合成，而作为全新噁唑烷酮类合成抗菌药的代表利奈唑胺是通过与核蛋白体50S亚基单位上与30S亚基的结合点，以阻断70S起始复合物的形成，即阻断细菌蛋白的合成所需的起始复合物的形式圆，从而发挥抗菌作用的[4]。利奈唑胺之所以体外不易诱导产生耐药性，也不易与其他抑制蛋白合成的抗菌药发生交叉耐药性是因为它拥有独特的作用靶点和方式[5]。利奈唑胺对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌等都有良好的抗菌活性[6]。由于注射液不如片剂稳定，在制备，生产，储存运输过程中引入杂质机会大，严重影响其稳定性、安全性、可靠性。在对利奈唑胺注射剂的研发制备中发现,药物的化学不稳定主要是因为放置时间过长和灭菌过程中发生了降解反应，使得药物发生变质，影响了药物的有效性安全性和稳定性。为此，需要对利奈唑胺注射液进行质量控制。由于此注射液上市时间较短，对其制剂的质量标准，国内外药典尚无收录[7-8]。因此对其进行有关物质的检测显得尤为重要。

1利奈唑胺注射液概述革兰氏阳性菌是临床上常见的致病菌之一，具有很强的耐药性，对甲氧西林具有耐药性的葡萄球菌和对多肽类具有耐药性的肠球菌等所占比例也在逐年增加。例如肠球菌属屎肠菌，对临床上经常用到的抗菌药如糖肽类抗生素具有耐药性，感染性疾病的防治和治疗正面临严峻的挑战。利奈唑胺的临床使用是抗感染治疗的一项重大进展。1.1基本信息利奈唑胺的化学名称：（S）-N[[3-[3-氟-4-（4-吗啉基）苯基]-2-氧代-5-噁唑烷基]甲基]-乙酰胺。分子式：C16H20FN3O4.结构见图1图1利奈唑胺的分子结构1.2临床应用治疗耐革兰氏阳性菌引起的感染：杜玉明[9]总结出利奈唑胺治疗重症患者中因革兰氏阳性菌而感染肺部和严重的手术伤口的治愈率有80%其中完全治疗因MRSA引起的感染；治疗对万古霉素具有耐药性的屎肠球菌的恢复率为83%；皮肤软组织感染金黄色葡萄球菌的治愈率是100%的。适用于肾功能和肝功能不好的老年人和肝肾功能发育不全的儿童：杨宏军报道[10]治疗老年人因肠球菌，MRSA等革兰氏阳性菌引起的感染有效，就是当长期使用时会发生血小板减少，需要检测血小板变化。卢荣枝[11]分析，对婴幼儿、新生儿感染的革兰氏阳性菌疗效很好，但是因为婴幼儿凝血功能差，还是得慎用。1.3研究意义利奈唑胺作为近几年开发的新型的抗生素，有新的作用机制，新的化学结构，被广泛用于各种严重感染和耐药菌株感染疾病的治疗，对耐药菌株产生良好的疗效。其制备工艺等也都在不断优化，使得人们对生产，储藏，运输过程中的杂质尤为关注。人们试图把有关物质中产生的降解条件，检测方法等解释清楚，为利奈唑胺注射液更好，更安全的使用提供依据。1.4利奈唑胺注射液的工艺路线1.用利奈唑胺作为材料,使用强碱性的氢氧化锂选择性的使利奈唑胺的酰胺键和酯键与水发生反应，得注射液中的彻底水解杂质(2R)-1-氨基-3-[[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]氨基]-2-丙醇(4)和不完全水解产物N-[(2S)-3-[[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]氨基]-2-羟基丙基]-乙酰胺(2)；以化合物(4)作原料，用叔丁氧羰基（Boc）保护末端氨基后乙酰化，再脱去Boc保护基，得到化合物3，合成路线如Scheme2所示[12]。Scheme1Scheme22.当以吗啉和3,4－二氟硝基苯为起始材料料，缩合、还原、酰化、碱性水解、甲磺酰化、叠氮基取代、还原和乙酰化一系列反应得到利奈唑胺，该法用到铁粉/氢气还原硝基，以及剧毒试剂光气，且路线较长，收率不高[13]。2有关物质2.1有关物质的定义及其验证内容有关物质是指在生产过程中带入的中间体，起始原料，副反应产物，聚合体以及储存过程中的降解产物。药物中允许有低毒或限制有些无害的共存物，而且严格控制有毒杂质。杂质的分类如下表按理化性质分类有机杂质降解杂质、异构体反应原料和试剂中混入杂质工艺杂质（合成过程中没有完全的反应反应物、副产物）残留溶剂制剂生产过程中使用的溶剂和降解产生的溶剂无机杂质反应试剂、无机盐、残留的金属等这类杂质的化学结构通常与活性成分有关，故又称之为有关物质[14]。验证内容精密度中间精密度重复性准确度专属性检测线定量限线性范围耐用性定量+++++++++限度----++--+2.2主要降解产物药物制剂的基本要求应该是安全，有效，但利奈唑胺注射剂容易发生分解变质，不仅会使疗效降低，甚至产生毒副作用。文献报道该注射剂的降解杂质主要有以下4种[15-16]。杂质结构对应的化学结构名称(2S)-1-氨基-3-{［3-氟-4-(4-吗啉基)苯基］氨基}-2-丙醇(5S)-5-(氨甲基)-3-［3-氟-4-(4-吗啉基)苯基］-2-噁唑烷酮(Ⅲ)N-{(2R)-3-{［3-氟-4-(4-吗啉基)苯基］氨基}-2-羟基丙基}乙酰胺S-环氧氯丙烷2.3产生降解的条件利奈唑胺对高温、光照比较稳定，在强酸、强碱、氧化、加热水解条件下，均有不同程度的降解；对杂质的降解机制分析；利奈唑胺的降解发生在3个位点：噁唑烷酮开环水解、侧链甲酰基断裂、吗啉环上的N原子发生氧化[16]。3检测方法检测有关物质的主要方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。薄层色谱法通用于对所考虑的物质进行定性或半定量研究，适合于没有紫外吸收的有关物质[17]；气相色谱法可以通过不同的色谱柱，流速和柱温得到很好的分离；高效液相色谱法适用于多种有关物质，可进行有关物质的定性或定量研究，适用于多种物质。利奈唑胺还可用紫外分光光度法进行检测。3.1气相色谱-质谱联用法利奈唑胺原料药中具有遗传毒性的杂质S-环氧氯丙烷，由于其在反应过程中是过量存在的，随着反应的进行杂质可能存在于最后的成品中[18]。根据S-环氧氯丙烷丙烷的结构沸点等特点使用色谱柱:AgilentVF-624ms毛细管柱(30m×0.25mm×1.4μm);柱温:程序升温，起始温度70℃，然后用30℃·min－1的升温速率升至260℃，维持2min;进样口温度200℃;柱流量:1.0ml·min－1;分流比为5:1，检测器是质谱检测器，载气是高纯度的氦气，考察起始温度在120℃等度和50℃、70℃的梯度升温程序下的出峰情况。此方法的准确度，精密度，灵敏度，专属性等均符合要求[19]。3.2高效液相色谱法高效液相色谱法作为一个完善的分析方法，在许多药典中都有应用。高效液相色谱法所需的灵敏度(0.1%或更低)及高度的自动化可以通过痕量水平测定，不但可以算出出有关物质的总量，还能够算出某种有关物质的含量，在有关物质检查中应用广泛[20]。当用HPLC对利奈唑胺原料药进行水解、强酸弱碱盐或强碱弱酸盐与水发生的碱水解、酸水解、氧化、强光破坏、高温，取破坏试验的样品进行分析，对主要的有机杂质进行鉴定[21]，广西的一家公司使用岛津的液相色谱仪Waters510，使用可变波长检测器进行扫描，用CDMC2色谱数据处理机(上海计算技术研究所，色谱柱Hichrom-C18([250×10mm流动相乙腈水溶液(40:60)，流速1.5ml/min，检测波长250nm，进行杂质初探[21]。吴继禹使用高效液相仪Waters600，pH3.6的乙酸盐缓冲液-乙腈流动相，可以看到利奈唑胺峰形良好，保留时间也比较良好，回收率也高，与紫外分光光度法比较HPLC法的RSD值大[8]。在参考国内外有关高效液相色谱法检测利奈唑胺的相关文献[22-25]后，选择254nm为样品检测波长。关于这个检测波长，已经通过实验证实，线扫描峰值很好，检测线满足要求，对杂质的峰值没有干扰，定量也限符合要求。3.3紫外分光光度法紫外分光光度法是一种定量、定性和结构的分析方法，它是根据物质分子在200-760nm波长范围内通过电磁波的吸收特性而建立起来的。不同人员在不同条件下测得的结果相近或一致、容易操作、准确度高。胡卢峰等人对利奈唑胺使用756MC紫外分光光度计（上海第三仪器分析厂），2487紫外可见检测器，用纯化水做空白实验，在200nm-400nm处进行扫描，在250nm处发现最大吸收峰[26-27]，当不同浓度的贮备液在250nm处分别测定吸光度，以利奈唑胺（C）对吸光度[A]进行线性回归，回归方程为C=17.62A-0.658，r=0.9999（n=7），结果显示，在250nm处利奈唑胺浓度在4mg/L--16mg/L时与吸收度线性关系良好，与其他检测方法相比，紫外的精密度要好[8]。3.4荧光免疫层析法荧光免疫法是纳米微球包裹和时间分辨荧光预相增强结合的技术，通过免疫小鼠，采用杂交瘤技术制备高特异性的利奈唑胺单克隆抗体。该法最关键的部分是抗体，而能用于高效检测技术的抗体只有一株。利奈唑胺用此法进行检测时特异性好，与十几种有关药物没有交叉反应，灵敏度0.60ug·ml-1,精密度少于10%，回收率90%左右。该法较HPLC法相关性好，而且此方法具有准确定量，快速，实用性等优点。若将此方法用于临床，便捷，省时，对操作人员技术要求不高[28]。4展望目前，抗菌药物的滥用，使其细菌的耐药性问题日益严重。近年来，全球各地的耐革兰阳性球菌比例逐年增加，尤其是MRSA。由于器官功能低下和身体免疫缺陷，老年人和儿童极易感染MRSA，该菌种的特点是只对利奈唑胺，万古霉素等少数药物敏感而对大多数抗生素都具有耐药性。使得利奈唑胺的存在显得尤为重要。当利奈唑胺与其他抗生素例达托霉素相较，在中枢，骨，肺中的转移性好，且与治疗革兰阳性菌的其他药物不产生交叉耐药。刘学东等人对某院近5年MRSA研究表明[29]，利奈唑胺与替考拉宁和万古霉素相较，最低抑菌浓度基本保持在较低水平，是一个很好的替代治疗药物。此药在上市后，药物的使用人数急剧增加，一些患者由于与自身相关的原因，服药剂量不当，出现了骨髓中的造血干细胞和各种前体细胞的活性下降，血液中的乳酸堆积，脊髓神经和脑神经突发疾病等。利奈唑胺在一期实验研究中，低剂量10-30mg·kg-1·d-1时，主要对红细胞作用，对血小板影响较小；当剂量超过900mg·kg-1·d-1，显示出了剂量依赖性可逆骨髓抑制作用。利奈唑胺作为上市不久的新药，许多不良反应只是推测，需要对其进行深入研究。总之研究的最终目的都是让该药更安全有效的服务于人类。为此，临床医生，科研工作者们立足自身岗位，互相沟通交流，从制备开始，着眼于每一个细节，通力合作，试图把利奈唑胺的不良反应降到最低，检验内容尽量详尽，为利奈唑胺在临床上的广泛使用提供依据。医生要结合患者的自身情况，制定不同类型个体合理的治疗方案。5结论自打青霉素问世以来，又有很多抗生素陆陆续续被研发出来，成为治疗感染性疾病的常用药物，对人类疾病的治疗和预防起着非常重要的作用。由于抗生素在使用过程中，细菌与药物多次接触，对药物产生了耐药性的，迫使人们不断研发新型抗菌药，利奈唑胺作为抗感染药物的新星虽在国内上市时间不长，但由于其独特的药理作用及相对较好的耐受性，其广泛应用于临床。根据我国药品注册的有关技术要求，R-利奈唑胺要作为有关物质予以检查和控制[30]药物研发和质量控制的一个重要组成部分是对相关物质的研究，即药物的整个研究、生产、储存的过程。药品中的有关物质,直接关系到药品的安全性、可控性。研究人员仍然集中向发展精确地检测方法而努力。高效液相色谱法在有关物质分析中仍占主要位置[31]。对药品进行一系列的研究检测，无非就是能够安全用药，利奈唑胺注射液虽然广泛用于临床，但其药品在生产加工、运输贮存过程中,还是应尽量避免强酸、强碱、氧化和高温高湿因素的影响,避免降解杂质的产生,以保证药品的使用安全。

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