亲和分离技术课件

亲和分离技术1 生物亲和作用

由于不是整个分子或物质参与亲和结合，亲和作用的分子(物质)对可以是：大分子-小分子例，大分子-大分子例，大分子-细胞例，细胞-细胞例。亲和作用的作用力

具有“钥匙和锁孔”的关系是产生亲和结合作用的必要条件，但并不充分。除此之外，还需要分子或原子水平的各种相互作用2 亲和作用的影响因素

1)．离子强度 如Affinity主要源于静电引力或氢键，则提高I无疑会减弱或完全破坏Affinity。

疏水性作用随I提高而增大,因此，当Affinity作用主要源于疏水性相互作用时，增大I则可提高Affinity。

许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱，说明静电引力在Affinity中占有重要地位。2)．pH

在亲和分离操作中,溶液pH值的选择是非常重要的.3).抑制氢键形成的物质 脲和盐酸胍的存在可抑制氢键配基配体

的形成.因此,如果Affinity中存在氢键,则加入脲或盐酸胍可减弱Affinity。但他们为强烈变性剂。4)．温度T T

使分子和原子的热运动

，结合中心的静电作用、氢键及金属配位键

，但可使疏水性作用

。5)．离液离子

SCN-，I-和ClO-4等半径较大的阴离子能降低疏水相互作用。故，则这此离子会降低Affinity。6).表面活性剂/乙二醇7)．鳌合剂

如果Affinity源于亲和分子对与金属离子形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸EDTA等鳌合剂除去金属离子，可使Affinity消失。结合中心3 一般操作

关键:?商品化的亲和吸附介质亚胺二乙酸4 亲和吸附介质Home-made亲和吸附介质Home-made所需材料1st

亲和配基2nd

载体Home-made基本方法 亲和配基+载体

=载体-亲和配基天然吸附介质

如植物凝集素与糖具有亲和结合作用，因此，天然琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶可直接用做外源凝集素的亲和吸附介质。 例如:1st

Sephadex凝胶是葡萄糖通过a-1.6结合与交联制备的葡萄糖凝胶,可亲和吸附伴刀豆球蛋白A(一种植物凝集素);2nd

Sepharose

凝胶中含有半乳糖,在Ca2+离子存在下可亲和吸附蛇毒凝集素.已介绍?5 亲和配基A蛋白(proteinAorA抗原)

分子量约42kD，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中，占细胞壁构成成分的约5%。

A蛋白与动物IgG具有很强的亲和结合作用，每个A蛋白含有5个Fc片段结合部位。除IgG外，还与人IgG和人IgA也具有亲和结合作用，但较弱。凝集素lectin

与糖特异性结合的蛋白质的总称(酶和抗体除外)，大部分凝集素为多聚体。如。常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA,conA)与葡萄糖和甘露糖的亲和结合作用较强,麦芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)与N-乙酰葡萄糖胺亲和结合作用较强。抗体

抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107~1012dm3/mol。因此，利用以单抗为配基的免疫和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子物质的有效手段。酶抑制剂 可与酶的活性部位结合,但结合后抑制酶的活性。如1st

大分子抑制剂：如胰蛋白酶有胰脏蛋白酶抑制剂PTI、卵粘蛋白(ovomucoid)和大豆胰蛋白酶抑制剂,STI)等,2nd

小分子抑制剂：如有苄脒、精氨酸和赖氨酸均可抑制胰蛋白酶的活性，并可作为亲和纯化胰蛋白酶的配基。5 亲和配基辅酶和磷酸腺苷

脱氢酶和激酶需要在辅酶co-enzyme的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有辅酶I(NAD)、辅酶II(NADP)和ATP等。此外，AMP,ADP的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢和激酶同样具有Affinity。三嗪类色素

三嗪类色素(triazinedyes)是一类分子内含有三嗪环的合成活性染料，与各种需要在NAD的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用。这类结合具有抑制酶活性的作用。 三嗪类色素还与白蛋白、INF、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和结合能力的.

CibacronBlue3GA(又称ReactiveBlue2)是最常用的活性色素过渡金属离子

Cu2+、Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可与N，S和O等供电子原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸(His)的咪唑基、半胱氨酸(Cys)的巯基和色氨酸(Trp)的吲哚基发生亲和作用，其中以His的咪唑基发生亲和作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+>Ni2+>Zn2+Co2+

。肝素heparin

是存在于哺乳动物脏器中的酸性多糖类物质，M为5-30kD，具有抗凝血作用。肝素与脂肪酶、甾体受体，限制性核酸内切酶、抗凝酶、凝血蛋白质等具有亲和作用.配基连接？6 配基连接溴化腈活化法固定配基：R-NH2应用：多糖凝胶的活化，适用于R-NH2型配基的修饰，如蛋白质配基IgG方法：反应在碳酸盐buffer下进行，注意：CNBr剧毒药品，且具有挥发性，上述操作南非在通橱中进行 至少二人在场

急救药品二价铁盐活化交连连接6 配基连接环氧基活化法

应用对象： 用于多糖凝胶和表面为氨基的载体的活化，固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH的配基。步骤：1st

活化2nd

直接固化法

反应速度很慢，所需固定化时间较长(24h以上)2nd

间接固定化法环氧氯丙烷

活性环氧基

直接固化

活化：间接固定EDC6 配基连接硅胶上连接活化

-氨丙基三甲氧基硅烷

环氧丙基三甲氧基硅烷

活性氨基

活性环氧基

在酸溶液中环氧基发生二醇化反应

配基连接6 配基连接金属配位

固定化HIS亚胺二乙酸iminodiaceticacid,IDA配基His性质独特:具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此HIS可与pro发生亲和合作用。在盐浓度较低的pH约等于目标pro的pI溶液中，固定化His亲和作用最强，随盐浓度

，亲和作用

。因此利用HIS为配基可分离pI相差较大的pro。

空间位阻6 配基连接间隔臂空间位阻：当较小的配基直接固定在载体下，会由于载体的空间位阴，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。办法：在配基与载体之间连接一个“间隔臂”(spacer)。

间隔臂长度有一定限制，当间隔臂含有6~8个亚甲基(-CH2-)时亲和力最大，亚甲基数超过8(长度>1.0nm)时，亲和力下降。7 亲和作用体系

高度特异性亲和体系 抗原与其单克隆抗体的结合基本上是一对一的关系，即该单克隆抗体不能与其他抗原结合。 群特异性亲和体系

外源凝素可与任何含有糖基的蛋白质结合。

8 亲和吸附吸附类型：Freundlich’styporLangmuirtype

矩形type8 亲和吸附吸附的影响因素1st

离子强度2nd

离子种类疏水性杂蛋白亲水性杂蛋白亲水性目标产物疏水性目标产物3rdpHValue4th

杂蛋白吸附-洗脱？9 亲和色谱洗脱可控制的条件1st

离子强度2ndpH3rd

抑制氢键形成的物质4th

温度5th

离液离子

SCN-，I-和ClO-6th

乙二醇、丙三醇7th

表面活性剂8th

鳌合剂

EDTA鳌合剂除金属离子９th

游离配基：如NAD,etal.按选择性高分类1st

非特异性洗脱(1-7)2nd

特异性洗脱(8-9)

优点：？缺点：？8 亲和色谱洗脱按洗脱方式分类1st

线性洗脱2ndstepwise洗脱(最常用）8 亲和色谱洗脱洗脱速度的控制

料液流速是影响柱效和分离速度的重要因素。提高流速虽可提高分离速度，但柱效降低，穿透曲线平缓，亲和色谱柱的有效利用率降低。因此，吸附操作要在适当的流速下进行，即要保证高速度，又要保证高效率。此外，琼脂糖凝胶等低强度载体容易受压变形，存在最大允许线速度。图示:在一定操压力以上，继续增大压力流速反而降低，并且最大允许线速度随柱径和柱高增大而降低。其它层析过程同样存在类似现象，在放大设计中须特别注意这一问题。

8 亲和色谱洗脱清洗:

目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一般使用与吸附操作相同的缓冲液，必要时加入表面活性剂，保证目标产物的吸附和杂质的除去。由于亲和吸附是可逆的，清洗过度会使目标产物的损失增多，特别是对于亲和结合较弱的亲和体系，而清洗不充分则使洗脱回收的目标产物纯度降低。因此，应利用分析方法，或实验观察，确定适宜的清洗操作时间。10 Applicationst-PA

组织纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种糖蛋白，具有激活纤溶酶原、促进血FD降解，治疗血栓等心脑血管疾病。t-PA主要存在于心脏组织中，但含量低，目前t-PA主要利用重组DNA动力细胞培养生产。赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和FD与t-PA具有affinity。

原料为猪心丙酮粉经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀、FD-Sepharose4B亲和层析和SephacylS-300凝胶过滤柱纯化后的活性部分。亲和吸附的t-PA用盐酸胍（GuHCl）为洗脱液梯度洗脱，回收斜线所示部分，t-PA的活性提高近7倍，收率为56%. 10 Applications干扰素(interferonIFN)

IFN对癌症、肝炎等疾病具有特殊疗效。根据一级结构差别，IFN分为α、β和γ三种，三嗪类色素对IFN具有亲和结合作用，故色素亲和层是纯化IFN的主要方法之一。固定化金属离子亲和层析也可用于IFN纯化。 图是利用单抗免疫亲和层析法纯化原于大肠杆菌的重组人白细胞干扰素(rhIFN-α)的操作条件和结果。以破碎细胞抽提液的硫酸铵沉淀活为原料，经一步单抗免疫亲和层析，rhIFN-α的比活提高了1150倍，收率达95%。10 Applications色素亲和层析 色素的特点是化学稳定性高、价格便宜、适用范围广、亲和结合力适中、蛋白质结合容量大。因此，操作成本低廉，有很高的实用价值。

图为纯化脱氢酶实例。加入3dm3菌体细胞抽提液后，用低浓度盐溶液A清洗，除去未被吸附的杂蛋白。之后，逐次用高浓度盐溶液B和辅酶I溶液C洗脱，分别获得了3-HDH和MDH活性峰。收集的3-HDH活性部分超滤浓缩至200cm3后透析脱盐，再加入到另一个色素亲和柱，继续进行纯化，结果示于下图。经过两步色素亲和层析纯化，3-HDH比活提高213倍(第一步34.4倍，第二步6.2倍)，最终收率为78%(第一步为99%)。10 Applications固定化金属离子亲和色谱 固定化金属离子亲和层析(IMAC)根据蛋白质表面与金属离子螯合的氨基酸残基(如咪唑基、巯基和吲哚基等)的含量和分布的差别分离纯化蛋白质，适用范围广，无毒副作用，吸附容量高。IMAC的洗脱操作通常采用提高离子强度或降低pH值的逐次或线性梯度洗脱法。当蛋白质的亲和吸附作用很强，一般的方法难于洗脱时，可利用EDTA等螯合剂，将蛋白质和金属离子一起洗脱下来。Cu-IDA-Seph-aroseCL-6B

IDA-Sepha-roseCL-6B

0.05mol/dm3Tris-HCl,0.15mol/dm3NaCl,pH7.5清洗

α-淀粉酶抑制剂抽提液

0.05mol/dm3Gly0.2mol/dm3Gly

10 Applications对应的色谱图10 Applications基因重组融合蛋白的纯化

基因重组