食用油中5种脂肪酸的同时定量分析

第1章绪论1.1引言随着社会经济的快速发展、人们生活水平的提高，食品安全已然成为公众关注的焦点议题。食用油作为膳食中的重要成分，它的质量安全直接影响到消费者的健康。在运输、贮存及使用环节中，油脂易受氧化、水解等化学反应诱导发生劣变，生成醛类、酮类、酸类等对人体有害的氧化产物。在这个过程中脂肪酸的含量可能会发生变化。通过考察食用油样品中脂肪酸含量的差异，有望更准确地鉴别食品的质量，规范食品标准。本文研究的脂肪酸主要有月桂酸、肉豆蔻是、棕榈酸、硬脂酸和二十二酸。1.2食用油概述食用油ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1-3]是人体生命活动重要的组成成分和能源物质之一，为人们提供必需脂肪酸、促进脂溶性维生素吸收。食用油主要是由甘油三酯（TAG）组成，并含有少量游离脂肪酸、磷脂、甾醇及脂溶性维生素等成分。根据原料来源，食用油可分为植物油、动物油及调和油等，不同油的脂肪酸组成差异显著，如椰子油中富含中链脂肪酸（如月桂酸、肉豆蔻酸等），而橄榄油中富含单不饱和脂肪酸。在加工、储存及烹饪过程中，油脂在光照、氧气、微生物作用下容易发生氧化、水解、缩合等反应，导致游离脂肪酸含量升高、过氧化值超标，并生成醛类、酮类等有害物。食用油变质不仅会导致营养价值降低，还会增加人们患心血管疾病、癌症等慢性病的风险，所以要建立一种高效、精准的油脂检测方法。脂肪酸甲酯化结合GC-MS分析是当前主流方法，但传统衍生化试剂存在毒性高、副反应多等问题。本研究采用的三甲基硅重氮甲烷（TMSD)由于其温和的反应条件和可控的衍生化进程，展现出显著优势。研究证实，GC-MS与HPLC技术可精准分析脂肪酸动态变化，通过FFA含量监测能有效鉴别油脂氧化程度及掺假行为。Wei团队ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2012</Year><RecNum>35</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>35</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743689501">35</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,Fang</author><author>Zhao,Qin</author><author>Lv,Xin</author><author>Dong,Xu-Yan</author><author>Feng,Yu-Qi</author><author>Chen,Hong</author></authors></contributors><titles><title>RapidMagneticSolid-PhaseExtractionBasedonMonodisperseMagneticSingle-CrystalFerriteNanoparticlesfortheDeterminationofFreeFattyAcidContentinEdibleOils</title><secondary-title>JournalofAgriculturalandFoodChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofAgriculturalandFoodChemistry</full-title></periodical><dates><year>2012</year><pub-dates><date>2012/12/20</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1021/jf303840q</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/jf303840q</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[4]采用硫酸-甲醇衍生化结合GC-MS技术，建立了一种高效灵敏的分析方法，成功实现4种食用油加速贮藏过程中游离脂肪酸（FFA）的动态监测，该方法灵敏度高，线性响应好，并发现新鲜油的特征在于低含量的游离脂肪酸，而在氧化过程中，储存时间越长，产生的游离脂肪酸含量越高。Cao课题组ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5]建立了6种单甘酯的GC-MS定量分析方法，具有良好的准确度、精密度和重现性。发现地沟油样品中的单甘酯标记物含量也异常高，可用于食用油降解状态的研究、食用油中掺入地沟油的商品油的鉴别、食用油中单甘酯标记物的检测以及筛选地沟油。1.3脂肪酸概述脂肪酸（FattyAcids，FAs）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6-8]是一类具有脂族链的天然羧酸化合物，广泛存在于生物体中，是脂质家族的核心成员。此类化合物主要以酯化形式参与甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）及磷脂的分子结构，亦可游离存在。从植物到动物源性食品，脂肪酸普遍分布于天然产物中。脂肪酸作为人体必需营养素，在维持基础生理功能和代谢调控中发挥双重作用。研究表明，必需脂肪酸不仅参与基础能量代谢，更通过调节心率、血压、凝血功能及生殖系统活性等关键生理过程维持机体稳态。月桂酸（C12:0）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[9,10]主要存在于椰子油和牛奶中，是对革兰氏阳性菌最具抑制作用的饱和脂肪酸之一。月桂酸广泛食品添加剂、制药工业方面。但富含月桂酸的油样可能导致血脂异常、心血管问题。肉豆蔻酸（C14:0）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Alonso-Castro</Author><Year>2021</Year><RecNum>38</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[11]</style></DisplayText><record><rec-number>38</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743689501">38</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Alonso-Castro,AngelJosabad</author><author>Serrano-Vega,Roberto</author><author>PérezGutiérrez,Salud</author><author>Isiordia-Espinoza,MarioAlberto</author><author>Solorio-Alvarado,CesarRogelio</author></authors></contributors><titles><title>Myristicacidreducesskininflammationandnociception</title><secondary-title>JournalofFoodBiochemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofFoodBiochemistry</full-title></periodical><dates><year>2021</year><pub-dates><date>2021/11/22</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1111/jfbc.14013</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1111/jfbc.14013</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[11]主要存在于椰子油和棕榈仁油中，具有体外抗炎活性。同时，它可以作为生产表面活性剂的原料，也用于消泡剂、增香剂。棕榈酸（C16:0）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Carta</Author><Year>2017</Year><RecNum>81</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[12]</style></DisplayText><record><rec-number>81</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743692835">81</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Carta,Gianfranca</author><author>Murru,Elisabetta</author><author>Banni,Sebastiano</author><author>Manca,Claudia</author></authors></contributors><titles><title>PalmiticAcid:PhysiologicalRole,MetabolismandNutritionalImplications</title><secondary-title>FrontiersinPhysiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>FrontiersinPhysiology</full-title></periodical><pages>227-230</pages><volume>267</volume><dates><year>2017</year><pub-dates><date>2017/11/24</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.3389/fphys.2017.00902</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.3389/fphys.2017.00902</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[12]可以由棕榈油或棕榈仁油中提取得到，在肉类、乳制品和可可脂中也含有大量的棕榈酸。它可以作为香料配料，也用于消泡剂、乳化剂。硬脂酸（C18:0）在自然界中广泛存在于动植物油脂中，可以发生脱氢反应，在进入人体后，转化成为油酸从而降低血液中胆固醇含量，有利于身体健康。它广泛用于化妆品、食品、药品和塑料等领域。二十二酸（C22:0）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2024</Year><RecNum>80</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[13]</style></DisplayText><record><rec-number>80</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743692835">80</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,Kerong</author><author>Gu,Ying</author><author>Pan,Xingnan</author><author>Chen,Sha</author><author>Cheng,Jie</author><author>Zhang,Le</author><author>Cao,Minkai</author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"size="100%">BehenicacidalleviatesinflammationandinsulinresistanceingestationaldiabetesmellitusbyregulatingTLR4/NF-</style><styleface="normal"font="default"charset="161"size="100%">κBsignalingpathway</style></title><secondary-title>iScience</secondary-title></titles><periodical><full-title>iScience</full-title></periodical><pages>1-16</pages><volume>27</volume><dates><year>2024</year><pub-dates><date>2024/09/24</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1016/j.isci.2024.111019</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.isci.2024.111019</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[13]可以在各种植物中找到。它具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤特性，已被证明是胰脂肪酶的天然抑制剂，可有效抑制肥胖的发展，广泛用于油漆、涂料和塑料等工业领域。1.5脂肪酸的分析研究进展脂肪酸因其具有低挥发性和高极性，在高温条件下易发生聚合、脱羧或裂解反应，制约其分析效能。食品中游离脂肪酸（FFA）含量通常处于痕量水平，其弱电离特性导致质谱检测灵敏度不足，难以实现精准定量。通过将脂肪酸转化为挥发性强、极性低的甲酯衍生物（FAME），可显著提升分离效率与检测灵敏度，实现对复杂食品体系中痕量脂肪酸的准确定性与定量分析。1.5.1气相色谱/气相色谱-质谱联用气相色谱-质谱联用（GC-MS）是脂肪酸分析的主要方法。。由于脂肪酸分子中含有羧基等极性基团，需通过甲酯化或硅烷化等衍生化反应转化为挥发性衍生物后方可进行GC分析。在气相色谱分析中，脂肪酸甲酯化主要通过硫酸（盐酸）-甲醇法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2012</Year><RecNum>35</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>35</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743689501">35</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,Fang</author><author>Zhao,Qin</author><author>Lv,Xin</author><author>Dong,Xu-Yan</author><author>Feng,Yu-Qi</author><author>Chen,Hong</author></authors></contributors><titles><title>RapidMagneticSolid-PhaseExtractionBasedonMonodisperseMagneticSingle-CrystalFerriteNanoparticlesfortheDeterminationofFreeFattyAcidContentinEdibleOils</title><secondary-title>JournalofAgriculturalandFoodChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofAgriculturalandFoodChemistry</full-title></periodical><dates><year>2012</year><pub-dates><date>2012/12/20</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1021/jf303840q</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/jf303840q</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[4]、氢氧化钠（四甲基氢氧化钠铵）-甲醇法ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[14-18]、三氟化硼-甲醇法ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[19-21]及重氮甲烷法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Antolín</Author><Year>2008</Year><RecNum>70</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[22]</style></DisplayText><record><rec-number>70</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743692835">70</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Antolín,ErnestoMéndez</author><author>Delange,DavidMarrero</author><author>Canavaciolo,VíctorGonzález</author></authors></contributors><titles><title>EvaluationoffivemethodsforderivatizationandGCdeterminationofamixtureofverylongchainfattyacids(C24:0-C36:0)</title><secondary-title>JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis</full-title></periodical><pages>194-199</pages><volume>46</volume><number>1</number><dates><year>2008</year><pub-dates><date>2008/01/07</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1016/j.jpba.2007.09.015</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.jpba.2007.09.015</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[22]等实现。然而，上述方法均存在反应副产物多、试剂毒性高或操作条件苛刻等缺陷。本研究采用三甲基硅重氮甲烷（TMSD）作为衍生化试剂，其作为重氮甲烷的安全替代品，兼具反应条件温和、副反应可控及环境友好性等优势，在有机合成与脂质分析领域展现出广阔应用前景。Simionato课题组ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Simionato</Author><Year>2010</Year><RecNum>11</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[16]</style></DisplayText><record><rec-number>11</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743688566">11</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Simionato,JullianaIsabelle</author><author>Garcia,JulianaCarla</author><author>Santos,GeraldoTadeudos</author><author>Oliveira,CláudioCelestino</author><author>Visentainer,JesuiVergilio</author><author>Souza,NilsonEveláziode</author></authors></contributors><titles><title>Validationofthedeterminationoffattyacidsinmilkbygaschromatography</title><secondary-title>JournaloftheBrazilianChemicalSociety</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournaloftheBrazilianChemicalSociety</full-title></periodical><dates><year>2010</year><pub-dates><date>2010/01/01</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1590/s0103-50532010000300018</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1590/s0103-50532010000300018</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[16]使用氯仿、甲醇和水（2：1：1）作为衍生化试剂结合GC-MS分析，该方法对牛奶样品的加标回收率良好，验证了方法的可靠性。因此，亚油酸等脂肪酸可以安全地用GC-FID进行分离和定量。温恺嘉课题组ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[23]建立了适用于蛋黄卵磷脂（供注射用）中棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸含量测定的分析方法，使用气相色谱外标法分析甲酯衍生物。样品通过三氟化硼-甲醇甲酯化,证实该方法适用于蛋黄卵磷脂中7种脂肪酸含量的测定。Hung等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Hung</Author><Year>2023</Year><RecNum>47</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[24]</style></DisplayText><record><rec-number>47</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743690667">47</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Hung,NguyenKhanh</author><author>Trang,NguyenPhuong</author><author>Du,NguyenHuy</author></authors></contributors><titles><title>Determinationofsaturatedfat,unsaturatedfat,andtransfatincommercialinstantnoodlesbasedontheanalysisoffattyacidcompositionbygaschromatography</title><secondary-title>VietnamJournalofChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>VietnamJournalofChemistry</full-title></periodical><dates><year>2023</year><pub-dates><date>2023/11/30</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1002/vjch.202300099</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1002/vjch.202300099</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[24]通过氢氧化钠-甲醇法甲酯化与GC-MS联用，系统分析了方便面中37种脂肪酸甲酯，发现样本中棕榈酸（饱和脂肪酸）占比最高，顺式单不饱和脂肪酸以油酸、亚油酸为主，反式脂肪酸及多不饱和脂肪酸含量极低。1.5.2液相色谱/液相色谱-质谱联用高效液相色谱（HPLC）技术通过反相/正相分离模式与衍生化反应联用，有效改善了检测灵敏度不足的问题。由于多数脂肪酸缺乏紫外吸收基团，常需进行衍生化反应，在脂肪酸分子中引入强紫外吸收基团或荧光标记试剂以增强检测信号。相较于GC，HPLC具有分离效率高、分析周期短及适用性广等优势。Ding团队ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Ding</Author><Year>2007</Year><RecNum>46</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[25]</style></DisplayText><record><rec-number>46</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743690667">46</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Ding,Yang-Jun</author><author>Zhao,Xian-En</author><author>Zhu,Fang</author><author>Suo,You-Rui</author><author>Li,Yu-Lin</author><author>Chen,Gui-Chen</author><author>You,Jin-Mao</author></authors></contributors><titles><title>IdentificationofLong-ChainUnsaturatedFattyAcidsinDeep-SeaFishOilbyLiquidChromatography/MassSpectrometry/AtmosphericPressureChemicalIonization</title><secondary-title>ChineseJournalofAnalyticalChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>ChineseJournalofAnalyticalChemistry</full-title></periodical><dates><year>2007</year><pub-dates><date>2007/03/01</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1016/s1872-2040(07)60041-3</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/s1872-2040(07)60041-3</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[25]采用HPLC/APCI-MS结合BDEBS衍生化技术，成功鉴定了深海鱼油中23种中长链不饱和脂肪酸，并实现了双键位置的精准定位，为多不饱和脂肪酸的结构解析提供了创新性技术方案。1.6课题研究目的与意义探索并优化脂肪酸的甲酯化反应条件，确保反应高效且稳定，提高定量准确性和重复性，减少样品和试剂用量，降低成本。建立一套基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术的脂肪酸甲酯定量分析方法，并将该方法应用于变质食用油的检测，确定脂肪酸变化与食用油变质程度的关系，应用该方法对市售食用油进行质量评估，鉴别是否存在变质现象。

第2章游离脂肪酸的绿色甲酯化研究2.1材料与方法2.1.1样品和试剂月桂酸（C12，化学纯）、甲酸（HPLC），国药化学试剂有限公司；肉豆蔻酸（C14:0，>99%）、棕榈酸（C16:0，>97%）、硬脂酸（C18:0，>98%）、二十二酸（C22:0，>99%），梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；三甲基硅重氮甲烷（正己烷溶液2mol/L）、三甲基氯硅烷（95%），上海安耐吉化学试剂有限公司；乙酸甲酯（AR,98%），阿拉丁试剂（上海）有限公司。图2-1化合物的结构式（A：月桂酸；B：肉豆蔻酸；C：棕榈酸；D：硬脂酸；E：二十二酸；F：三甲基硅重氮甲烷；G：三甲基氯硅烷）2.1.2样品制备与衍生化准确称取月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、二十二酸5种脂肪酸标准样品10mg，用乙酸甲酯溶剂稀释至10.0mL，制成质量浓度为1000µg/mL的混合贮备液，将配制好的混合标准溶液置于4℃冰箱中保存备用；将混合贮备液稀释至质量浓度为100µg/mL的溶液（溶剂为乙酸甲酯），进行甲酯化反应。取2mol/L的衍生化试剂三甲基硅重氮甲烷50µL和催化剂三甲基氯硅烷20µL，加入1mL混合标准脂肪酸溶液，在室温下磁力搅拌30min，加入20µL终止试剂甲酸，进气相色谱-质谱联用进行检测分析。图2-2游离脂肪酸与三甲基硅重氮甲烷的甲酯化反应2.1.3仪器条件使用Agilent7890A气相色谱系统与Agilent5975C单四极杆质谱检测器(Agilent，PaloAlto，CA，USA)联用进行仪器分析。使用HP-5毛细管柱(15mx0.25mm，0.25um膜厚，AgilentTechnologies)分离目标分析物。将样品等分试样(1µL)注入进样口，气相色谱入口温度设置为260℃，分流比为20:1。氦气(99.999%)作为载气，流速设置为1.0mL/min。柱温箱温度最初设置为60℃，以30℃/min的速率升至160℃，保持2min，以25℃/min的速率升至200℃，以5℃/min的速率升至220℃，最后以30℃/min的速率升至280℃。采用了全扫描模式质量扫描（扫描范围m/z：50-400）模式，质谱条件设置如下:电子电离(EI)能量为70eV，离子源温度为230℃，进样口温度为260℃。使用高纯度氦气(99.998%)为碰撞激活解离气体，流速设置为1mL/min。采集时间范围为3.5-14.9min。2.2结果与讨论2.2.1气相色谱-质谱联用分析如图2-3所示，为5种脂肪酸混合标准溶液经三甲基硅重氮甲烷甲酯衍生化后的气质联用分析总离子流图；通过观察总离子流图中色谱峰的EI质谱响应，确定图2-3中tR5.520min为月桂酸甲酯，tR6.890min为肉豆蔻酸甲酯，tR8.153min为棕榈酸甲酯，tR9.586min为硬脂酸甲酯，tR13.433min为二十二酸甲酯。图2-35种脂肪酸甲酯化气质联用分析总离子流图图2-4脂肪酸甲酯（A：月桂酸甲酯；B：肉豆蔻酸甲酯；C：棕榈酸甲酯；D：硬脂酸甲酯；E：二十二酸酸甲酯）EI质谱图2.2.2衍生化反应条件的优化在探究三甲基硅重氮甲烷作为衍生化试剂进行脂肪酸的甲酯化中，本节考察了反应温度、反应时间、衍生化试剂用量及催化剂用量对月桂酸、肉豆蔻酸及棕榈酸酯化率的影响。反应温度为探究最佳的反应温度，取2mol/L的衍生化试剂三甲基硅重氮甲烷100µL和催化剂三甲基氯硅烷20µL，加入1mL混合标准溶液，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃温度下磁力搅拌10min，加入20µL终止试剂甲酸，进气相色谱-质谱联用进行检测分析。比较不同温度的气相色谱-质谱联用出峰的峰面积。由图可知，在实验温度范围内，甲酯化反应的转化率并未随温度变化呈现显著差异，这表明温度对甲酯化反应效率影响有限。因此，选择室温作为该反应体系的最佳反应温度（如图2-5）。图2-5反应温度对脂肪酸甲酯化反应的影响反应时间为探究最佳的反应时间，取2mol/L的衍生化试剂三甲基硅重氮甲烷100µL和催化剂三甲基氯硅烷20µL，加入1mL混合标准溶液，分别在室温下磁力搅拌1min、2min、5min、8min、10min、15min、20min、30min、40min、50min，加入20µL终止试剂甲酸，进气相色谱-质谱联用进行检测分析。比较不同时间的气相色谱-质谱联用出峰的峰面积。从图中可以看出，当反应时间小于30min时，甲酯化效率与反应时间呈正相关，说明反应体系还没有达到完全转化状态，当反应时间延长到30min时，目标产物的峰面积不再增加，说明反应已经基本完成，因此，选择30min作为该体系的最佳反应时间（如图2-6所示）。图2-6反应时间对脂肪酸甲酯化反应的影响衍生化试剂用量为探究最佳的衍生化试剂用量，分别取2mol/L的衍生化试剂三甲基硅重氮甲烷10µL、20µL、30µL、40µL、50µL、60µL、70µL，催化剂三甲基氯硅烷20µL，加入1mL混合标准溶液，分别在室温下磁力搅拌30min，加入20µL终止试剂甲酸，进气相色谱-质谱联用进行检测分析。比较不同时间的气相色谱-质谱联用出峰的峰面积。从图中可以看出，当衍生试剂用量小于50µL时，衍生化效率与衍生化试剂用量呈正相关，说明衍生化反应不完全；当衍生试剂用量大于50µL时，衍生效率与衍生试剂用量达到平衡状态。因此，选择该体系的最佳衍生化试剂用量为50µL（如图2-7）。图2-7衍生化试剂用量对脂肪酸甲酯化反应的影响催化剂用量为探究最佳的催化剂用量，取2mol/L的衍生化试剂三甲基硅重氮甲烷50µL，分别取催化剂三甲基氯硅烷0µL、5µL、10µL、15µL、20µL、25µL，加入1mL混合标准溶液，分别在室温下磁力搅拌30min，加入20µL终止试剂甲酸，进气相色谱-质谱联用进行检测分析。比较不同时间的气相色谱-质谱联用出峰的峰面积。由图可知，催化剂的引入，使甲酯化反应效率显著提高，当催化剂用量小于20µL时，甲酯化衍生化效率与衍生化试剂用量呈正相关，说明衍生化反应并未完全；当催化剂用量大于20µL时，衍生化效率与衍生化试剂用量达到平衡状态。因此，选择该体系的最佳催化剂用量为20µL（如图2-8）。图2-8催化剂用量对脂肪酸甲酯化反应的影响结果表明，以三甲基硅重氮甲烷为衍生化试剂进行脂肪酸甲酯的衍生化反应，最佳反应条件为：反应温度为室温，反应时间为30min，衍生化试剂用量为50µL，催化剂用量为20µL。2.3本章小结本章采用衍生化结合GC-MS技术，研究脂肪酸与三甲基重氮甲烷的甲酯化反应，通过系统优化反应温度、反应时间、衍生化试剂用量以及催化剂用量，成功提高了衍生化效率，最终实现了脂肪酸的高效甲酯化。该方法反应迅速，具有优异的分析重现性。上述工作为食用油中脂肪酸的精准定量打下了坚实的基础。第3章食用油中5种脂肪酸的同时定量分析3.1引言作为三大营养素之一，食用油是日常膳食的重要组成部分，其品质安全直接关系到人类健康安全。在热加工和贮藏过程中，油脂在氧气、光照和催化剂作用下，容易发生氧化水解反应，导致游离脂肪酸（FFA）含量显著提升。游离脂肪酸含量是评价油脂氧化程度与新鲜度的关键指标（我国行业标准以酸值表征）。优质初榨油脂通常具有低FFA特征，而随着贮藏时间延长，脂质水解加剧导致FFA累积。FFA超标不仅反映油脂精炼程度不足，更可能引发胃肠道功能紊乱、肝损伤等健康风险，这凸显了酸值监控对食用油质量管控的重要性。本研究以三甲基硅重氮甲烷为衍生试剂，将脂肪酸甲酯化，然后用气相色谱-质谱联用仪对食用油样品中的脂肪酸进行定量分析3.2材料与方法3.2.1样品和试剂月桂酸（C12，化学纯）、甲酸（HPLC），国药化学试剂有限公司；肉豆蔻酸（C14:0，>99%）、棕榈酸（C16:0，>97%）、硬脂酸（C18:0，>98%）、二十二酸（C22:0，>99%），梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；三甲基硅重氮甲烷（正己烷溶液2mol/L）、三甲基氯硅烷（95%），上海安耐吉化学试剂有限公司；乙酸甲酯（AR,98%），阿拉丁试剂（上海）有限公司；氢氧化钾，安徽泽升科技有限公司；去离子水是在室内用高纯水机制备的。样品：8种市售的食用油（Oil1-Oil8），2种地沟油样品（Oil9-Oil10）。3.2.2样品制备与衍生化同.2.3实际样品的萃取与浓缩取待测食用油200µL，加入2mL的1mmol/L氢氧化钾水溶液，涡旋3min后，离心，取下层清液，加入HCl进行酸化，调节pH值至酸性，加入乙酸甲酯溶剂1mL，涡旋3min后，提取乙酸甲酯萃取液，加入2mol/L的衍生化试剂三甲基硅重氮甲烷50µL和催化剂三甲基氯硅烷20µL，在室温下磁力搅拌30min，加入20µL终止试剂甲酸，将衍生化产物注入气相色谱-质谱联用体系进行定量检测分析。脂肪酸与三甲基硅重氮甲烷的反应方程式如图3-1所示。图3-1游离脂肪酸与三甲基硅重氮甲烷的甲酯化反应3.2.4仪器条件使用Agilent7890A气相色谱系统与Agilent5975C单四极杆质谱检测器(Agilent，PaloAlto，CA，USA)联用进行仪器分析。使用HP-5毛细管柱(15m长x0.25mm内径0.25um膜厚，AgilentTechnologies)分离目标分析物。将样品等分试样(1µL)注入进样口，气相色谱入口温度设置为260℃，分流比为20:1。氦气(99.999%)作为载气，流速设置为1.0mL/min。柱温箱温度最初设置为60℃，以30℃/min的速率升至160℃，保持2min，以25℃/min的速率升至200℃，以5℃/min的速率升至220℃，最后以30℃/min的速率升至280℃。为了进行监测和确认，采用了选择离子监控(SIMm/z：3.5min-6.8min，m/z=171，183；6.8min-8min，m/z=242；8min-9min，m/z=227，270；9min-11min，m/z=255；11min-14.933min，m/z=311，354。)模式，质谱条件设置如下:电子电离(EI)能量为70eV，离子源温度为230℃，进样口温度为260℃。使用高纯度氦气(99.998%)为碰撞激活解离气体，流速设置为1mL/min。采集时间范围为3.5-14.9min。3.3结果与讨论3.3.1方法学验证取2mol/L的衍生化试剂三甲基硅重氮甲烷50µL和催化剂三甲基氯硅烷20µL，加入1mL混合脂肪酸标准溶液，在室温下磁力搅拌30min，加入20µL终止试剂甲酸，再将其进一步用乙酸甲酯溶剂稀释为5000µg/L、1000µg/L、500µg/L、100µg/L、50µg/L的一系列混合标准溶液，进气相色谱-质谱联用进行检测分析，对食用油中的5种脂肪酸进行定性定量分析，采用3.2.4仪器分析条件，采用气相色谱-质谱联用分析，建立标准曲线，实现对油脂样品中脂肪酸的准确定量分析，将峰面积y与浓度x（µg/L）进行线性拟合，结果见表3-1.，5种脂肪酸甲酯在50-5000µg/L浓度范围内线性良好，线性相关系数为0.9985~0.9998。表3-15种脂肪酸甲酯的线性范围、线性回归方程及相关系数脂肪酸甲酯保留时间（min）标准曲线R2线性范围（µg/L）C12:05.517y=1.6487x-39.9190.999850-5000C14:06.887y=0.5649x+15.1050.998650-5000C16:08.148y=1.8317x-78.250.998950-5000C18:09.578y=0.8515x-32.0460.998550-5000C22:013.425y=0.8673x-11.7620.999650-5000从3.2.2脂肪酸混合标准溶液中选取50µg/L和100µg/L两个浓度考察其重现性，不同质量浓度的样品在同一天重复进样3次，测定结果的相对标准偏差作为日内重现性;以相同的间隔（一天），每天进样一次样品，连续3天，以相对标准偏差作为日间重现性，结果见表3-2。日重现性均在10%以下，表明该方法具有良好的精密度。表3-2日内重现性与日间重复性脂肪酸甲酯日内重复性日间重复性50µg/L100µg/L50µg/L100µg/LC12:05.62%7.30%4.08%7.29%C14:06.59%2.17%1.68%7.48%C16:01.60%2.40%3.37