弓形虫ROP16蛋白作用于NR8383细胞的转录组测序与分析

目录TOC\o"1-3"\h\u摘要： 弓形虫ROP16蛋白作用于NR8383细胞的转录组测序与分析前言弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种专性的细胞内寄生原虫，能够引发人与动物的共同疾病。这种原虫在全球有广泛的分布，感染的范围很广，大约有三分之一的全球人口受到了感染REF_Ref12288\r\h1。如果孕妇被弓形虫感染，这可能会引发垂直传播，从而导致胎儿的发育异常、畸形，甚至死亡。根据数据显示，85%幸存的感染婴儿可能会表现出中枢神经系统的异常，这对优生优育产生了重大的负面影响。另外，弓形虫被认为是导致免疫系统受损或有缺陷的患者死亡的主要因素之一REF_Ref12651\r\h2,REF_Ref12654\r\h3。弓形虫主要分为三个代表性的基因型，分别是I型（RH株）、II型（Me49株）以及III型（VEG株）。这三种基因型的虫株具有高达98%的遗传同源性，然而，它们在毒性方面却表现出明显的不同。在这些中，I型弓形虫的毒性最为显著，而II型与III型的毒性则相对较为温和。弓形虫的毒性主要表现在其对宿主细胞的侵略性、细胞内的增殖速率、是否能在细胞内形成包囊，以及其对宿主的致病性和致死性等方面REF_Ref12811\r\h4。弓形虫棒状体蛋白16（ROP16）是一种在弓形虫侵入宿主细胞过程中起到至关重要作用的蛋白激酶REF_Ref12886\r\h5。经过研究，ROP16被确认为一个关键的毒性调控因子，它主要存在于宿主的细胞核之中REF_Ref12935\r\h6,REF_Ref12964\r\h7。NR8383细胞被广泛认为是大鼠肺泡巨噬细胞系中的一种常见类型REF_Ref13128\r\h8，这是一个研究弓形虫感染与宿主免疫响应的关键模型。在本次研究中，选择了NR8383细胞株作为研究对象，并对ROP16进行了稳定的转染处理。通过整合转录组测序技术，对ROP16蛋白对宿主细胞基因表达的作用进行了深入探讨，旨在为弓形虫病的预防和治疗提供科学依据和创新方向。1、材料与方法1.1材料1.细胞：NR8383细胞被存放在宁夏的临床病原微生物关键实验室中；嘌呤霉素是从Sigma公司采购而来的；在实验过程中，所使用的慢病毒种类（包含空载体pHBLV-CMV和ROP16过表达载体pHBLV-CMVROP16）均是从汉恒生物科技（上海）有限公司采购而来；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒均是从日本的TaKaRa公司采购而来的。2.试剂与仪器：胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰酶等细胞培养相关试剂均购自GIBCO公司；WesternBlot相关试剂包括兔抗ROP16多克隆抗体，HRP标记山羊抗兔IgG(HRP-IgG）、山羊抗鼠IgG(HRP-IgG）均购自美国Abcam公司，RT-PCR所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。1.2方法1.2.1慢病毒转染NR8383细胞及稳转细胞株筛选1.慢病毒包装与感染：在构建完成的ROP16重组慢病毒质粒和包装质粒的共同作用下，对HEK293T细胞进行了转染，并根据Lipofectamine3000试剂的说明书进行了操作。在转染完成后的48-72小时内，需要收集细胞表面的清液，并通过0.45μm的过滤器进行过滤，获得携带ROP16基因的慢病毒颗粒。将NR8383细胞分为正常对照组（转染空载体慢病毒）和过表达组（转染ROP16重组慢病毒），按复染率（MOI）为50的比例分别加入相应慢病毒颗粒，于37℃、5%CO2培养箱中培养6-8小时后，更换为新鲜培养基继续培养。2.荧光显微镜观察：在感染发生后的48-72小时内，利用荧光显微镜检查细胞内绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平，从而初步评估转染的效果。正常对照组细胞由于转染空载慢病毒，仅少量或无GFP表达，而过表达组细胞应有大量GFP阳性细胞，转染效率应达到80%以上，以确保后续实验的可靠性。3.实时荧光定量PCR（qRT-pcr）检测：收集转染后72小时的NR8383细胞，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA。使用qRT-pcr的方法检测正常对照组和过表达组细胞中ROP16基因的相对表达量。4.WesternBlot检测：在转染后的72小时内，收集了NR8383细胞，并采用含有1%PMSF的RIPA裂解液对其进行了裂解处理。从这些裂解中，我们成功提取了总蛋白，并利用BCA蛋白定量试剂盒对这些蛋白的浓度进行了测定。首先，我们使用10%的SDS电泳技术对蛋白样本进行分离，接着把这些分离后的蛋白转移到PVDF膜上。然后，用5%的脱脂牛奶进行为期两小时的密封处理。接下来，分别加入了兔抗ROP16多克隆抗体（1:1000稀释）和鼠抗GAPDH单克隆抗体（1:5000稀释），然后在4°C的温度下孵化过夜。第二天，我们加入了带有辣根过氧化物酶标记的二抗（1:10000稀释），并在常温条件下孵化了两小时。随后，我们使用化学发光试剂进行了显色处理，并通过凝胶成像系统进行了检测。我们采用ImageJ软件对条带的灰度进行了分析，并利用ROP16蛋白条带灰度与GAPDH蛋白条带灰度的比值来描述ROP16蛋白的相对表达水平，进而对比了两组细胞中ROP16蛋白的表达差异。1.2.2转录组测序及分析1.RNA提取与质量检测：将稳定转染的正常对照组和过表达组NR8383细胞分别收集，每组设置三个生物学重复。使用Trizol试剂来提取细胞的总RNA，并根据RNA的纯度和完整性标准，利用NanoDrop2000分光光度计来测定RNA的浓度和纯度，即OD260与OD280的比值）。2.测序文库构建与测序：将提取的高质量RNA样品委托给专业测序公司进行转录组测序。3.数据分析：通过使用韦恩图，探讨了正常对照组与ROP16过表达组在基因表达上的差异性。利用火山图和散点图技术，我们能够直观地展示差异表达基因DEGs的特性。火山图的横坐标是log2（FoldChange），而纵坐标则是log10（P-value），散点图以log10（ExpressionofNR8383）为横坐标，log10（ExpressionofOverExp-ROP16）为纵坐标，设定筛选条件为|log2（FoldChange）|≥1且P-value≤0.05，筛选出在正常对照组和过表达组间差异表达的基因。了解这些DEGs在生物学功能和信号通路中的分布情况，以深入探究ROP16蛋白作用于NR8383细胞的分子机制。1.2.3实时荧光定量PCR验证转录谱基因表达1.验证基因的选取：依据转录组的测序数据，并结合基因功能的注释和富集分析，为了确保验证基因的代表性和可靠性，我们选择了与ROP16蛋白可能作用相关的差异表达基因进行验证，并选取了具有不同表达趋势的基因，以全面评估转录组测序结果的准确性。2.引物设计与合成：依据NCBI数据库里特定基因的cDNA序列，精心设计的引物序列是由生工生物工程（上海）股份有限公司负责合成的，引物序列如下：表1引物序列Table1Primersequences基因名称Genename引物序列（5´-3´）Primersequence（5´-3´）GAPDHF：ACAGCAACAGGGTGGTGGACR：TTTGAGGGTGCAGCGAACTTROP16F：TGGGCTCCTGAACTTGCGAAATCR：AGACGAACTCGAAGATTGCCAACCJAK3F：TGTAGCCTCTCATCCTCAGAAGCR：ACACAGGTCCTCAGCCAAGTAGCD11bF：GCAAGAGAATCCAGTGTGACATCCR：CAGGAGGTGGTCGTGAGAAGTCCXCR1F：TCTGGAACAGTCTGCTATGAGGTCR：GATGAACAGCGGCAAGAGGAAGHoxc6F：TCCTACTTCACTAACCCTTCCTTATCCR：GCTACGGCTGCTCCATAGGTC2、结果2.1稳定表达ROP16的NR8383细胞株构建：将构建好的ROP16慢病毒转染至大鼠肺泡巨噬细胞NR8383中，如图1：慢病毒转染后72小时，荧光显微镜下观察到正常对照组细胞有极少部分细胞有微弱GFP荧光，而过表达组细胞中有大量细胞呈现明亮的GFP荧光信号，转染效率达到85%以上，表明ROP16重组慢病毒成功转染至NR8383细胞，为后续筛选提供了良好的基础。图1荧光显微镜下转染情况2.2.实时荧光定量PCR检测结果：（如图2）在完成转染后的72小时时间里，收集了细胞样本，并对其进行了实时荧光定量PCR检测。经过检测，发现在过表达组的细胞里，ROP16基因的相对表达量显著超过了正常对照组，这种差异在统计上是有意义的（P<0.01）。从转录的角度证实了ROP16基因在NR8383细胞里的过度表达，说明构建的ROP16过表达质粒能够有效驱动ROP16基因在宿主细胞中的转录。2.3WesternBlot的检测数据表明（如图3所示），与正常对照组相比，过表达组的表达量明显更高，这种差异在统计学上是有意义的（P<0.01）。这一结果从蛋白质水平进一步验证了ROP16基因在NR8383细胞中的过表达，研究结果显示，已经成功地建立了能够稳定表达ROP16的NR8383细胞系，这为进一步探讨ROP16蛋白如何影响细胞基因表达提供了宝贵的细胞实验模型。图3ROP16蛋白表达情况图4ROP16过表达后差异表达基因的韦恩图图5ROP16过表达后差异表达基因的火山图与散点图2.4转录组测序及分析结果：通过差异表达基因（DEGs）的分析，使用韦恩图对正常对照组和ROP16过表达组的基因表达进行了评估。如图4展示的，与过表达组相比，对照组仅表达了799个基因，而过表达组仅表达了771个基因。这两组在ROP16过表达组中共同表达了13731个基因，这表明ROP16过表达后，NR8383巨噬细胞的基因表达发生了改变。接下来，根据“|log2FC|≥1和Qvalue≤0.05”的标准进行了筛选。如图5展示，ROP16在过度表达后，有128个基因表现出显著的差异，其中81个基因的表达上升，而47个基因的表达下降。在比较表达组样本和正常对照组样本的差异表达时选出了（如表2）上调基因JAK3和CD11b，以及下调基因CXCR1和Hoxc6来进行验证来表明ROP16蛋白的过表达对NR8383细胞的基因表达谱产生了广泛而显著的影响。表2差异基因表达在转录组数据中的信息基因基因IDlog2(OverExp-ROP16/NR8383)Qvalue(OverExp-ROP16/NR8383)JAK3253261.405e-8CD11b250211.790.02CXCR1252885-1.934.46e-5Hoxc654258-1.435.94e-3图6转录组测序结果的qRT-PCR验证2.5实时荧光定量PCR技术被用于验证JAK3CD11bCXCR1和Hoxc6。为了确保表2中转录组数据的准确性，使用qRT-PCR方法来检查JAK3和CD11b这两个差异表达上调基因以及CXCR1和Hoxc6这两个差异表达下调基因的表达情况。如图6所示，上调的JAK3和CD11b差异表达基因以及下调的CXCR1和Hoxc6差异表达基因的表达模式与转录组的基因表达模式是一致的。3、讨论一旦弓形虫被感染，它会转变为快速繁殖的子种，并在宿主体内传播，导致人和动物都可能受到弓形虫疾病的困扰REF_Ref13219\r\h9,REF_Ref13222\r\h10。本项研究是通过构建能够稳定表达弓形虫ROP16蛋白的NR8383细胞系来进行的REF_Ref13458\r\h11，还进行了转录组的测序分析，结果显示ROP16蛋白对NR8383细胞的基因表达产生了明显的影响。通过筛选，我们找到了大量的差异表达基因，并通过功能富集分析揭示了这些基因在免疫反应和细胞功能等多个方面的潜在作用机制。从免疫反应角度来看，弓形虫感染宿主细胞后，ROP16蛋白作为其重要的效应蛋白，可能通过调控宿主细胞的免疫相关基因表达来抑制宿主的抗感染免疫反应，从而促进弓形虫的感染和扩散。转录组测序结果显示，在ROP16蛋白过表达的NR8383细胞中，JAK3的基因表达有了明显的增加。JAK3基因编码出的蛋白是Janus激酶家族中的一员REF_Ref13670\r\h12，该物质主要在免疫细胞内表达，并在细胞因子的信号传递中起到关键作用，特别是在由白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-4（IL-4）等细胞因子触发的信号途径中，它对T细胞和B细胞的增长、分化和生存起到了核心调控作用REF_Ref13729\r\h13。在本研究中，ROP16蛋白过表达导致JAK3基因上调，这可能会触发NR8383细胞内的特定细胞因子信号途径，从而提高细胞的免疫响应能力。CD11b基因在过表达ROP16蛋白的NR8383细胞中也呈现上调趋势。CD11b是一种整合素受体，广泛表达于白细胞表面，在细胞黏附、迁移以及免疫细胞的激活过程中扮演重要角色REF_Ref13794\r\h14，尤其在巨噬细胞的吞噬作用和抗原呈递功能中具有关键地位。ROP16蛋白诱导CD11b基因表达上调，可能增强NR8383细胞的黏附和迁移能力，促进其对病原体的吞噬和清除。但考虑到弓形虫的巧妙逃逸机制，这种上调也可能是虫体为了自身在宿主体内的传播和扩散而对宿主细胞功能进行的某种调控。从细胞功能角度来看，CXCR1基因在ROP16蛋白作用下表达下调。CXCR1是一种趋化因子受体，它主要涉及中性粒细胞的趋化和激活过程，对于炎症反应的触发和持续起到了关键的角色。其配体包括IL-8等趋化因子，当炎症发生时，这些趋化因子与CXCR1结合，引导中性粒细胞迁移到炎症部位，发挥抗菌、抗炎等作用REF_Ref13931\r\h15。在本研究中，ROP16蛋白导致CXCR1基因表达下调，可能抑制中性粒细胞的趋化和活化，从而减弱炎症反应。这可能是弓形虫为了逃避宿主的炎症攻击而对宿主细胞基因表达进行的调控，有利于其在宿主体内的长期生存。Hoxc6基因在细胞中表达也是下调，Hox基因家族在胚胎发育过程中对细胞分化、器官形成等具有关键调控作用，近年来研究发现其在免疫细胞功能调节中也发挥作用REF_Ref13996\r\h16。Hoxc6基因的下调可能影响NR8383细胞的分化和功能，进而影响其在炎症反应中的表现。具体而言，Hoxc6基因的低表达可能改变巨噬细胞的活化状态，使其向某种特定的表型极化，这种极化状态可能更有利于弓形虫的感染和存活，例如抑制巨噬细胞的抗菌活性或促炎因子的分泌。综合来看，弓形虫ROP16蛋白对NR8383细胞的转录组产生了显著影响，通过调控多个关键基因的表达，影响宿主细胞的免疫反应和炎症反应。上调的JAK3和CD11b基因有可能提升细胞内某些免疫系统的功能，而下调的CXCR1和Hoxc6基因则可能抑制炎症反应和细胞的正常分化。这种复杂的基因表达调控网络可能是弓形虫在长期进化过程中形成的一种适应性策略，通过精细调控宿主细胞的基因表达，既满足自身在宿主体内的生存和繁殖需求，又能有效逃避宿主的免疫清除。然而，本研究仍存在一些局限性。首先，虽然通过转录组测序和实时荧光定量PCR验证了基因表达的变化，但对于这些基因在蛋白水平的表达变化以及具体的生物学功能验证还不够充分。其次，对于ROP16蛋白调控这些基因表达的分子机制尚未完全明确，是否存在某些转录因子或信号通路的直接参与尚需进一步研究。此外，本研究仅在体外细胞水平进行，未开展体内实验验证，无法确定这些基因表达变化在整体动物感染模型中的作用和意义，未来需要进一步开展深入的实验研究，通过基因敲除、蛋白相互作用等实验手段，进一步探讨了ROP16蛋白与宿主细胞基因间的调节网络，以及这些基因在弓形虫感染中的关键角色，旨在为弓形虫病的预防和治疗提供更为精确的目标和方法。4、结论本研究成功构建了稳定表达弓形虫ROP16蛋白的NR8383细胞株，并通过转录组测序和实时荧光定量PCR验证，全面分析对ROP16蛋白如何影响NR8383细胞的基因表达进行了深入的探讨，得出以下结论：ROP16蛋白能够显著改变NR8383细胞的基因表达谱，筛选出的差异表达基因涉及多个重要的生物学过程和信号通路，包括免疫反应、炎症反应、细胞代谢调控等,为弓形虫ROP16蛋白的作用机制以及弓形虫与宿主细胞之间的相互作用提供了重要的理论依据和实验基础，也为弓形虫病的防治研究提供了新的方向和潜在的靶点。参考文献HillDE,ChirukandothS,DubeyJP.BiologyandepidemiologyofToxoplasmagondiiinmanandanimals.AnimHealthResRev.2005Jun;6(1):41-61.张爱梅.弓形虫基因型Chinese1不同毒力的分离株诱导巨噬细胞偏移应答的研究[D].安徽医科大学,2013.WangJ,LiuX,JiaB,LuH,PengS,PiaoX,HouN,CaiP,YinJ,JiangN,ChenQ.AcomparativestudyofsmallRNAsinToxoplasmagondiiofdistinctgenotypes.ParasitVectors.2012Sep3;5:186.

LiG,LiQ,TongY,ZengJ,DangT,YangN,ZhouY,MaL,GeQ,ZhaoZ.Theanticancermechanismsof

Toxoplasmagondii

rhoptryprotein16onlungadenocarcinomacells.CancerBiolTher.2024Dec31;25(1):2392902.

夏菁,彭鸿娟.刚地弓形虫毒力调节因子研究进展[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2015,33(04):297-300.DubremetzJF.RhoptriesaremajorplayersinToxoplasmagondiiinvasionandhostcellinteraction.CellMicrobiol.2007Apr;9(4):841-8.AlexanderDL,MitalJ,WardGE.IdentificationofthemovingjunctioncomplexofToxoplasmagondii:acollaborationbetweendistinctsecretoryorganelles.苏雅静,董辉,王云杰,等.弓形虫多态性ROP16效应分子诱导宿主A549细胞基因表达谱的差异研究[J].中国人兽共患病学报,2018,34(03):200-206.DupontD,LinJS,PeyronF,AkaokaH,WallonM.ChronicToxoplasmagondiiinfectionandsleep-wakealterationsinmice.CNSNeurosciTher.2021Aug;27(8):895-907.

朱进进,程正阳,余莉.弓形虫棒状体蛋白ROP18表位肽抗体的制备与初步应用[J].中国动物传染病学报,2023,31(01):48-54.DOI:10.19958/31-2