纳米金电化学传感器在生物分子检测中的应用

纳米金电化学传感器在生物分子检测中的应用Applicationofnanometergoldelectrochemicalensorinbiomoleculardetection摘要：电化学生物传感器是能感应或响应生物分子化学量，并将其转换成电信号输出的器件或装置，广泛应用于环境监测和医药学等领域的分析检测。近年来，金纳米粒子（AuNPs）因其具有灵活的可控尺寸，良好的生物相容性，强稳定性，吸附性和电子传输性能，可催化能力较高等优势，而应用于电化学生物传感器中,极大地优化了传感器的性能。目前，AuNPs电化学传感器已可用于精密检测多种生物分子，如核苷酸、蛋白质、糖、脂、酶活性和微生物等。本文主要对纳米金的优异性能及在电化学生物传感器中的应用进展及其发展前景进行综述。关键词：纳米金；电化学；生物传感器金纳米粒子（goldnanoparticles,AuNPs）俗称纳米金，早在公元前5世纪已被发现，当时称为“胶体金”[1]。AuNPs在20世纪60年代首先作为特殊标记物用于生化分析，在1971年AuNPs被引入电子显微镜免疫技术，作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位[2]。近年来，AuNPs作为传感器重要材料再次掀起了一股研究的热潮，用于核苷酸、蛋白质、糖、脂、酶活性和微生物的精密检测。纳米金电化学生物传感器是由纳米金生物材料作为敏感组件，电极作为转换组件，以电势、电流或电压作为检测信号的传感器[3]其通过自身的敏感组件将我们无法直接感知的物理信息，生物信息，化学信息等通过接收电压信号、电导信号、电流信号将检测体系以离子种类或浓度变化等方式呈现出来，能直接检测出生物大分子、理化参数等，在医学临床应用领域、食品分析、生物检测、环境监测等方面具有很好的应用前景。1.纳米金的特征性质1.1一般理化特性AuNPs尺寸一般在1~100nm之间，具有灵活可控的尺寸，良好的生物相容性，强稳定性，吸附性和电子传输性能，高电子密度和催化能力等特点[4]。AuNPs官能团简单，物理化学性质稳定，易于合成，具有很好的荧光性、导电性和催化性质，当其与各种生物大分子结合后，依然保留各自的生物活性，可实现对生物分子的重复标记。AuNPs按尺度大小还能展现出不同的颜色特征，可用于生物分子的可视化检测，而且AuNPs对温度和溶液介电常数表现出敏感的反应，检出限量远低于染料分子，易于对所标记的生物分子进行检测[5]。此外，AuNPs还具有制备简便、分析快捷、易操作、对细胞无毒害等优势。1.2表面等离子共振特性表面等离子共振特性是AuNPs最重要的性质之一，可产生“电浆共振”现象[1]。AuNPs被特定波长的光照射后，电子开始震荡，偶极子产生。当离子共振产生在520nm附近的可见光区域内时，可利用紫外-可见光分光光度计进行检测观察。1.3荧光特性荧光特性是由于聚合物稳定的金纳米粒子的光致发光和树枝状分子封装产生。金纳米粒子由于被芘基，甲硫基苯基，芴基和其他探针包裹后，共振能量发生迁移而具有荧光特性。其中树枝状纳米簇的尺寸决定了荧光发射的最大值，粒子尺寸越大，荧光发射波长越长。这种特性使金纳米在材料科学和生物光子学等多个领域有着优良的应用前景。[6]1.4电化学性质纳米金的电化学性质主要体现在氧化还原活性方面。纳米金的氧化还原型充放电行为可发生在其15种氧化态下。这种充放电行为的产生是由于纳米金表面具有相当于一个纳米尺度电极的双电层电容，随包覆粒子烷基链长度的减少而增加。当纳米金粒子的粒径减小到一定程度时，其静电吸引能将大于其自身热运动所产生的能量[7]，这时单电子将在烷基硫醇与电极或探针之间发生转移，双电子层便进行了充放电，纳米金粒子的电化学性质与粒子中心核含有的金原子个数以及表面的烷基保护稳定基团有紧密的相关性。根据纳米金粒子的电化学性质就可分析出纳米金粒子的氧化还原态个数。1.5吸附性纳米金粒子具有对其他集团的吸附性是因为其表面存在许多具有不饱和性质的悬空部位，可与其他原子结合，导致纳米金活性较高。该悬空部位的产生是由于其内外原子所处的晶体场环境不同导致的。纳米金容易吸附O2、CO、NO、N2O等其他基团并产生化学反应。大部分吸附都为可逆反应，并且其等温吸附曲线在一定范围内完全符合Langmuir吸附方程。利用这种性质可将纳米金粒子吸附到负载载体上制备高活性纳米金催化剂[8]。2.纳米金的制备方法2.1.化学还原法：氯金酸还原法是在还原剂的作用下将水溶液中的金离子还原成金原子，将金原子聚集成微小的金核并吸附正负离子形成吸附层，在静电力的作用下形成稳定的胶体溶液。由于纳米金一般是不稳定的，具有易团聚的表面活性，制备过程中选择加入表界面活性抑制剂和反絮凝剂来避免这种团聚。当蛋白质为电中性时，即PH为8等于或稍偏于蛋白质等电点时，蛋白质分子表面张力最大。蛋白质与纳米金颗粒相互间的静电作用较小，处于微弱的水化状态，这时抑制剂可将蛋白质吸附在表面，形成蛋白层，避免与其它纳米金的接触，使纳米金处于稳定状态.[9]2.2.晶种法：晶种法制备过程是要预先合成一种尺寸较小的金纳米粒子，将其作为晶种，在晶种表面继续还原氯金酸，并使粒子在一定生长溶液中继续生长，通过调节晶种、生长溶液的比例控制产物不同的形貌和粒径，制备出不同尺寸和比率的纳米金颗粒，如：球形的纳米颗粒、棒状的纳米颗粒、三角形的纳米颗粒等。[10-11]2.3.相转移法：相转移法根据最原始的是Brust双相反应，用于10-20nm纳米金颗粒的制备[12]在两相或单相体系中，以TOAB为相转移剂，以烷基硫醇为稳定剂，NaBH4为还原剂，将氯金酸转移到有机相中，制备出的纳米金的颗粒大小范围在1~8nm。这种方法制备出的纳米金尺寸大小取决于硫醇/金盐的比例和加入还原剂速度，比例越大，加入速度越快，制得的纳米金尺寸就更小，单分散性更好。可根据需要的纳米金尺寸和性质调整溶剂比例和加入速度。2.4聚合物保护法：聚合物保护法以含有聚乙二醇、硫醇或硫醚的聚合物为配体，NaBH4为还原剂，制备尺寸小于10nm的纳米金，根据聚合物稳定剂不同则纳米金颗粒具有不同溶解性的这一特质。硫醚或硫醇修饰的聚合物配体能直接合成尺寸小于5nm的具有高分散性的纳米金，纳米金颗粒的大小和分散性主要是由聚合物的结构、浓度以及配体能与金属结合基团的个数决定的。[13]3.纳米金电化学传感器的分类纳米金电化学传感器具有灵敏度高，时间短，稳定性好等优点，现已广泛应用于生物分子的检测。纳米金电化学传感器是基于纳米金的电子传输性质制备的，使之与其他材料相结合，增加其导电性，以电位测定法和电流分析的方式变换电信号，从而制备出更优良的传感器，实现对生物分子的检测。3.1有机化合物类3.1.1高分子有机化合物类高分子有机化合物在纳米金电化学传感器中应用广泛，。举例如下：纳米金电化学传感器在多药耐药MDR1基因的检测上就是用石墨烯/碳纳米管复合物为材料修饰玻碳电极构建的[14]；在纳米导电聚毗咯薄膜层对纳米金进行修饰，形成新的电化学DNA生物传感器[15]；在电化学发光免疫特异性检测蛋白质时将纳米金封装在树枝聚合物中通过共价固定鲁米诺[16]和前列腺特异性抗体作为信号分子；电化学传感器检测多巴胺时，将聚（3,4-乙烯二氧噻吩）薄膜在铂电极表面与纳米金在静电作用下结合[17]；纳米金修饰有多壁碳纳米管丝网印刷电极，制成用来检测富组氨酸蛋白Ⅱ的传感器；用纳米金修饰单壁碳纳米管，利用电化学阻抗法构建金电极通过二茂铁抑肽素检测摩尔蛋白酶等传感器。3.1.2其他有机物类其他有机物也可与纳米金结合形成电化学传感器。其中壳聚糖的研究在近年来已成为热点，壳聚糖[16]可通过对氯金酸进行还原来完成在纳米金粒子上的原位合成，利用原位合成技术构建DNA生物传感器，用来检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因。壳聚糖凝胶还可以与纳米金、酶标二抗混合溶液在电极表面形成纳米敏感膜，从而构建酶免疫传感器，对结核杆菌进行检测。此外还有用纳米金修饰双层类脂膜，再将雌激素固定在脂膜中来构建电化学传感器，检测雌激素类似物质。这种能形成电化学传感器的有机物还有许多，比如纳米金与氨基结合的材料在电极表面能够自动分散成膜，形成检测环境遗传毒性污染物的电化学传感器[19]。；纳米金在谷胱甘肽的保护下构建的可用于检测白介素的免疫传感器，；纳米金在3-巯基丙酸甲酯改变性状，通过测量电压的变化来传感乙酸浓度，这种传感器灵敏度可达到10-6量级；除此之外还有利用纳米金的化学吸附性，与硫醇溶胶形成凝胶网状，检测肝炎抗原。3.2无机化合物类无机化合物与纳米金形成电化学传感器是现代传感器的研究热点，在生物学检测中也具有重要研究意义，其中金属氧化物与纳米金组合应用较为广泛，例如用于定量检测有机磷的二氧化锆[20]纳米粒子与纳米金粒子在玻碳电极上沉积制成的电化学传感器，；氧化铁纳米粒子，纳米金，碳纳米管杂化物构建的实现甲胎蛋白的检测的电化学传感器；通过在含有二硫化钼的石墨电极上用恒定电法沉积纳米金构建能够检测多菌灵的电化学传感器。3.3其它除化合物外，纳米金还可与其他材料形成电化学传感器，包括磁珠，金银壳材料，多空金电极等。4.纳米金电化学传感器检测生物分子纳米金具有操作简单、生态环保、灵敏度高等性质。其颜色也因等离子共振(SurfacePlasmonResonance)[7]受其聚集程度和溶液颜色影响，以其平均半径为标准，纳米金粒子间距减小呈凝聚状态时，等离子共振体将发生蓝移，间距越小越趋向于蓝色，当纳米金颗粒间距增加呈分散状态时，宏观颜色趋近于红色，这就是纳米金的光学性质，纳米金颗粒除光学特征外还具有良好的生物相容性，能够结合特定的抗原、蛋白质、抗体等[21]。除此之外，与亲核试剂发生特异性吸附、与-NH2产生非共价吸附、与巯基之间产生共价键等也是纳米金所具有的特殊化学性质。我们根据电化学分析法的操作简单，价格经济，可快速、灵敏分析元素等优势特征建立了一种新型检测技术方法—电化学生物传感器，凭借检测速度快，操作简便，灵敏度高，较好的热稳定性和化学稳定性、成本低可联系动态监测等优势广泛应用在生物传感领域。随着电化学传感器功能的不断完善与发展，人们发现现代纳米科学技术在电化学传感器领域具有很大的应用发展空间，其中纳米金结构的各种优势被广泛应用于电化学生物传感器中，从而达到了检测目标物的高效性，科学性，合理性。下面是各种电化学传感器与纳米金结合后检测生物分子的实例。4.1比色法检测核苷酸 比色法以被烷琉基寡核苷酸修饰的纳米金颗粒作为报告集团，与待测的靶片段进行杂交，使寡聚核苷酸形成双螺旋结构。这种结构加热时会发生解离，伴有颜色变化。发生变形时溶液颜色会恢复至杂交前颜色。而靶片段与探针变性后解离所需的能量要求很高，所以所需的溶解温度较高，根据熔解度和颜色变化，就可以区分不完全匹配的靶片段。纳米金电化学生物传感器就是利用这种性质将金颗粒与特定抗体连接实现对较大抗原的检测。[22]如将与特定抗体连接的金溶胶妊娠试剂加入孕妇尿液中，呈显著红色即为妊娠状态，无颜色变化则是未妊娠。0.5克金就可以实现对一万人次的测定，这种方法判断结果清晰可靠，操作简单，不需要大型仪器的检测使用，直接从溶液颜色和熔解温度即可实现对核苷酸的检测，并完克服了普通检测方法中放射性标记物及污染情况存在等问题。但是这种应用纳米金颗粒指示基团的分析方法还处于起步阶段。4.2荧光淬灭法及可视化检测蛋白质蛋白质检测在临床应用上具有重大意义，近年来人们不断探索纳米金在高效检测蛋白质方面的应用前景。研究发现纳米金荧光淬灭测定抗原的方法可以检测病人的血清，并能够成功与传统放射免疫分析法的结果对比相吻合，纳米金的共散射效应也可以检测载脂蛋白A和载脂蛋白B。用抗体和巯基寡核苷酸修饰的纳米金作探针，通过银染反应可检测蛋白质含量，将具有荧光基团修饰的寡核苷酸链连接到纳米金表面上也能够通过荧光法达到测定蛋白质含量的作用，纳米探针可进行多目标检测，为实现肿瘤标志物联合检测奠定了基础。可利用金纳米粒子免疫聚集时分散度和消光系数的变化来检测人IｇＧ[23]。纳米金可视化检测凝血酶利用的是纳米金尺寸变化可引起溶液颜色的变化这一特征，首先用纤维蛋白原修饰纳米金颗粒和微孔板表面，向微孔板里加入纳米金颗粒和待测物质，利用纤维蛋白与凝血酶的相互作用将纳米金颗粒固定在微孔板表面，在氯金酸(HAuCl4)-羟胺(NH2OH)溶液的存在下将Au3+还原成更大的纳米金颗粒。使溶液颜色发生改变，从而实现了可视化检测凝血酶。4.3耦联放大信号法检测糖纳米金电化学传感器实现了对糖连续性、重复性的检测，应用金纳米颗粒与待测糖相耦联来放大检测信号，并与人工合成的多价糖受体一苯硼酸聚合物（boropolymer）及琉基乙胺修饰电极构成了糖传感界面。通过糖与金纳米颗粒复合物及苯硼酸聚合物,（boropolymer）之间的结合常数大小达到对糖检测的作用。依次可检测出糖的顺序为：麦芽糖＞半乳糖＞甘露糖＞葡萄糖＞海藻糖＞乳糖。[24]4.4薄膜形成法检测脂有机磷农药在世界领域被广泛使用，但其生物累积性和副作用会危害人体健康并对生态环境产生恶劣影响，金纳米粒子作为电化学生物载体与乙酰胆碱酯酶在静电力的作用下被固定在玻碳电极上，起生物传感作用的就是粒子表面形成的均匀稳定的超薄多层分子体系膜。[25]纳米金电化学生物传感器可快速灵敏可靠的实现对有机磷农药的检测。该传感器具有良好电催化特性、生物相容性。4.5多元法检测小分子有机物纳米金电化学生物传感器已经实现对小分子有机物的多样性检测，其中纳米金电化学生物传感器检测多巴胺的研究成果颇丰，例如利用纳米金结合二茂铁氧化还原信号制备的功能化金纳米粒子传感器，有效提高了对多巴胺检测的灵敏度，检测限度也达到了5.7×10-10mol/L(3σ)。[26]利用纳米金对多巴胺适体（DBA）的固定作用制成的铂碳电极（GCE）-纳米金（nano-Au）—HT—含硫堇的纳米复合材料夹心型适体传感器。创造了多巴胺的最低检出限0.33pmol/L(S/N=3).[27]此外利用纳米金粒子对ECL信号的放大作用制备的电致化学发光酚传感器根据ECL信号的差值实现对多巴胺的定量分析。科学的实现对多巴胺的定量检测。[28]纳米金间接压电免疫传感器通过以纳米金为二抗的标记物放大响应信号，优化了对小分子有机物的检测，其再生性较好，重复使用率高，实现了高通量实时测定，在检测生长素类植物激素中具有良好的发展前景；[29]4.6纳米探针法检测微生物致病微生物是人体健康和食品安全的重要隐患之一[30]纳米金电化学生物传感器已实现对各种微生物的特异性检测。例如;以［Fe(CN6)］3－/4－为探针，用纳米金固定人肠道病毒EV71型抗体，来检测人血清蛋白中的EV71病毒的探针法[31]；以半胱氨酸和纳米金自组装单层为基础，制备出用来检测登革热病毒的电化学免疫传感器[32]；通过果胶纳米金复合材料（CCLP-AuNPs）固定单克隆抗体，使免疫复合物与抗兔IgGHRP结合，利用阻抗法和伏安法检测铜绿假单胞菌等。[33]5.展望：虽然纳米金电化学生物传感器的研究已经取得了突破性的进展，但仍存在着许多问题，首先其对尿酸的杂交检测特异性不高，在检测生物硫醇分子中不能细致区分出谷胱甘肽、半胱氨酸和同型半胱氨酸，其次传感器中仍存在复杂的探针设计，经济方面消耗很大，对外界环境因素的干扰不具备稳定性等问题。希望通过不断的科学探索与应用后，纳米金电化学生物传感器能克服这些问题并最大限度的将纳米纤维的优势特征开发利用，我们也将进一步对纳米金进行研究探索，使纳米金有望能够在电化学生物传感器领域开发出具有独特性的新物质，实现稳定方便的固定纳米材料优质探针的生产，为生物模拟酶传感器的技术发展带来新的上升空间作者简介第一作者：孙佳琦（1997—03），女（汉族），在读本科生，吉林医药学院生物制药专业通讯作者：王程（1979—10），男（汉族），博士，现就职于吉林医药学院，讲师，研究方向为生物科学类参考文献[1]KellyKL,CoronadoE,LinLZ,etal.TheOpticalPropertiesofMetalNanoparticles:TheInfluenceofSize,Shape,andDielectricEnvironment.Cheminform,2003,34(16):668-677[2]乔飞燕,张浩力,李富荣.金纳米粒子在生物医学工程中的应用[J].国际生物医学工程杂志,2006(06):33[3]钟桐生,刘国东,俞汝勤等.电化学免疫传感器研究进展[J].化学传感器,2002,1(22):8-14.[4]ANDB,ELSAYEDM.Preparationandgrowthmechanismofgoldnanorods(NRs)usingseed-mediatedgrowthmethod[J].ChemistryofMaterials,2003,15[5]于黎娟,禚林海,唐波.纳米金光学探针的生物分析应用新进展[J].分析科学学报,2010,26(06):719-723.3-336+368.[6]刘晓婧.金属离子/纳米粒子耦合多肽自组装构筑超分子模拟酶[D].天津大学,2016.[7]袁帅,刘峥,马肃.纳米金粒子的理化性质、制备及修饰技术和应用研究现状及进展[J].材料导报,2012,26(09):52-58.[8]文莉.金团簇和纳米粒子的合成、表征及应用[D].厦门大学,2008.[9]钟桐生,刘国东,俞汝勤等.电化学免疫传感器研究进展[J].化学传感器,2002,1(22):8-14.[10]LibingZhang,TaoLi,BinglingLi,JingLiandErkangWang,Carbonnanotube–DNAhybridfluorescentsensorforsensitiveandselectivedetectionofmercury(II)ion[J].Chem.Commun.,2010,46,1476–1478.[11]ZhuZQ,SuYY,LiJ,etal.HighlySensitiveElectrochemicalSensorforMercury(II)onsbyUsingaMercury-SpecificOligonucleotideProbeandGoldNanoparticle-BasedAmplification[J].Anal.Chem.,2060–7666.[12]ShaoN,JinJY,CheungSM,YangRH,ChanWH,MoT,Spiropyran-BasedEnsembleforVisualRecognitionandQuantificationofCysteineandHomocysteineatPhysiologicalLevels[J].Angew.Chem.Int.Ed.2006,45(30):4944-4948[13]WangZ,TanB,HussainI,etal.Designofpolymericstabilizersforsize-controlledsynthesisofmonodispersegoldnanoparticlesinwater[J].Langmuir,2007,23(2):885-95.[14]孙艺铭.金/碳纳米复合材料生物传感器检测多药耐药基因MDR1及其表达蛋白ABCB1的实验研究[D].[15]严贞贞.纳米金/聚吡咯在DNA电化学传感器中的应用[D].南京理工大学,2009.[16]葛慎光.新型功能纳米材料在电化学生物传感器中的研究与应用[D].山东大学,2013.[17]刘珂珂,刘清,褚艳红,etal.一种检测多巴胺的电化学生物传感器及其制备方法:.[18]李身锋.纳米金原位合成生物传感器的构建及其对慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因检测的研究[D].重庆医科大学,2012.[19]夏玮.纳米金电化学生物传感技术研究[D].华中科技大学,2011.[20]刘淑娟,钟兴刚,李彦,etal.一种基于纳米粒子吸附的有机磷电化学生物传感器:.[21]Tsai,C.S.Y.,T.B