基因检测实验室操作管理规范

基因检测实验室操作管理规范样本接收环节需严格执行双人核对制度，核对内容包括样本标识（如姓名、编号、采集时间）、样本类型（全血、组织、唾液等）、数量（管数、体积）、保存状态（是否溶血、凝固、冻融）及运输条件（冷链温度记录、运输时间）。对标识不清、标签脱落、样本量不足（如全血<2ml）、保存温度不符（如应4℃运输但实际25℃超过2小时）或严重溶血（血红蛋白浓度>1g/L）的样本，需立即登记《不合格样本处理记录表》，拍照留存异常状态，2小时内通知送样方确认，暂存于独立区域（4℃冰箱或20℃freezer，视样本类型），未经授权不得擅自处理。样本处理须在专用区域进行，分子检测样本需严格分区操作：样本前处理区（清洁区）、核酸提取区（半污染区）、扩增区（污染区）、产物分析区（高度污染区），各区试剂、耗材、设备专用，不得交叉使用。核酸提取时，每批样本需设置阴性对照（无核酸酶水）和阳性对照（已知浓度的标准品），磁珠法提取需控制振荡时间（15±2秒/次，3次）、洗脱温度（65±2℃）、洗脱体积（50μl±5μl），提取后30分钟内检测浓度（NanoDrop测A260/A280应在1.82.0，Qubit定量DNA浓度≥50ng/μl），不合格样本需重新提取并记录原因。试剂管理实行双人双锁制度，采购前需审核供应商资质（医疗器械生产/经营许可证、产品注册证），验收时检查包装完整性、有效期（剩余有效期≥6个月）、质检报告（如PCR试剂的扩增效率≥90%）。存储严格按标签要求：PCR预混液20℃避光，DNA聚合酶80℃，RNA提取试剂4℃，每类试剂单独分区（如酶类、缓冲液、染料），危险试剂（如溴化乙锭、β巯基乙醇）存放于防爆柜，标识“剧毒品”“腐蚀性”。试剂使用前需平衡至室温（1525℃，15分钟），配制时记录配方（如2×PCRMix10μl、引物各0.5μl、模板2μl、水7μl）、操作人员、配制时间，剩余试剂标注“已开封”“有效期至XX年XX月”（通常开封后3个月内使用），过期试剂按《危险废物管理办法》处理（如PCR试剂经1mol/LNaOH处理24小时后倒入专用废液桶）。关键设备（如实时荧光定量PCR仪、二代测序仪、生物安全柜）需建立唯一标识（设备编号：S2023001），档案包含说明书、校准证书、维修记录。PCR仪每6个月校准一次，使用温度探针检测各孔位温度均匀性（±0.5℃以内）、升降温速率（≥2℃/秒）；测序仪每3个月进行性能验证（读长≥150bp，错误率<0.1%，Q30≥85%）。设备使用前检查状态（如PCR仪热盖温度105℃正常），填写《设备使用记录表》（时间、样本编号、操作人、运行参数），运行中监控报警（如温度异常自动停机），结束后清洁（75%乙醇擦拭样品槽，DNA酶处理台面）。故障设备悬挂“停用”标识，24小时内联系厂家维修，维修后经校准合格方可使用，备用设备每周通电检查（如备用PCR仪运行空白程序30分钟）。扩增反应体系配制需在超净工作台（垂直流，风速0.30.5m/s）中进行，使用带滤芯枪头（0.110μl、10100μl、1001000μl），每次移液后更换枪头。反应程序设置严格按试剂盒说明书（如预变性95℃5分钟，变性95℃15秒，退火60℃30秒，延伸72℃30秒，40个循环），运行前核对样本编号与孔位对应表（如A1孔：样本S001，B1孔：阳性对照），运行中禁止打开热盖，结束后PCR管在扩增区开封，产物转移至产物分析区时需密封（parafilm封口），避免气溶胶扩散。测序数据采集时，确保测序仪载量符合要求（如IlluminaMiSeq芯片上样量20pM），运行参数（如Read1=150cycles，Read2=150cycles，Index1=8cycles）与实验设计一致，数据实时备份至本地服务器（RAID5阵列）和云端（阿里云，每日自动同步），原始数据（.fastq文件）保存至少10年。数据分析使用经过验证的流程（如BWA比对、GATK变异检测），设置质量过滤（Q≥20，比对率≥90%），变异注释数据库需定期更新（如dbSNP、ClinVar，每月同步）。结果审核实行双人双签制，初级审核员核对样本信息、检测数据（如测序深度≥100×，覆盖度≥95%）、变异类型（SNV、Indel）及频率（如胚系变异频率≥20%，肿瘤变异≥5%），高级审核员确认变异致病性（依据ACMG指南，区分pathogenic、likelypathogenic、VUS）、临床相关性（如BRCA1c.68_69del是否与遗传性乳腺癌相关），异常结果（如未见目标序列、变异频率低于阈值）需复查原始数据，必要时重新实验（如重复提取、扩增），记录复查过程（时间、操作人员、结果）。人员培训每月至少1次，内容包括：操作规范（如《临床基因扩增检验实验室工作规范》）、设备使用（PCR仪参数设置、测序仪上样流程）、生物安全（《病原微生物实验室生物安全管理条例》，BSL2实验室操作要求）、质量体系（ISO15189认可准则）。培训后考核（理论考试≥85分，实操考核≥90分），合格者颁发《上岗证书》（有效期2年），转岗人员（如从PCR区调至测序区）需额外培训40小时并通过考核。实验人员需穿戴专用防护装备（实验室服、手套、口罩、护目镜），接触生物样本后立即用皂液洗手（20秒以上），手部有伤口时佩戴双层手套并标注“受伤”。实验室安全实行三级管理：日常巡查（实验员每班前检查水电、设备状态）、每周检查（质量主管检查生物安全柜高效过滤器、危废存放）、每月抽查（实验室负责人检查应急预案演练记录）。生物安全柜使用前运行10分钟，操作时物品距前窗10cm，避免交叉污染（如先处理阴性样本，再处理阳性样本），结束后用10%次氯酸钠擦拭，紫外照射30分钟。医疗废物分类收集：感染性废物（如样本管、枪头）装黄色医疗垃圾袋（双层，鹅颈结封口），化学性废物（如废弃试剂）装蓝色防漏桶（标注成分、日期），病理性废物（如组织样本）冷冻保存（80℃），所有废物经高压灭菌（121℃，30分钟）后由有资质单位清运（每两周1次，交接单留存3年）。应急处理预案包括：火灾（立即关闭电源，使用二氧化碳灭火器，1分钟内启动警报）、样本泄