川陈皮素对囊性纤维化跨膜传导调节因子的激活作用

川陈皮素对囊性纤维化跨膜传导调整因子的激活作

用

川陈皮素对囊性纤维化跨膜传导调整因子的激活作用#杨爽，

于波，张耀方，王雪，杨红**5101520

2530(辽宁师范高校生命科学学院，辽宁省生物技术与药物

研发重点试验室，大连116033)摘要：

目的:

探讨川陈皮素(nobiletin)对囊性纤维化跨膜传导因子

(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR)

氯离子通道的激活作用。

方法：

利用荧光淬灭试验和膜片钳技术在稳定表达人CFTR和荧光

绿蛋白突变体EYFP/H148Q的Fischer大鼠甲状腺上皮细胞

(Fischerratthyroid,FRT)上，测定川陈皮素对CFTRCl一通

道活性的影响。

结果：

发觉川陈皮素以剂量依靠的方式激活CFTR氯离子通道的C1

一转运活性，且这种活性是快速、可逆的，并能够被CFTR特异

性抑制剂CFTRinh-172完全抑制。

初步的分子机制探讨表明川陈皮素是以与CFTR干脆作用来

激活通道活性的。

进一步的探讨结果显示，川陈皮素能够有效地刺激小鼠气管

粘膜下腺液体分泌速度。

因此，川陈皮素可能发展成为治疗包括支气管扩张在内的

CFTR相关疾病的先导药物。

关键词：

细胞生物学；囊性纤维化跨膜传导因子；川陈皮素；激活剂

中图分类号：

R96Theactivationeffectofnobiletinoncystic

fibrosistransmonbranceconductanceregulatorchloride

channelYangShuang,YUBo,ZhangYaofang,WangXue,YangHong

(LiaoningProvincialKeyLabroatoryofBiotechnologyandDrug

Discovery,LiaoningNormalUniversity,Dalian,116033)Abstract:

Aim:Aimofthepresentstudyistoinvestigateactivation

effectofnobiletinoncysticfibrosistransmembrane

conductanceregulator(CFTR)chloridechannelactivity.

Method:CFTR-mediatediodideinfluxassayandpatch-clamp

testsweredoneonFRTcel1sstablyco-transfectedwithhuman

CFTRandEYFP/H148Q.Result:NobiletinpotentlyactivatedCFTR

chaloridechannelactivityinadose-andtime-dependentmanner.

TheCFTRblockerCFTRinh-172couldcompletelyreversethe

effect.Primarymechanismstudyindicatedthatnobiletin

activatedCFTRchloridechannelthroughadirectbindingway.

Tnaddition,exvivotestsdoneonmicetracheashowedthat

nobiletintime-dependentlystimulatedsubmucosalglandfluid

secretion.Nobiletinmaypresentatherapeuticleadcompound

intreatingCFTR-relateddiseasesincludingdisseminated

bronchiectasis.Keywords:cellbiology;CFTR;nobiletin;

activator350引言囊性纤维化跨膜传导调整因子(cystic

fibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR)是——种

cAMP依靠的氯离子通道蛋白，也是迄今为止发觉的唯一作为通道的

ATP结合蛋白家族(ATP-bindingcassette,ABC)成员[1]o

CFTR由5个功能结构域组成：

2个由406个连续串联的跨膜区组成的跨膜结构域

(membrane-spanningdomains,MSDs),2个核昔酸结合结构域

(nucleotide-bindingdomains,NBDs),以及一个连接在其之

间的具有多个磷酸基金项目：

国家自然科学基金项目(No.30973577)；辽宁省重点试验室项

目(LS2010094)；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题

(20112136110002)作者简介：

杨爽(1987-01),女，硕士探讨生，膜通道的结构和功能

通信联系人：

杨红(196772),女,博士生导师，膜通道的结构和功能.

E-mail:hyanglnnu@gmail-1-化位点的调整结构

域(R-domain)。

CFTR表达于气管、消化道、生殖道等哺乳动物全部与分泌

汲取相关组织的上皮细胞的顶膜上［2-5］,主要功能是为氯离子跨上

皮细胞转运供应选择性通道，对体内液体转运起至关重要的作用。

CFTR突变会引起CFTR合成、转运以及功能45

505560障碍，到目前为止能引起CFTR突

变的形式可达1300多种，其中第508位phe缺失突变(F508)

是最主要的突变形式之一［6］o

CFTR突变会引发囊性纤维化、支气管扩张、慢性胰腺炎、

肠梗阻、习惯性便秘等多种疾病［7-8］。

川陈皮素又称川皮亭、蜜橘黄素，是从橘果皮中提取的一种

常见的多甲氧基黄铜类化合物。

它具有抗血细胞凝集、抗血栓形成、抗氧化、抗炎、降低

胆固醇等药理作用，对肺癌、胃癌、纤维癌等多种肿瘤具有极强

的抗癌活性［9T0］。

本课题组在前期工作中，利用细胞荧光淬灭模型从自然化合

物中筛选到大量能够有效激活CFTR氯离子通道活性的化合物，其

中包括川陈皮素。

本探讨利用细胞荧光测定模型和膜片钳技术对川陈皮素激活

CFTR氯离子通道的分子药理学机制进行了系统分析，并在离体条

件下探讨了该化合物对小鼠气管粘膜下腺体液体分泌速度的影响。

1材料与方法1.1材料F12Coons细胞培育基、

Forskolin(FSK)、Genistein^IBMX均购于Sigma公司，标准胎

牛血清购于Hyclone(IlyCloneCompany,USA),川陈皮素、

CFTRinh-172本试验室自行合成［11］,其他试剂均为分析纯，野

生型昆明小鼠为吉大二院中心试验室供应。

1.2方法CFTR氯离子通道细胞荧光测定模型的建立及测

定方法1.2.1首先将表达人CFTR的质粒和荧光绿蛋白突变体

YFP-H148Q表达质粒稳定共转染到Fischer大鼠甲状腺上皮细胞

上，然后选择能够稳定表达这两种蛋白的细胞系作为细胞荧光测定

模型在含有F12Coons的细胞培育基中培育［12-13］。

65将FRT上皮细胞细胞悬液置于黑壁透亮的96孔板中，

每孔细胞数量为20,000,然后将细胞放入二氧化碳孵箱中培育

24-36小时（37℃、90%湿度、5%CO2）,直到细胞长成单层后，

再用FluoStar荧光仪测定其氯离子通道功能［14］。

膜片钳技术对野生型CFTR氯离子通道的激活影响的测定方

法1.2.2膜片钳技术测定野生型CFTR氯离子通道活性的方法详

见参考文献［15］。

测定条件为：

70首先将wt-CFTR细胞在24孔板中培育2-4天，然后

利用膜片钳EPC10放大器（HEKA,Lamberecht/Pfalz,Germany）设

置电流频率，玻璃吸头的电阻为3-5兆欧姆，再利用八极Bessel

过滤器将电流过滤成100Hz,之后以500Hz的频率在磁盘上将细

胞膜捕获，测定膜电位在-50和+50mV之间变更时膜电流变更。

-2-1.2.3小鼠气管粘膜下腺液体分泌速度

的测定方法7580将昆明小鼠（8-10周，重25-35g）引

颈处死，快速取出气管粘膜区域。

用Krebs-Henseieit(KH)将气管粘膜区域冲洗干净、去除

血块后，粘膜侧朝上展平固定于KH液饱和的海绵上，然后放入

二氧化碳孵箱中孵育10T5min。

用棉球将粘膜上的粘液轻拭干净后加入50L激活剂，再在气

管表面上覆盖30L水饱和矿物油，置于解剖镜下连续视察5min并

用照相机拍摄记录单个粘膜下腺液体的分泌状况口6］。

选择呈圆形的液滴图像，用ImageJ测量半径，假设液滴为

规则的球体，计算出液滴体积，与时间作比即是单个粘膜下腺液体

的分泌速度。

数据统计分析1.2.4试验数据利用GraphPadPrism统计

软件进行分析，除代表性荧光记录曲线外，其余数据均用平均数

标准差(XS)表示。

2结果2.1川陈皮素对CFTR氯离子通道的激活作用85

9095本次试验以PBS为阴性比照，

Genistein为阳性比照，利用荧光测定细胞模型对川陈皮素激活

CFTR氯离子通道活性进行分析，结果见图E

用不同浓度的川陈皮素激活CFTR氯离子通道的开放，结果

显示，6.25molLl的川陈皮素可以激活通道，而且随着川陈皮素浓

度的增大激活作用也相应的增加，呈现出剂量效应关系，当浓度达

到400molLl时激活作用达到最大。

图1川陈皮素对CFTR氯离子通道

的激活作用的荧光淬灭分析结果。

A.川陈皮素对wt-CETR-FRT细胞激活作用的代表性荧光猝灭

的曲线。

其中，PBS为阴性比照，Genistein为阳性比照；全部试验

结果均是在lOOnmolLlFSK存在的条件下测得。

B.川陈皮素对CFTR氯离子通道激活作用的剂量效应关系曲

线。

剂量效应图显示川陈皮素和Genistein对CFTR氯离子通

道的激活作用呈现剂量依靠特性(XS,n=3)0

Fig.1TheactivationeffectsofnobiletinonCFTR

chloridechannelactivity.(A)Typicalfluorescencequenching

curvesofYFP/H148QfluorescenceinCFTR-expressingFRTcells

stimulatedbyindicatedconcentrationsofnobi1etin.PBSwas

usedasanegativecontrolandgenisteinwasusedasaposition

control.Testsweredoneinthe100presenceoflOOnmolLlFSK.

(B)Dose-responserelationshipsshowingtheactivationofCFTR

bynobiletinand-3-genistein(XS,n=3).

2.2膜片钳记录川陈皮素对野生型CFTR氯离子通道的激活影响我

们进一步利用膜片钳技术探讨了川陈皮素对在野生型CFTR氯离子

通道活性的影响。

测定时，首先加入25UmLlPKA和ImmolLlATP使CFTR充

分磷酸化，然后以ImmolLl105ATP产生的电流作为比照组，分

析比较了不同浓度川陈皮素存在的条件下，CFTR介导的C1-电流。

结果如图2所示，与比照组相比，20niolLl的川陈皮素能使

CFTR氯离子通道的电流提高35%左右；当川陈皮素的浓度为

40molLl时，其对CFTR氯离子通道的激活作用达到最大值，此

时CFTR氯离子通道的电流提高大约80%左右。

在去除川陈皮素后，上述电流快速复原正常，结果说明川陈

皮素对CFTR的激活作用是可逆的。

110图2川陈皮素对CFTR的氯离

子通道激活作用的膜片钳分析结果。

图A显示利用膜片钳技术记录不同浓度川陈皮素对CFTR氯

离子通道电流的影响。

图B显示川陈皮素对CFTR氯离子通道的激活作用呈现出剂

量115效应关系。

图中显示膜片钳记录了川陈皮素对CFTR通道活性是呈现剂量

依靠性且作用是可逆的u

Fig.2TheeffectsofnobiletinonCFTRactivityinpatches

clamprecordings.(A)RepresentativetracesofCFTR-mediated

Cl-currents.Thepatcheswereactivatedwith1mmolLlMgATP

plus25UmLlPKA,thenfollowedby1mmolLIMgATPplusindicated

concentrationofnobiletin.(B)Averagedcurrentfrom

indicatednumberofsimilarrecordingsasinnormalizedto

basiccurrent(1mmolLlMgATPcontrolgroup).120

1252.3川陈皮素对CFTR氯离子通道活性的特异性分析

CFTRinh-172是已知的CFTR氯离子通道特异性阻断剂。

在试验中，我们分别检测了在不同浓度的CFTRinh-172存在

的条件下，川陈皮素对CFTR氯离子通道激活作用的影响。

结果表明，川除皮素对CFTR氯离子通道的激活作用能够被

CFTR特异性阻断剂CFTRinh-172抑制，且抑制作用与抑制剂的浓

度呈正相关。

当CFTRinh-172浓度达到lOmolLl时通道活性基本被完全

抑制（见图3）o

-4-图3CFTRinh-172

抑制川陈皮素对CFTR氯离子通道的激活作用。

图中显示200molLl的川陈皮素对CFTR的激活作用在

CFTRinh-172的作用下能够被抑制，且抑制作用随着CFTRinh-172

的浓度的增加也随之增加（XS,n=3）o

130Fig.3CFTRactivationbynobiletinwasreversed

byCFTRinhibitorCFTRinh-172.CFTRinh-172dose-dependently

inhibitedtheactivationofCFTRby200molLInobiletinor50

molLlgenistein.（XS,n=3）.2.4川陈皮素激活CFTR氯离

子通道动力学和可逆性分析利用荧光测定细胞模型对川陈皮素转运

氯离子活性的动力学和可逆性进行分析，结果表135

140明川陈皮素能够在2min时使CFTR氯离子通道达到最大激活

作用（图4A）,在去除川陈皮素后，激活作用能在10分钟之

内彻底消逝(图4B),说明这种激活作用是快速、可逆的。

图4川陈皮素对CFTR激活作用的

动力学分析及动力学分析。

A.川陈皮素对CFTR激活作用的动力学分析S,n=3)o

B.川陈皮素对CFTR激活作用的可逆性分析((XXS,

n=3)o

图中显示在100nmolLl的FSK存在的条件下,200moiL1的

川陈皮素能够在2min内达到最大激活作用；在去除川陈皮素后，

激活作用能在10分钟之内彻底消逝。

Fig.4Character!seticsofwt-CFTRactivationby

nobiletin.(A)KineticsofCFTRactivationbynobiletin.The

145maximumactivationwereacquiredin2minafteraddition

of200molLlnobiletin.(B)ReversaloftheCFTRactivation

afternobiletinwashout.FRTcellswereincubatedwith200molLl

nobiletinfor10minbeforewashout.(XS,n=3).-5-

2.5川陈皮素对CFTR激活作用机制的分析CFTR的激活途径包括

提高CFTR磷酸化水平、抑制CFTR的去磷酸化以及干脆与CFTR

150155160165蛋白相互作用3

种。

目前常用的激活剂有FSK、IBMX和Genistein,并且这三种

激活剂的激活途径互不相同。

FSK通过提高细胞cAMP水平而提高CFTR的磷酸化，IBMX

通过抑制磷酸二酯酶的活性进而抑制CFTR的去磷酸化，而

Genistein则通常被认为是与CFTR蛋白干脆发生相互作用

[17-19]o

CFTR是cAMP依靠性通道，FSK可以提高细胞胞浆内cAMP

的生理水平，我们分别检测在不同浓度FSK的存在下，川陈皮素

对CFTR氯离子通道激活作用的影响。

结果表明，川陈皮素对CFTR的激活作用依靠于FSK,随着

FSK浓度的增加，川陈皮素对CFTR的激活作用也随之增加；在

没有FSK存在的状况下，高浓度的川陈皮素（lOOmolLl）对CFTR

也表现出肯定的激活作用（图5A）。

以5molLlFSK和lOOmolLlIBMX为阴性比照,以5molLl

FSK,lOOmolLlIBMX和25molLlGenistein为阳性比照，用

5molLlFSK,lOOmolLlTBMX和200molLl川陈皮素与细胞孵育

15min后检测对细胞的激活作用的影响。

结果表明，川陈皮素对CFTR氯离子通道的激活作用与FSK

和TBMX有明显的相加作用。

由于FSK和IBMX已经使细胞的cAMP达到饱和状态，说明

川陈皮素对CFTR的激活作用并不影响CFTR的磷酸化，也就是说

川陈皮素可能是通过与CFTR干脆作用来激活通道活性的（图5B）o

本次试验利用细胞荧光测定模型检测川陈皮素在激活CFTR

氯离子通道开放时与Genistein的协同作用。

以5molLlFSK和20moiLIGenistein为比照，结果表明在

FSK和Genistein存在下，川陈皮素对通道的激活作用并没有增

加，说明川陈皮素在激活CFTR氯离子通道时并没有与Genistein

发生协同作用(图5C)o

-6-

170图5川陈皮素对CFTR激活作用机制的分析。

A.川陈皮素对CFTR激活作用的FSK依靠性分析(MeanSE,

n=3)o

B.川陈皮素对CFTR激活作用与FSK和IBMX存在相加效应

的分析(MeanSE,n=3)。

图中显示在5molLlFSK和lOOmolLlTBMX使细胞磷酸化水平

达到最大的状况下，川陈皮素还能提高对CFTR的激活作用但是没

有Genistein的激活作用强。

C.川陈皮素对CFTR激活作用与Genistein协同作用的分析

(XS,n=3)o

175Fig.5Mechanismsofwt-CFTRactivationby

nobiletin.(A)Dose-responserelationshipforFSKdependentof

CFTRactivationbynobiletin.FSK-dependentexperiments

indicatedthatactivationofCFTRbynobiletindependsonCFTR

phosphorylationlevel.Athigherconcentration(lOOmolLl),

nobiletinalsocanactiveCFTRwithoutFSK,thoughitspotency

waslow.(B)AdditiveeffectofnobiletinwithFSKandIBMX.

CFTRproteinswere180maximalphosphorylatedby5molLlFSKand

lOOmolLlIBMX,noibiletincouldfurtheractivatedCFTR

chloridechannelactivity.(C)Synergyeffectofnobiletinwith

genistein.DatawereexpressedasXSof3independenttests.

2.6川陈皮素对小鼠气管粘膜下腺液体分泌速度的影响CFTR在小

鼠器官粘膜下腺体高表达，在气管液体分泌过程中发挥重要作用。

本试验以185生理盐水为阴性比照，以Pilocarpin为阳性

比照，探讨了川陈皮素对小鼠气管粘膜下腺液体分泌速度的影响。

试验结果显示川陈皮素能够有效地刺激小鼠气管粘膜下腺液体

分泌速度，并且CFTRinh-172能够抑制其分泌(图6)。

-7-图6

川陈皮素对小鼠气管粘膜下腺液体分泌速度的影响。

A.川陈皮素对单个小鼠气管粘膜下腺液体分泌速

190度的影响，(a)生理盐水，(b)lOmolLl川陈皮素，(c)

川陈皮素+100molLlCFTRinh-172,(d)lOmolLlPilocarpin,(c)

Pilocarpin+lOOmolLlCFTRinh-172w

B.川陈皮素川陈皮素对小鼠气管粘膜下腺液体分泌速度的统

计学分析(XS,n=3)o

Fig.6Nobiletinstimulatedsubmucosalfluidsecretionin

mousetracheamucosa.(A)Theincreasingoffluid195droplets

secretedfromsinglesubmucosalglandinbrightfield

micrographs,(a)saline;(b)lOmolLlnobiletin;(c)lOmolLl

nobiletinpluslOOmolLlCFTRinh-172;(d)lOmolLlpilocarpin;

(e)lOmolLlpilocarpinpluslOOmolLlCFTRinh-172.(B)Linear

volumeincreaseofglandsecretionbynobiletinstimulatedthe

submucosal3探讨glandsofmousetrachea(XS,n=6).200

205210本探讨利用细胞荧光测定模型和膜片钳技术确定

了川陈皮素能够以剂量依靠方式特异的激活CETR氯离子通道活

性，这些活性作用具有依靠cAMP、快速、可逆的特点，并被CFTR

特异性抑制剂CFTRinh-172完全抑制。

在动物体外试验中显示川陈皮素可刺激小鼠气管粘膜下腺液

体的分泌且能够被CFTRinh-172抑制，试验结果也进一步说明川陈

皮素能够有效的激活CFTR氯离子通道，所以说川陈皮素有可能发

展成为治疗包括支气管扩张在内的CFTR相关疾病的先导药物。

虽然本试验还不足以系统地对川陈皮素激活CFTR氯离子通

道活性进行深化的探讨，但是通过已有的试验结果显示，川陈皮

素可能是与CFTR蛋白干脆作用来达到激活效果的。

R前可知的CFTR激活途径是通过提高CFTR的磷酸化或抑

制其去磷酸化以及和CFTR蛋白直接结合3种激活途径来发挥作

用的。

激活CFTR氯离子通道需依靠于cAMP的激烈剂，即须耍通

过FSK来提高细胞内鸵的cAMP生理环境来使通道激活。

在没有FSK的状况下，高-8-浓度的川陈皮素

也可以激活CFTR氯离子通道，这说明川陈皮素对CFTR氯离子通

道的构象的变更有肯定的影响。

当FSK和IBMX使细胞的cAMP水平达到饱和状态时,川陈

皮素还可以进一步激活CFTR氯离子通道，说明川陈皮素对CFTR

的激活机制有别于FSK和IBMX,但同时川陈皮素没有与

Genistein发生协同作用，即有可能与Genistein作用机制一样是

通过215220225230235

240245250干脆作用于CFTR蛋白而达到激活作用的。

本探讨通过体内外试验证明了川陈皮素对于激活CFTR是牢

靠、有效的激活剂，为探讨CFTR的结构和功能供应理论价值，也

为进一步治疗CFTR相关疾病机制供应有力的依据。

4结论本文利用荧光淬灭试验和膜片钳技术发觉川陈皮素

以剂量依靠的方式激活CFTR氯离子通道的C1一转运活性，且这

种活性是快速，可逆的，并能够被CFTR特异性抑制剂

CFTRinh-172完全抑制。

初步的分子机制探讨表明川陈皮素是以与CFTR干脆作用来激

活通道活性的。

进一步的探讨结果显示，川陈皮素能够有效地刺激小鼠气管

粘膜下腺液体分泌速度。

因此，川陈皮素可能发展成为治疗包括支气管扩张在内的

CFTR相关疾病的先导药物。

致谢真诚感谢吉大一院中心试验室供应的大力帮助。

[参考文献](References)[1]KunzelmannK.Thecystic

fibrosistransmembranceconductanceregulatoranditsfunction

inepithelialtransport[J].RevPhysiolBiochemPharmacol,

1999,137：

1-70.[2]GregerR.RoleofCFTRinthecolon[J].AnnuRev

Physiol,2000,62：

467-91.[3]RiordanJR,RommensJM,KeremD,etal.

Identificationofthecysticfibrosisgene:cloningand

characterizationofcomplementaryDNA[J].Science,1989Sep

8,245(4922)：

1066-73.[4]BanalesJM,PrietoJ,MedinaJF.

Cholangiocyteanionexchangeandbiliarybicarbonate

excretion[J].WorldJGastroenterol,2006Junl4,,12(22)：

3496-511[5]RiordanJR.CFTRfunctionandprospectsfor

therapy[J].AnnuRevBiochem,2008,77:701-26.[6]DalemansW,

BarbryP,ChampignyG,etal.Alteredchlorideionchannel

kineticsassociatedwiththedelaF508cysticfibrosis

mutation[J].Nature.1991,354(6354)：

526-8.[7]CohnJA,FriedmanKJ,NoonePG,etal.Relation

betweenmutationsofthecysticfibrosisgeneandidiopathic

pancreatitis[J].NEnglJMed,1998Sep3,339(10)：

653-8.[8]PrathaVS,HoganDL,MartenssonBA,etal.

Idenitificationoftransportabnormalitiesinduodenalmucosa

andduodenalenterocytesfrompatientswithcysticfibrosis[J].

Gastroenterology,2000Jun,118(6)：

1051-60.[9]MinagawaA,OtaniY,KubotaT,etal.The

citrusflavoind,nobiletininhibitsperitonealdissemination

ofhumangastricearcinomainSCIDmice[J].JpnJCancerRes,

2001,92(12)：

1322-1328.[10]ChenJ,MontanariAM.Isolationand

identificationofnewpolymethoxyflavoridsfromdancy

tangerineleaves[J],AgricFoodChcm,1998,46(4)：

1235-1238.[11]HEC,ZhangH,SUZ,etal.Synthesisand