医学微生物学实验指导

医学微生物学实验指导

细菌学总论

实验一微生物学实验室常用仪器

熟悉微生物学实验室环境及常用设备，并通过实物概括介绍主要设备的用途、工作原理及使用时注意

事项。

内容：一、显微镜

二、普通电冰箱

三、水浴箱

四、恒温培养箱

五、高压灭菌器

一、显微镜

显微镜是一种贵重仪器。根据实验目的要求不同，可分别选用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差

显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

普通光学显微镜进行细菌形态学检查，普通光学显微镜最为常用•是根据光学透镜成像的原理制成，

能将物体放大1600倍。用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4用“，在最佳条件下显微镜的分辨率为波长

的一半，即0.2nm,而肉眼能看到的最小形象为2mm,故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍，可将

0.2pm的微粒放大成0.2mm,能为人肉眼所见。一般细菌都大于0.2nm,在普通光学显微镜下都能看到。

暗视野显微镜细菌形体微小半透明，未经染色时与周围对比不明显，在普通光学显微镜下不易看清，

圳换装上暗视野集光器，此集光器中央不透光，光线只能从周边斜射出来，故背景视野黑暗无光，但斜射

到菌体上的光线山于散射作用而进人物镜，到达观察者之眼，因而在黑暗的视野中可看到明亮的被检物体。

用暗视野显微镜检查也叫暗现野照明法，这种方法是利用被检物体表面的反射光线和衍射光线观察物

体的，所以只能看到物体的存在和运动，不能认清其构造。在暗视野照明下，虽看不清结构，但可以分辨

0.004pm以上的微粒子的存在。暗视野照明法多用于活细菌和螺旋体不染色标本的检查。

荧光显微镜是以紫外光或蓝紫光为光源，使经荧光素染色的被检标本激发出波长较长的可见光一荧

光，在暗视野中显现出荧光闪烁的被检物体，清晰可见，因紫外光或蓝紫光的波长较短（约为0.2nm）其分

辨率得到进一步提高。

荧光显微镜与普通光学显微镜不同之处有以下三个方面：（1）光源，荧光显微镜通常采用功率为156—

200W的高压汞灯为光源，它能发射丰富的紫外光和蓝紫光。（2）滤光片:包括激发滤片和吸收滤片，能产生

4950A的蓝紫光。（3）暗视野集光器：由于背景暗反差大，观察荧光清晰，对放大倍数高荧光弱的标本也能

进行观察。

相差显微镜人的肉眼，只在光波的波长（颜色）和振幅（亮度）有变化时才能看到被检物体。因活的

生物体多为无色透明，光波通过时，波长和振幅均不发生变化，故普通显微镜检查很难观察清楚；用暗视

野检查也只能看到发光的菌体外形，看不清内部结构。相差显微镜能弥补这两种方法的不足。其原理是利

用被检物体的光程（折射率与厚度的乘枳）之差进行镜检。如被检物体与媒质之间，或被检物体各部分的折

射率或厚度不同，或双方都不同，光线通过时引起光相的差异；相差显微镜通过相差板的光栅作用，改变

了直接光的光相和振幅，将光相的差异转换成光的强弱的差异使细胞某些结构比其它部分深暗，衬托出鲜

明的对此。因此，这种方法不仅不需要标本的染色，还能充分利用物镜的镜口率，是做活体标本检查最好

的方法。

电子显微镜电子显微镜与光学显微镜不同，电镜是利用电子流代替光线，用电子源代替光源，用磁

性线圈代替放大透镜，即电子流为电子透镜所折射，经过两次放大造成最后的像。电子流波长极短，约为

0.05nm,故其放大倍数极高，电镜观察的形象可以投射在荧光屏上显示，也可照相拍摄，还可明磷铝酸负

染色，或金属喷涂投影，增加对比度，使图象更具立体感。电镜的电子速度越快，即电压越高，分辨率越

小。如在电子流的通路上有游离气体分子，就好象光镜上有尘埃一样，与电子碰撞使其改变通路引起象的

散乱，因之，镜筒要保持干燥真空状态。故电镜不能观察活的微生物。

二、普通电冰箱

普通电冰箱是实验室最常用的仪器之一，在微生物学实验室中，是用来保存培养基，菌（毒）种、血清

以及检验标本等的一种制冷设备。

使用电冰箱时应注意

1、电冰箱应放通风处，不受日光照射，远离热源（电炉、暖气等），以免影响散热，冰箱背面远离墙

10cm以上，使空气畅通利于散热。

2、应尽量减少开门次数，箱内物品间应留有空隙，需冰冻保存应置于冰盒内。

3、热物品应冷至室温温度，再放入箱内。

4、蒸发器上结霜不宜过厚，冰霜过厚应及时化霜，以免影响热的传导。

5、电冰箱应保持内外整洁。

三、水浴箱

水浴箱也称水温箱，系由金属制成的长方形箱，箱内盛水，箱底装有电热丝，由自动调节温度装置控

制。有37℃和59℃两种恒温水箱，箱盖均呈斜面，使水蒸气凝结水沿边而下，以免水滴落入箱内标本中。

水浴箱通过电炉丝加温，山自动恒温器自动控制，使水浴恒定在实验所需的温度上，为血清学试验常

用的设备。

四、恒温培养箱

简称温箱，又名孵育箱，为培养微生物的主要设备，目前常用的为电热式温箱，箱体为双层铁扳中夹

石棉，前面有圾璃门（内层）和铁门（外层），箱内有数层隔网，箱顶装有温度计，箱壁装有温度调节箱,

箱底夹层中安装有电炉丝串连成电热箱，接通电源，发热器产热，借助温度调节器的自动调节维持箱内的

恒定温度。

五、高压灭菌器

高压灭菌器也叫高压消毒锅，是应用最广、效果最好的灭菌器，可用于不怕高温破坏的培养基、生理

盐水、废弃的培养物以及手术器械、手术敷料、手术衣等的消毒灭菌，高压灭菌器有手提式、直立式及卧

式等多种，但其结构与灭菌原理基本相同，以手提式高压灭菌器为例，简介如下：

手提式高压灭菌器为一种携带方便的小型灭菌器。其结构为一金属厚壁圆筒，上方有一金属厚盖，盖

周围装有螺旋，借以紧闭锅盖，使蒸汽不至外溢，盖上装有压力表、安全活塞及排气门，锅内有一托架。

使用时锅内加入蒸镭水，放入要灭菌物，加盖紧闭，然后加温至5磅，打开排气门放出冷气，关好气

门继续加温至气表指针指15磅温度为121.3℃时,维持15分钟，缓缓放出蒸汽，即达灭菌目的。

灭菌时应注意：（1）锅内装物品不应过紧；（2）注意排出冷气，否则气压表虽已达15磅，温度达不到

121.3℃,不能保证灭菌效果：（3）灭菌后排气时不能过急，以免容器中液体外溢或引起破裂；（4）不耐高热

高压之物品，不能用此法灭菌。

实验二显微镜油镜使用法

观察细菌形态，需要放大，过去的实验课观察标本时，多用低倍镜、高倍镜放大。观察细菌标本时，

必须用放大倍数更高的油镜才能清楚地看到细菌形态特点。因之微生物学实验主要使用油镜。

油镜的特点是前透镜很小，油镜头的标记也因厂牌不同而异，一般多刻有放大率如（90X,100义）、镜

口率（N.A=L25或1.30）、Oil,国产镜头刻“油”字等。

内容：油镜的标记，油镜的使用法

油镜用油的原理，油镜的保护

一、实验目的与原理

熟练地掌握显微镜油镜的使用和维护方法。

油镜可以使标本放大1000-2500倍，研究细菌形态必须用油镜。油镜观察时，在标本与镜头之间必

须滴加镜油，否则视野不清。原因是油镜前透镜很小，光线通过玻片标本后在空气中发生折射，进入镜头

的光线少，致使视野暗物象不清。如在标本与镜头间加一滴（切勿散开）与玻片折光率（N=L52）相近的

香柏油（N=1.515）则进入镜头的光线增多，视野明亮物象清晰（图1）,滴油又能增加油镜孔径数值，提

高显微镜的分辩率等。

图1油镜加香柏油的原理

二、实验材料

普通光学显微镜（以卜简称显微镜）

镜油（香柏油）

擦镜纸

被检细菌标本片

三、实验方法

（-）对光：将标本（涂面向上！）置于载物台上，勿将镜台倾斜，以免液体标本和镜油流出。用低

倍镜对光，左眼通过目镜观察，用手调节反光镜（天然光源用平面镜，人工光源或光源弱的地方用凹面反

光镜），使视野光亮均匀。检查染色标本用强光（将集光器升到最上，光圈完全打开），检查不染色的活体

标本则宜用弱光（集光适当下降，光圈适当缩小）。

（-）调节焦距：

1、于标本上滴加镜油一滴（不要多加！使呈滴状切勿散开），然后用眼从侧面观察，转动粗螺旋，

使载物台缓缓上升（或油镜头缓缓下降），至油镜浸入油中接近玻片为止（注意调节粗螺旋时不要用力过

猛、过急、以免损坏镜头或压坏标本。）

2、左眼通过目镜观察，同时再缓缓转动粗螺旋下降载物台或上升油镜头，当见到模糊图象时，转动

细螺旋，上下调节即可见到清晰的物象。然后一边移动标本片，•边观察，寻找理想的视野仔细观察。

观察标本时，两眼宜同时睁开。减少眼睛疲劳。最好用左眼观察，右眼配合绘图和记录。

（三）显微镜油镜的保护

1、关于显微镜的•般保护法不再重述。

2、油镜用毕，先将油浸镜上提，取下标本片，然后以擦镜纸拭去香柏油，（不许用手、布或其它纸

张擦拭。）如油己干可用擦镜纸沾少量二甲苯擦净，并立即擦去二甲苯。因透镜片是用胶纸粘固的，二甲

苯能溶解胶质，日久镜片将移位或脱落。

实验三细菌的形态观察

内容：一、细菌的基本形态；球菌、杆菌、弧菌

二、细菌的特殊结构：荚膜、鞭毛、芽胞

一、实验目的与原理

认识与记忆细菌的基本形态及特殊结构特点。

各种细菌在一定条件下，均维持一定的形态和结构。细菌的形态与结构是鉴别细菌种类的根据之一，细菌

结构又与其致病性强弱，免疫发生机理均有一定关系。

二、实验材料

1、显微镜

2、观察标本

(1)球菌、葡萄球菌、链球菌涂片标本

(2)杆菌：大肠杆菌、枯草杆菌涂片标本

(3)弧菌：水弧菌涂片标本

(4)荚膜：肺炎双球菌荚膜标本

(5)鞭毛：伤寒杆菌或变形杆菌鞭毛标本

(6)芽胞：破伤风梭菌芽胞标本

三、实验方法与结果

在玻片标本的正面，滴加镜油，用油镜观察。

1、注意观察细菌基本形态(1、2、3号标本)，比较其形状、大小、排列及染色性。

2、注意辨别细菌特殊结构。

(1)观察4号标木荚膜的特点，如大小、颜色、与菌体的关系。

(2)观察5号标本鞭毛的特点，如鞭毛的形态、数目及位置。

(3)观察6号标本芽胞，注意芽胞的形状、颜色及位置。

3、左眼观察标本的同时，右眼将图画在实验报告纸上，并加以适当地描述。

四、实验报告

图示细菌基本形态及特殊结构，并加以适当描述。

实验四细菌动力显微镜检查法

细菌鞭毛与其动力有关，有无鞭毛，细菌的运动方式不同，依其运动特点可间接判定细菌有无鞭毛，

也是鉴定细菌方法之一。

证明细菌有无鞭毛，除显微镜直接观察其运动特点外，还可以通过鞭毛染色法直接观察有无鞭毛及其

特点，也可以通过半固体穿刺培养法间接证明。

本实验介绍的方法中，以压滴法最简单，较为常见。

内容：一、悬滴法

二、压滴法

三、暗视野显微镜检查法

一、实验目的与原理

了解细菌动力的显微镜检查法，观察有鞭毛与无鞭毛菌运动的特点。

有鞭毛的细菌运动称真正运动或固有运动，其特点是细菌从一个地方游到另一个地方，可以改变位置,

无鞭毛的细菌运动叫布朗运动，特点是不能改变位置，只在局部闪动，是因液体分子的冲击，致使细菌在

局部颤动，这种运动也称分子运动。

二、实验方法及实验结果

(一)悬滴法

1、材料

(1)菌种：变形杆菌、葡萄球菌8—12小时幼龄培养物。

(2)凹玻片、盖玻片、凡士林。

(3)显微镜

图2悬滴法(正面及侧面)

2、方法

(1)取洁净凹面玻片一张，在凹窝周围涂以凡士林(图2)

(2)取-环变形杆菌或葡萄坏菌培养物，放于干净的盖玻片中央。

(3)将涂凡士林的网面载物片反转(凹向下)，凹窝对准盖玻片的菌液滴置于其上，粘住盖玻片后

再反转凹面载片(此时液滴悬于盖玻片下)用接种环柄轻压盖片周围，使与凹窝边缘粘紧。

(4)凹面载片置于镜台上，先以低倍物镜观察(聚光器下降，使视野稍暗)找到液滴边缘后，将边

缘移到视野中央，再换高倍镜观察，上下转动微螺旋，即可看到在较喑的视野中有反光较强的闪动或流动

的菌体。

3、结果

变形杆菌有鞭毛，有改变位置的运动，即真正运动。

葡萄球菌无鞭毛，只在局部闪动，即布朗运动。

(-)压滴法

1、材料

(1)菌液同前。

(2)载物玻片、盖玻片、显微镜等。

2、方法

(1)用接种环取菌液置于洁净的载物玻片中央。

(2)将擦净的盖玻片置于菌液上，覆盖时，先用盖片一边接触菌液(或先使中央与液滴接触)缓缓

放下盖片，防止玻片间产生气泡(否则视野过亮影响观察结果)，滴加菌液量以加盖片后无菌液溢出盖片

为度。

(3)将载片置于镜台上，用低倍物镜找到标本，再换高倍物镜观察。

3、结果：同悬滴法。

(三)暗视野显微镜检查法

暗视野显微镜检查主要用于不染色标本的活体细菌、螺旋体等的形态与动力观察，尤以观察活螺旋体

用暗视野观察效果更佳。

暗视野检查法是将普通光学显微镜上明视野集光器换上暗视野集光器即可，这种集光器的特点是透镜

中间不透光，光线只能从周围斜射在玻片标本上。因光线不能直接进入镜筒，故视野是暗的。但斜射到细

菌等微粒上的光线，由于散射作用而发出光亮反射到物镜内，故可在黑暗的视野中看到发亮的菌体，如夜

空的星星一样，点点发光，极易观察，但不能观察内部微细结构。

1、材料

(1)菌种：牙垢

(2)载物片(厚1.2mm以下)、盖片(0.16mm以下)及生理盐水等。

(3)暗视野显微镜(或普通光学显微镜、暗视野集光器和特制镜头)、光源。

2、方法

(1)载片上加生理盐水一滴，用牙签取牙垢少许于生理盐水中混匀，覆以盖片。

(2)在暗视野集光器上滴加镜油一滴，然后将次台稍向下移。

(3)将制好的标本置于载物台上，缓缓上升集光器使镜油与载物玻片下面接触，注意切勿产生气泡。

(4)用低倍物镜对光，当视野中出现圆形光环时，转动集光器上的调节柄，将光环移至视野中心。

(5)在盖片上滴加镜油，以油镜观察。

3、结果

在黑暗的视野中，菌体光亮，形状清晰，螺旋体的螺旋及运动方式，清晰可见。

实验五细菌的染色标本检查法

形态学检查是鉴定细菌的重要一环。但细菌个体小，无色透明，不染色在镜下不易观察清晰，使菌体

着色后，即可在镜下清晰地观察其形态特征，有助于菌种的鉴定。

进行细菌染色时因其等电点低（PH2-5）,常用美兰、复红、结晶紫等碱性染料，易于着色。

染色方法有单染色与复染色之分。只用一种染料使细菌着色的方法称单染色法；用二种以上染料染色

的方法叫复染色法，主要有革兰染色法、抗酸染色法；此外还有多种特殊染色法。

内容：丁涂片制备及革兰染色法

二、抗酸染色法

一、涂片制备与革兰染色法

（一）实验目的与原理

初步掌握细菌涂片标本的制备法及革兰染色方法。

革兰染色原理尚未完全明了，可能与下述三个方面有关：

（1）革兰阳性菌等电点（PH2-3）比阴性菌等电点（PH4-5）低，一般染色时溶液的酸碱度在PH7.0

左右，故阳性菌较阴性菌带有较多的负电荷，与碱性染料结合力较强，结合的染料较多，不易脱色。（2）

革兰阳性菌细胞内有某种特殊的化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料一媒染剂

复合物相结合，使已着色的细菌不易脱色。（3）革兰氏阴性菌细胞壁通透性高，脱色剂（酒精）较易通过

细胞壁，将碘和染料的复合物溶解洗出，容易脱色，而阳性菌则由于细胞壁通透性低不易脱色，保留了紫

色。

（二）实验材料

1、菌种：大肠杆菌和葡萄球菌的混合液。

2、染液：革兰染色液

3、显微镜、载物玻片及接种环等

（三）实验方法

1、染色涂片制备法：涂片厚薄适度，否则效果不好。

（1）涂片：取洁净载物玻片一张，点燃酒精灯，左手持菌液试管，右手以持手笔方式拿接种环，在

火焰外焰中烧灼灭菌后取混合菌液一环，轻轻涂于玻片的偏中央，涂面直径1厘米左右，厚度适宜均匀（以

透过涂血能看清字迹为宜）。接种环于火焰上再次烧灼灭菌后放还原处。

（2）干燥：涂片最好在空气中自然干燥，如欲加速干燥，可将涂面向上，距火焰稍远处烘干，切忌

紧靠火焰，以防菌体变形，无法观察。

（3）固定：涂片干燥后，涂面向上在火焰最热部分往返通过三次（一般钟摆速度）即可。固定的目

的是杀死细菌，使菌体蛋白凝固与玻片粘附较牢，改变对染料的通透性（一般染料难于进入活细胞内）使

之容易着色。

2、革兰染色法

①初染：在已固定好的涂片上滴加结晶紫液1一2滴（以盖满涂面为度），染1分钟后，用水轻轻冲洗。

②媒染：加卢戈液1一2滴，作用1分钟后，水洗。

③脱色：滴加95%酒精2—3滴，轻轻侧动玻片（以助脱色），使酒精流去，再滴加酒精，如此反复，

直到流下的酒精无色或呈淡紫色为止，一般约20〜30秒钟，及时用水徐徐冲洗。

④复染：滴加沙黄液1—2滴，染色2分钟，水洗。

⑤待干或用滤纸吸干（一定要吸干！）用油镜检查。

3、实验报告：记录革兰染色方法、结果，绘图并进行分析。

二、抗酸染色法

（一）实验目的与原理

分枝杆菌属均具有抗酸性，抗酸染色法是主要用于分枝杆菌属染色的一种鉴别染色法。

染色原理一般认为，石炭酸与复红是按分配系数分布于细菌、染色液和脱色剂中。分枝杆菌含脂类较多，

石炭酸与染料在菌体内保留的较多。脱色时，溶于抗酸菌细胞内的量也较溶于脱色剂中为多，故菌体保留

有颜色，而非抗酸性菌细胞内的石炭酸与染料易离开菌体，不被着色。此外，抗酸染色与细菌细胞壁的完

整性也有关系，如因机械作用或自溶而细胞破裂时，抗酸染色性消失。抗酸菌细胞壁能限制染料进入体内，

因此染色时须加温，以促进细菌着色。

常用的抗酸染色法是萋一纳氏染色法

（二）实验材料

1.菌种：卡介苗和变形杆菌混合液。

2.液：石炭酸复红，3%盐酸酒精，碱性美兰液

3.载物玻片，显微镜等。

（三）实验方法

1、用卡介苗、变形杆菌混合菌液如前法制备涂片，干燥固定。

2、染色法

（1）在涂面上加满石炭酸复红液，在微火上加热使产生蒸汽但勿使煮沸，防止玻片爆裂•为防止烤

干，随时补加染液，维持5分钟，待冷水洗。

（2）滴加3%盐酸酒精脱色30〜60秒钟，轻轻摇动玻片，直至无红色流下为止。然后水洗。

（3）用碱性美兰复染60秒，水洗、吸干后，油镜检查。

（四）实验报告：图示抗酸染色结果。

实验六细菌的人工培养

内容：一、常用培养基的制备原则

二、细菌培养的接种方法

细菌分离培养接种法

细菌纯培养接种法

三、细菌生长状态观察

一、常用培养基的制备原则

（-）实验目的与原理

了解细菌培养基的制备原则和基本程序，熟悉常用培养基的种类与名称。

人工培养细菌时除了需要合适的温度、气体外，最重要的是给细菌提供所需的营养物质，这种营养物

的制品称为培养基。

（二）方法

1、培养基的制备原则：

①适当的营养成分。②合适的酸碱度。③配制后经灭菌后方可使用。

2、培养基配制的基本程序

按一定配方称量各种物质一溶解一测定及调整PH一滤过一分装一灭菌、备用。

3、常用培养基的种类：

按用途可分为

（1）基础培养基：含有细菌所需要的最基本营养成份，可供大多数细菌生长。最常用的是肉汤培养

基与普通琼脂养基。

（2）营养培养基：在基础培养基中加入•些血液、血清等营养物质，可供营养要求较高的细菌生长,

如血琼脂平板。

（3）鉴别培养基：利用各种细菌分解的作用物及其代谢产物的不同，可应用含有一定作用物和指示

剂的培养基来培养细菌，作鉴别细菌之用，如糖发酵培养基。

（4）选择培养基：是利用细菌对各种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入一定的化学物质，抑

制非目的的细菌生长，有利于需要分离细菌的生长，如SS琼脂平板。

（5）厌氧培养基：厌氧菌必须在无氧的环境中才能生长。造成厌氧环境的方法较多，如在培养基中

加入动物组织（如肉渣）或还原性化学物质（如筑基乙酸钠、半胱氨酸等），并在培养基表面用凡士林或

石蜡封住，使与外界空气隔绝。常用的厌氧培养基有肉渣（庖肉）培养基。

按物理性状可分为

（1）液体培养基；

（2）固体培养基，在液体培养基中加入2〜3%琼脂。固体培养基倾倒平皿上即成“平板”，倾入试管

内即可制成“斜面培养基”;

(3)半固体培养基：在液体培养基内加入0.2〜0.5%琼脂。

二、细菌人工培养的接种方法：

(一)细菌分离培养接种法一平板划线分离培养法

自然界中，病人被检材料(痰、便、脓汁及病灶)中常有多种细菌混杂在一起，欲证明材料中有无某

种细菌存在或专门研究其中某一种细菌时，必须先使各种细菌分散开后，方能获得某种单一细菌的培养物,

这种技术称为分离培养接种技术。方法有多种：如平板划线法，平板倾注法及动物接种分离法等，前者最

为多用。

1、实验目的与原理

初步练习平板划线分离细菌的方法。使用混杂在一起的细菌分散生长。

将粘有混杂菌材料的接种环，从平板培养基表面的一点开始反复而不重叠地连续划线，随着划线的延

长，接种环上粘有的细菌逐渐减少，至划线的最后部分细菌可单个地留在培养基上生长繁殖，形成单个菌

落。

2、实验材料

(1)菌种：白色葡萄球菌和大肠杆菌的混合液。

(2)普通琼脂平板培养基，接种环等。

3、实验方法

(1)右手持接种环在火焰上灭菌待冷(约2〜5秒钟)取一环菌液。

(2)左手抓握平板培养基，微开皿盖，伸入接种环将材料涂于培养基“甲”部(图3—1,3-2)(.

图3-1平板区划线法图3-2陪养后菌落的散布情况

(3)烧灼接种环冷却后，通过“甲”部左右反复连续密划线(不重叠)并向下移，至培养基一半的

地方如图“乙”部。

(4)再烧灼接种环待冷，将培养基逆时针转90度，接种环通过“乙”部，再划线至培养基所余的一

半，如图“丙”部。

(5)如上法灭菌，将培养基再逆时针转90度，通过“丙”部反复划线，划完最后的“丁”部。

(6)划完，盖好皿盖，并在皿底部贴好标签，说明接种者班组、姓名，培养皿倒置，送温箱中培养。

(7)37℃24小时后取出，观察菌落的大小、形状、边缘、表面结构、颜色、透明度等性状。

(二)细菌纯培养接种法

细菌分离成纯种培养后，常需接种至各种有关培养基，以进一步测试其生化反应等生物学性状。根据

培养基的物理状态不同，纯种接种法有斜面培养基接种、液体培养基接种和穿刺接种法三种。

1、斜面培养基接种法：主要用于纯培养及保存菌种。

①菌种：大肠杆菌18〜24小时琼脂斜面培养物。

②培养基：琼脂斜面培养基。

(2)实验方法

图4斜面培养基接种法

①左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的培养基管，使菌种管位外，培养基管位

里。斜面部均应向上，管口稍高，以免管底凝固水浸湿培养基表面或沾湿棉塞。

②右手拇、食指先转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。

③右手持接种环，烧灼灭菌，柄部也要迅速通过火焰2〜3次杀灭表面的杂菌，灭菌后拿在手中，勿与

其它物接触。

④以右手无名指与小指拔取菌种管棉塞，再用手掌与小指拔取待接种管，随后将两管管口迅速通过火

焰火菌。

⑤用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取少许菌苔，退出管后再伸入待接种管，自斜面底

部轻轻向上部蜿蜒划线或在斜面作上下涂布(勿触破培养基表面，沾菌的接种环进出试管时不应触及试管

内壁)。

⑥接种毕，接种环火焰灭菌后放下。两管口迅速通过火焰2〜3次灭菌，先将指掌间棉塞塞入接菌管内，

后将无名指小指间棉塞塞入菌种管上，将管放回原处。

⑦37℃孵育18〜24小时，观察生长情况。

2、液体培养基接种法：主要用于增菌培养及检测细菌的生化反应。

①菌种：大肠杆菌18〜24小时斜面培养物。

②培养基：肉汤培养基。

(2)实验方法

①如斜面培养基接种法，左手握持菌种管及待接种管。

②接种环火焰灭菌，伸入菌种管取少量菌苔，再伸入肉汤管中在接近上面液面管壁上轻轻研磨（图5）

并沾取少许肉汤调和，使菌混于肉汤中。

③接种毕，接种环火菌后放下。分别塞好棉塞（方法同前），37℃孵育18〜24小时，观察生长情况。

图5液体培养基接种法

3、半固体培养基接种法

制成呈柱形直立于试管中的半固体培养基，应用穿刺法接种。

（1）实验材料

①菌种：大肠杆菌及白色葡萄球菌18〜24小时斜面培养物。

②培养基：半固体琼脂培养基

③接种针

（2）实验方法

①左手握持菌种管及待接种管（方法同前）

②右手持接种针火焰火菌，挑取少许菌苔，于待接种培养基中心垂直插入（图6）近管底处，然后转

动接种针原路退出。

图六半固体培养基接种方法

③接种毕，接种针灭菌后放下，分别塞好棉塞。37℃孵育18〜24小时，观察有无细菌生长，细菌有无

动力。

三、细菌生长状态观察

细菌种类不同，在培养基上的生长状态也不相同。通过观察细菌生长状态，有助于鉴定细菌。

1、琼脂平板上菌落观察：一个细菌在固体培养基上，经过一定时间的生长繁殖之后，所形成的肉眼

可见的细菌集团，称为菌落。很多菌落连在一起，融成一片，称为菌苔。由于细菌种类不同，以及培养基

的成分不同，形成的菌落的特点也不同，可呈现一定的形态、色泽等，有助于鉴别细菌。因此，应当对菌

落进行认真观察。其观察要点如下：

①大小：以直径（mm）表示之，1mm左右为小菌落，2——3mm为中等大菌落，3mm以上为大菌落。

②形成：圆形、卵圆形及不规则形。

③边缘：整齐或不整齐、锯齿状、毛发状等。

④表面：光滑、湿润、皱纹、干燥等。

⑤隆起度：扁平、凸起、中心凹陷等。

⑥透明度：透明、半透明、不透明。

⑦颜色：无色、白色、黄色等。

⑧溶血性：在血平板上产生溶血毒素的细菌，可以使培养基中的纣细胞破坏溶解，可分为完全溶血、

草绿色溶血及不溶血。

根据菌落的特点，可分为光滑型（S型）菌落和粗糙型（R型）菌落。S型菌落为圆型、边缘整齐，

表面光滑、湿润。R型菌落与之相反。

2、斜面上生长状态观察：可见有均匀一致的菌苔，如有不同的菌落出现，则表明污染了杂菌。

3、液体培养基中生长状态观察：未培养前的液体培养基多为清彻透明的。接种细菌后，由于细菌种

类不同，可有以下三种生长形式.

①混浊：液体变为混浊。

②菌膜：液体澄清，表面有一薄膜。

③沉淀：管底有沉淀物。

4、半固体中生长状态观察：无鞭毛（无运动）的细菌，经培养后仅沿穿刺线生长，培养基清亮。有

运动的细菌，沿穿刺线向外扩散，穿刺线摸糊不清，培养基混浊。

四、实验报告

记录普通琼脂平板、斜面、半固体培养基和液体培养基的培养结果。说明有何实际意义。

实验七细菌代谢产物观察

细菌的新陈代谢是由酶完成的，不同种细菌的酶系统不同，分解物质能力及其代谢产物也均有差别。

临床上常通过测定代谢产物，借以推定该菌有无特殊酶的存在，以助细菌的鉴定。

内容、单糖发酵试验

二、V、P试验

三、M、R试验

四、靛基质试验

五、硫化氢试验

一、单糖发酵试验

（-）实验目的与原理

了解糖发酵试验方法及发酵结果的解释。

因不同种细菌具有不同的糖髓，对糖的分解能力不同，对同一种糖有的能分解，有的则不能分解；对

糖分解后有的只能产生酸，有的则能产酸、产气。如发酵管变红色（含酸性复红指示剂）证明分解糖后产

酸，如倒置小玻管中有气泡出现，则证明产生气体。

（二）实验材料

1、菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌斜面培养物

2、培养基：乳糖及葡萄糖发酵管

（三）实验方法

1、用接种环将大肠杆菌、伤寒杆菌分别各接种于葡萄糖及乳糖发酵管中（方法同前）。

2、37孵育18〜24小时,取出观察结果。

（四）实验结果__________________________________________________________________

葡萄糖乳糖

大肠杆菌©©

伤寒杆菌+—

注“+”：产酸：+：产酸：产气：“一”：未分解。

二、VP试验

（一）实验目的与原理

了解通过糖发酵鉴别大肠杆菌与产气杆菌。

细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，产气杆菌能使丙酮酸脱竣，生成中性乙酰甲基甲醇。该物质在碱性溶液

中被氧化生成二乙酰。二乙酰又与培养基中含呱基化合物发生反应，生成匆色化合物，是为VP试验阳性。

大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，即不能生成红色化合物，VP试验阴性。

2CH.COCOOHfCH3coeHOHCH?+2CO2

丙酮酸乙酰甲基甲醇

-2H

CH.COCHOHCH.------------>CH.COCOCH,

33+KOH33

二乙酰

0=C—CH3NHZN=C-CHa

ru+HN=C〈----HN-|+2H0?

°'=C-NH?N=C—CHa

二乙酰胭基红色化合物

（二）实验材料

1、菌种：大肠杆菌、产所杆菌18〜24小时斜面培养物。

2、葡萄糖蛋白陈水培养基。

3、40%KOH溶液（含0.3%肌酸）。

4、6%a一蔡酚酒精溶液（促进反应）。

（三）实验方法

1、将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖蛋白陈水中。

2、37℃孵育48小时，取出后各加入1毫升KOH和a—荼酚液，摇匀，静置5—15分钟内出现红色

者为阳性。

（四）实验结果

产气杆菌培养液呈红色一VP试验阳性

大肠杆菌培养液无色一VP试验阴性

三、甲基红（MR）试验

（-）实验目的与原理

「解细菌分解葡萄糖后培养基中的最后酸碱度的测定方法，是区别肠道杆菌种类的一个指标。

甲基红是一种指示剂，PH4.5以上显红色，PH5.4以上显黄色。若细菌分解糖后产酸太少或产酸后又

不断转化成其他物质（醇醛酮、气体和水等）时，则酸碱度变化不大，培养基显黄色，是为MR试验阴性,

反之则为阳性。

（二）实验材料

1、菌种：大肠杆菌、产气杆菌18〜24小时琼脂斜面培养物。

2、培养基：葡萄糖蛋白陈水培养基

3、甲基红试剂

（三）实验方法

1、将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖蛋白陈水中。

2、37℃孵育2〜3天后取出，各滴加甲基红试剂2〜3滴，立即观察。

（四）实验结果

大肠杆菌产酸多，培养液PH4.5或更低，呈红色一甲基红试验阳性。

产气杆菌使二分子丙酮酸生成一分子中性的乙酰甲基甲醇，酸类减少，培养液PH较高（PH5.4以上）,

培养液呈黄色一甲基红试验阴性.

四、靛基质试验

（-）实验目的与原理

了解细菌有无色氨酸酶的测定法，也是区别肠道杆菌的一个指标。能合成色氨酸酶的细菌，分解蛋白

陈水中的色氨酸生成靛基质，该物质本身无色，加入对二甲基氨基苯甲醛时，生成玫瑰靛基质，呈红色,

是为靛基质试验阳性。无色氨酸酶的细菌，呈阴性反应。

8

CH2CHNH2COOH

+乩0-»+NH+CH3coeOOH

N

NI

I色氨酸H

H靛基质

N

I

H

靛基质

玫瑰靛基质

（二）实验材料

1、菌种：大肠肝菌，产气杆菌18〜24小时斜培养物。

2、培养基：蛋白豚水培养基。

3、试剂：柯氏试剂（对二甲基氨基苯甲醛）。

（三）实验方法

1、将两种细菌各接种于1支蛋白陈水中。

2、37℃24〜48小时孵育后，每管各加数滴柯氏试剂，振荡后呈红色者为阳性。

（四）实验结果

大肠杆菌有色氨酸酶，分解色氨酸产生靛基质，培养液呈红色。

产气杆菌无此前，培养液无色，靛基质试验阴性。

五、硫化氢试验

（-）实验原理

了解检测细菌产生硫化氢的方法

能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，与铅盐（醋酸铅）或铁盐（硫酸亚铁）反应生成黑褐色硫化铅（或

硫化铁）沉淀物。沉淀物愈多，表示生成的硫化氢愈多。

COOH-CHNH2CH2S-SCH2CHNH2coOH+H2+

4H2。->2H2S+2N”3+2HCOOH+2cH3coOH

H2S+Po（CH3co0）2TpbSJ+2CH3coOH

硫化铅

（黑色沉淀）

H2S+FeSO4->FeS+H2SO4

硫化铁

（黑色沉淀）

（-）实验材料

1、菌种：大肠杆菌、变形杆菌18〜24小时斜面培养物。］

2、培养基：醋酸铅培养基。

（三）实验方法

1、沿管壁周围将两种细菌分别接种于醋酸铅培养基中。

2、37℃孵育24小时，观察结果，培养基周围呈黑褐色为阳性，证明产生硫化氢。

（四）实验结果

大肠杆菌不能分解含硫氨基酸，不产生硫化氢，醋酸铅培养基周围不变黑色——硫化氢试验阴性。

变形杆菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢，遇醋酸铅，则沿培养基周围生成黑色的硫化铅——硫化氢

试验阳性。

实验八消毒与灭菌

内容：一、紫外线杀菌作用

二、化学消毒剂碘伏的杀菌作用

一、紫外线的杀菌作用

（-）实验目的与原理

了解紫外经理对不同种细菌的杀菌作用及紫外线的穿透力。

波长240〜300nm的紫外线（UV）具有杀菌作用，其中以265〜266nm的作用最强。紫外线主要作用

于细菌的DNA,是使同一股DNA上相邻的口密嗟通过共价键结合形成二聚体，干扰DNA的复制与转录，

引起致死性突变而死亡。

紫外线的穿透力很弱，一片盖玻片或纸片能吸收大部分紫外线，阻碍其通过。因之，紫外线杀菌只限

于表面的照射。

（二）实验材料

1、菌种：大肠杆菌18—24小时肉汤培养物，枯草杆菌24—48小时肉汤培养物。

2、培养基：琼脂平板

3、灭菌纸片、镶子及紫外线灯等

（三）实验方法

1、取大肠杆菌液数滴，在琼脂平板表面密密涂满整个平板，枯草杆菌同法涂于另一琼脂平面表面，

并在皿底注明菌种。

2、镶子经火焰灭菌后，在两个琼脂平板表面中央各放一块灭菌纸片。

3、打开皿盖，在紫外线灯下约1m处，受紫外线照射30分钟。

4、用镶子取掉黑纸片，弃入消毒液中，盖好皿盖，37℃孵育24小时，观察生长情况。

（四）实验报告：记录实验结果并进行适当的解释。

二、化学消毒剂碘伏的杀菌作用

（-）实验目的与原理

观察消毒剂的消毒效果。

各种消毒剂对细菌的作用机制不同。酚类、醇类使菌体蛋白变性，氧化剂、卤素类、重金属等妨碍某

些酶的活力，而肥皂、去污剂等主要毁坏细胞膜。碘伏为碘与载体的结合物（常为聚乙烯毗咯酮碘）。

二、实验材料

1、碘伏

2、琼脂平板

三、实验方法

1、将琼脂平板用蜡笔划线分二部分，注明“消毒前”与“消毒后”。

2、用任一手指在消毒前平板表面，轻轻涂抹，然后用碘伏消毒同一手指，干后再于“消毒后”平板

表面涂抹。

3、盖好皿37℃温箱培养24小时，观察结果。

（四）实验报告：记录皮肤消毒结果，从中说明什么问题？

实验十药敏试验（单片纸碟法）

一、实验目的与原理

了解药物敏感性试验方法及实践中的重要意义

将待测细菌涂布于平板培养基表面，贴上含一定量抗菌药物的纸片，进行培养。滤纸片吸收培养基中

的水，滤纸片中的药物溶解于水中并向周围扩散，如果接种的细菌对这种药物敏感，则滤纸片周围细菌的

生长会受到抑制，形成没有细菌生长的抑菌环。由于细菌对药物的敏感性不同，故药物抑制细菌生长的程

度（抑菌环直径）也不同，根据抑菌环直径大小可确定其敏感性。

二、实验材料

1、菌种：金黄色葡萄球菌6—8小时肉汤培养物。

2、培养基：普遍琼脂平板。

3、抗生素：含各种抗生素干燥滤纸片（青霉素2单位/片，链、氯霉素，庆大霉素均含10微克/片-）

小镶子、米尺等。

三、实验方法

1、取琼脂平板二块，用蜡笔在皿底均分四部分，并注明四种抗生素及菌别的标记（图7）

图7细菌对抗生素的敏感试验（纸片法）

2、用接种环无菌取上二种菌液各两环，置于相应培养基上，用平行划线法轻轻将菌液均匀地密涂于

培养基表面。

3、用无菌银子取上述四种抗生素滤纸片，轻轻贴于两个培养基相应区内，用镶子稍压使之贴紧。（注

意！每取一药纸片前，均需将锻子火焰灭菌）。

4、皿底向上放于37℃温箱中，培养18—24小时观察抑菌环直径大小，以判定其敏感程度。

四、实验结果

细菌对药物敏感时，在该药纸片周围无细菌生长（该区称抑菌环）。

细菌对药物不敏感，药纸片周围有菌生长。

一般认为抑菌环直径6—10mm为低度敏感；10—15mm为中度敏感，15mm以上为高度敏感。

五、实验报告：记录抗生素抑菌试验结果并分析它在临床上的意义。

附：细菌的生理（综合性实验）

1.示教：细菌在半固体培养基中生长状态观察

2.液体培养基（营养肉汤）分装：每组分装4管

3.液体培养基接种：每组的4管液体培养基分别接种：

枯草芽胞杆菌大肠杆菌白色葡萄球菌白色葡萄球菌+

大肠杆菌

37℃培养18-24小时

枯草芽胞杆菌大肠杆菌白色葡萄球菌白色葡萄球菌+

大肠杆菌

4.观察细菌在液体培养基的生长现象：

混浊、菌膜（表面生长）、沉淀（示教：链球菌）

枯草芽胞杆菌'

5.紫外线的杀菌作用（先做这个，并

进行紫外线照射30分钟）

'大肠杆菌

6.细菌对抗生素Y

的敏感性测定

白色葡萄球菌

白色葡萄球菌7.细菌的分离培养

+大肠杆菌

大肠杆菌

8.进行完以上接种后，用这两管细菌

进行号I噪试验

白色葡萄球菌

5.皮肤消毒前后细菌学检查

实验十一化学物质对细菌的致突变作用

一、实验目的与原理

观察化学药品的致突变作用。

大多数致癌因子有致突变作用，有致突变作用的物质大都是致癌物质，根据药物致突变作用的有无可

推测某一药物有无致癌作用。Ames试验方法较简实用。其原理是以组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌为试验株

（如TA155,TA1537等），该菌在无组氨的培养基上不能生长，但遇有致突变因子作用时即可恢复为原养

型菌，可在无组氨酸培养基上生长，根据形成菌落数量判断其致突变性。

二、实验材料

1、鼠伤寒沙门菌（组氨酸缺陷型）完全肉汤培养物。

2、Vogel-Bonner平板培养基（简称E培养基或底层培养基）。

3、组氨酸软琼脂上层培养基2ml。

4、含氮芥滤纸片、磺胺滤纸片

5、无菌吸管、镒子等。

三、实验方法

1、将软琼脂加热溶化，并冷却至45℃备用。

2、用无菌吸管吸鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型菌液0.1ml加入溶化的软琼脂中混匀，并立即倾注于无组

氨酸的琼脂平板，使之均匀铺于表面，静止凝固。

3、用无菌镶子取氮芥、磺胺滤纸片分放于培养基表面。

4、37℃孵育48小时观察结果。

四、实验结果

化学物质对细菌有致突变作用时，滤纸片周围有细菌生长。

化学物质对细菌无致突变作用时，滤纸片周围无细菌生长。

实验十二病原菌的致病性

内容：一、透明质酸酶的扩散作用

二、破伤风梭菌外毒素的毒性作用

三、邕试验

一、透明质酸酶的扩散作用

（-）实验目的与原理

观察透明质酸酶的侵袭作用

透明质酸酶也称扩散因子。透明质酸是一种粘蛋白多糖，有高度的粘性，在结缔组织细胞间呈“细胞

粘合剂”的作用。细胞间的透明质酸被细菌产生的透明质酸酶分解后，细胞间隙扩大，通透性增加，细菌

及其毒素易于向周围扩散。

（-）实验材料

1、动物：家兔

2、菌种：溶血性链球菌24小时肉汤培养物滤液。

3、其他：黑色素及注射器等。

（三）实验方法

1、取家兔一只，剪去背两侧部分兔毛，用75%酒精局部消毒。

2、用吸管吸取0.5ml培养物滤液，放入盛有0.5ml黑色素小试管中，另取0.5ml生理盐水混于等量的

黑色素小试管中充分混匀。

3、两种混液各取0.1ml分别注入两侧皮内。（注射时注意，勿使黑色素漏出）。

4、注入后立即量两侧黑色素扩散区直径，1小时后再测两扩散区的直径，比较两侧记录结果。

（四）实验结果

混有培养物滤液的黑色素扩散区明显大于对照组扩散区。

二、破伤风梭菌外毒素的毒性作用

（-）实验目的和原理

观察外毒素的毒性作用

外毒素被吸收后，至脊髓前角神经细胞，阻止释放抑制性神经介质（如甘氨酸），因而阻止了上下神

经原之间的正常抑制性冲动的传递，而导致神经系统兴奋性异常增高和骨骼肌强直性痉挛。

（二）实验材料

1、动物：小白鼠。

2、毒素：破伤风外毒素。

3、抗毒素：破伤风抗毒素。

4、其他：注射器、针头等。

（三）实验方法

1、取小白鼠二只，分别喂养于1、2号罐中。

2、给1号小鼠腹腔注射破伤风抗毒素0.2ml（100单位）

3、30分钟后，给1、2号两只小白鼠均经右后腿肌肉分别注射0.2mll:100稀释的破伤风外毒素。

4、分别喂养，逐日观察有无发病情况。

（四）实验结果

注射破伤风抗毒素的1号小白鼠正常生长。2号小白鼠可见尾部强直，注射毒素侧下肢麻痹，有强直

痉挛，逐渐蔓延至另侧或全身，动物于2〜3日内死亡。

三、邕试验

（-）实验目的及原理

量试验是检测内毒素的一种试验方法，试验灵敏，能检出微量（0.000lug/ml）内毒素。量是一种冷血

动物，其血细胞（系一种变形细胞）的溶解产物与内毒素相遇，即被凝固，机制尚不清楚，可能是溶解物中

含有凝固蛋白原和一种高分子量的凝固酶原，凝固酶原经内毒素激活转化成凝固酶，此酶使蛋白酶原变为

凝固蛋白，再通过交联酶的作用，相互聚合形成纤维状凝胶。

（二）实验材.料

1、邕试验试剂一套

2、大肠杆菌内毒素（阳性对照）

3、待检测样品

4、吸管、小试管、试管架等

（三）实验方法

1、将赏试剂按要求加入等量的溶解水，振摇2〜3分钟使之溶解。

2、在试验管中，阳性对照管及空白对照管中各加溶解物（溶解部分）O.ml。

3、试管中加待检液0.1ml,阳性对照管加大肠杆菌内毒素0.1ml,空白对照加溶解水0.1ml。

4、置37℃水浴一小时后观察结果。

（四）实验结果

1、阳性对照管出现凝固，空白对照管无变化时，试验结果正确，再观察待检测样品管。

2、试验管出现凝固为阳性，证明有内毒素存在，如未出现凝固，证明无内毒素存在。

试验管阳性对照空白对照

赏试剂溶解物0.10.10.1

待检样品0.1——

大肠杆菌内毒素—0.1一

溶解水———0.1

37c一小时后观察

结果凝固凝固未凝固

实验十三吞噬细胞的吞噬作用

吞噬细胞对侵入体内的细菌有强大的防御作用。吞噬