制药工程专业实验指导书汇编

制药工程专业

实验指导书汇编

食品与生物工程学院

2018.09

目录

《药物分析一》实验指导书.............................

实验一烟酸原料药的鉴别实验......................

实验二阿司匹林原料药的鉴别试验及其特殊杂质的检查.

实验三高效液相色谱法测定阿司匹林的含量及其有关物质

实验四中和滴定法测定烟酸的含量..................

《药物分析三》实验指导书.............................错

实验一、葡萄糖的一般杂质检查......................

实验二、葡萄糖注射液的质量检查....................

实验三、阿司匹林原料药的质量检查..................

《药学微生物学》实验指导书...........................

实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察•••

实验二培养基的的制备灭菌及接种技术..............

实验三自然界中微生物的分离与纯化................

《医学基础实验》实验指导书...........................

实验一不同影响因素下家兔呼吸、血压信号的变化及分析

实验二大鼠急性肝损伤动物模型的制备及鉴定........错

实验三小鼠肝脏DNA的提取与鉴定..................

实验四不同来源蛋白质的提取与分离................

《药剂学》实验实验指导书.............................错

实验一软膏剂的制备.............................

实验二栓剂的制备...............................

实验三微囊的制备...............................

实验四阿司匹林片剂的制备........................

实验五阿司匹林B-环糊精包合物的制备.............

实验六阿司匹林维生素C泡腾片的制备..............

《药物分析一》实验指导书

实验一烟酸原料药的鉴别实验

一、实验目的

1、掌握鉴别烟酸的原理及方法

2、掌握紫外分光光度法鉴别烟酸的方法原理及紫外吸收图谱的解析

3、熟悉紫外分光光度计的操作要点及紫外分光光度法效能指标评价的内容

与要求

二、实验原理

1、鉴别反应

(1)烟酸加2,4-二硝基氯苯加热溶化后，生成季铁化合物，再加乙醇制氢氧化

钾溶液，即显紫红色，以此鉴别烟酸，反应式为:

本反应需在无水的条件下进行。

(2)烟酸与氢氧化钠发生酸碱中和反应，遇石蕊试纸显中性，遇硫酸铜生成

淡蓝色烟酸酮沉淀，以此鉴别烟酸，反应式为：

淡蓝色沉淀

(3)烟酸加水溶解后，照紫外-可见分光光度法测定，在262nm的波长处有最

大吸收，在237nm的波长处有最小吸收，且237nm波长处的吸光度与262nm波长

处的吸光度的比值应为0.35〜0.39；而烟酰胺也在262nm的波长处有最大吸收，在

245nm波长处有最小吸收，在A254nm/A262nm为0.63〜0.67。因此可用该方法来

区别烟酸和烟酰胺。

三、实验内容与操作

（-）仪器和试剂

1、仪器紫外分光光度计、配对比色杯一对、试管（25mL,2支）、电炉、药

物天平、烧杯（50mL,2只）、容量瓶（100mL、10mL各2只）、移液管（1mL,2

只）、乳钵（小号1个，配乳槌）。

2、试剂烟酸、0.4%氢氧化钠试液（取氢氧化钠0.4g,加水使溶解成100mL,

即得）、2,4■•二硝基氯苯、乙醇制氢氧化钾试液（取氢氧化钾3.5g,加100mL95%乙

醇使溶解，静止后取上清液）、硫酸铜溶液（取硫酸铜12.5g,加水溶解成100mL,

即得），蒸僧水、95%乙醇

（-）实验步骤

1、鉴别

（1）取烟酸约4mg,加2,4-二硝基氯苯8mg,研匀，置试管中，缓缓加热溶

化后，再加热数秒钟，放冷，加乙醇制氢氧化钾试液3mL,即显紫红色。

（2）取烟酸约50mg,加水20mL溶解后，滴加0.4%氢氧化钠溶液至遇石蕊

试纸显中性反应，加硫酸铜试液3mL,即缓缓析出淡蓝色沉淀。

（3）取烟酸，加水溶解并稀释制成每1mL中约含20陷的溶液，照紫外-可见

分光光度法（中国药典2010年版附录IVA）测定，在262nm的波长处有最大吸收，

在237nm的波长处有最小吸收；在237nm波长处的吸光度与262nni波长处的吸光

度的比值应为0.35〜0.39。

四、思考题

1、计算烟酸的A235nm/A262nm

五、实验报告书写要求

1、实验目的；2、实验原理；3、主要仪器与试剂；4、实验结果；5、思考题答案。

实验二阿司匹林原料药的鉴别试验及其特殊杂质的检查

一、实验目的

1、掌握鉴别阿司匹林的原理及方法。

2、掌握阿司匹林中游离水杨酸的检查原理及方法。

3、熟悉阿司匹林中由于合成工艺所带来的其它特殊杂质的检查原理及方法。

二、实验原理

1、鉴别反应

（1）阿司匹林加热水解产生的水杨酸在中性或弱酸性条件下与三氯化铁试液

反应，生成紫堇色配位化合物，以此鉴别阿司匹林，反应式为：

COOHCOOH

OCOCH3+<^Q>OH+CH3COOH

COOH

COO'

6（OVOH+4FeCh-----►厂4Fe+12HC1

0"Ff3

本反应极为灵敏。反应适宜的pH值为4一6,在强酸性溶液中配位化合物分解。

（2）阿司匹林与碳酸氢钠试液加热水解,得水杨酸钠及醋酸钠，加过量稀硫

酸酸化后，则生成白色水杨酸沉淀,并发生醋酸的臭气，以此鉴别阿司匹林。反应

式为：

COOHCOONa

<^Q^~OCOCH3+Na2cO3—

OH+CH3coONa+CO2t

COONaCOOH

OH+H2SO4>2(OVOH+Na2sO4

2CH3COONa+H2sO4>2CH3COOH+Na2sO4

沉淀物于100℃-105℃干燥后，熔点为156℃-161℃o

2、特殊杂质检查

（1）溶液的澄清度澄清的定义：指供试品溶液的澄清度相同于所用溶剂或

未超过0.5号浊度标准液。本实验系检查碳酸钠试液中不溶物。不溶物杂质有未反

应完全的酚类，或水杨酸精制时温度过高，产生脱频副反应的苯酚，以及合成工艺

过程中由副反应生成的醋酸苯酯、水杨酸苯酯和乙酰水杨酸苯酯等。这些杂质均不

溶于碳酸钠试液，而阿司匹林可溶解，利用溶解行为的差异，由一定量的阿司匹林

在碳酸钠试液中溶解应澄清来加以控制。

原理：用规定物质制成不同浓度的对照浊度标准液与供试液比较，判定供试品

的澄清度。

（2）游离水杨酸检查的原理是利用阿司匹林结构中无酚羟基，不能与高

铁盐作用，而水杨酸则可与高铁盐反应呈紫堇色，与一定量水杨酸对照液生成的色

泽比较，从而控制游离水杨酸的限量。方法灵敏，可检出水杨酸。

三、实验内容与操作

（-）仪器和试剂

1、仪器：烧杯（50mL,4只）、电炉、药物天平、恒温水浴锅、配对比浊管

（内径15—16mm,平底、具塞、以无色、透明、中性硬质玻璃制成）2支、量瓶

（100mL,5只）、移液管（10mL、5mL、lmL各2支）、量瓶（10mL、50mL、1000mL

各2只）。

2、试剂：阿司匹林、水杨酸、三氯化铁试液（取FeCL9g,加水使溶解成100mL,

即得）、蒸储水、碳酸钠试液（取无水Na2co310.5g,加水使溶解成100mL,即得）、

稀硫酸（取硫酸57mL,加水稀释至1000mL,即得）、硫酸腓、10%乌洛托品（六亚

甲基四胺）、乙醇、硫酸铁铁指示液（取硫酸铁铁8g,加水100mL使溶解，即得）、

盐酸溶液（9-100）。

【注】实验前一周应先配制浊度标准贮备液。

（二）实验步骤

1、鉴别

（1）取本品约0.1g,置50mL烧杯中，加水10mL,煮沸，放冷，加三氯化铁

试液1滴，即显紫黄色。

（2）取本品约0.5g,置50mL烧杯中，加碳酸钠试液10mL,煮沸2分钟后，放

冷，加过量的稀硫酸，即析出白色沉淀，并发生醋酸的臭气。

2、检查

（1）溶液的澄清度

【浊度标准贮备液的制备】称取硫酸肿1.00g,置100mL量瓶中，加水适量

使溶解（必要时在40℃的水浴中温热溶解），加水稀释到刻度，摇匀，放置4~6h

后使用；取此溶液与等容量的10%乌洛托品溶液混合，摇匀，于25c避光静置24

小时，即得。本液置冷处避光保存，可在两个月内使用，用前摇匀。

【浊度标准原液的制备】取浊度标准贮备液15.0mL置1000mL量瓶中，加

水稀释至刻度，摇匀，即得。本液应在24小时内使用，用前摇匀。

【浊度标准液的制备】取浊度标准原液2.50mL,置100mL量瓶中，加水稀

释至刻度，摇匀，即得（该标准液为0.5号浊度标准液）。本液应临用时配制，使用

前充分摇匀。

【供试品溶液制备】取本品0.50g,置50mL烧杯中，加温热至约45℃的碳

酸钠试液10mL溶解后，制成供试品溶液（供试品溶解后应立即检视）。

操作方法：将规定浓度的供试品溶液与等量的浊度标准液分别置于配对的比浊

用玻璃管中，液面的高度为40mm,在浊度标准液制备后5分钟，同置黑色背景上，

从比浊管上方向下观察、比较，用以检查溶液的澄清度或其浑浊程度。供试品溶液

的澄清度应未超过0.5号浊度标准液。

（2）游离水杨酸取本品0.10g,加乙醇1mL溶解后，加冷水适量使成50mL,

立即加新制的稀硫酸铁镀溶液【取盐酸溶液（9-100）1mL,加硫酸铁铁指示液2mL

后,再加水适量使成100mL】1mL,摇匀；30秒钟内如显色，与对照液（精密称取

水杨酸0.1g,加水溶解后，加冰醋酸1mL,摇匀，再加水使成1000mL,摇匀，精

密量取1mL,加乙醇1mL、水48mL与上述新制的稀硫酸铁镀溶液1mL,摇匀）

比较，不得更深（0.1%）。

四、思考题

1、计算水杨酸的限量。

2,计算碳酸钠试液中不溶物的限量。

五、实验报告书写要求

1,实验目的；2、实验原理；3、主要仪器与试剂；4、实验结果；5、思考题

答案。

实验三高效液相色谱法测定阿司匹林的含量及其有关物质

一、实验目的

1、掌握内标法的实验步骤和结果计算方法。

2、熟悉高效液相色谱仪性能检查和色谱参数测定的方法。

3、了解高效液相色谱仪的使用方法。

二、实验原理

(-)阿司匹林的含量测定

1、色谱参数本实验仅测定下列色谱参数：

2

(1)理论板数：n=5.54(tR/Wi/2)理论塔板高度：H=L/n

如果测得的理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某

些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等)，使理论板数达到要求。

(2)分离度：定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰

之间有较好的分离度。分离度(R)的计算公式为：

2(tR2—tRl)

R=-----------

WI+W2

式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；

tRl为相邻两峰中前一峰的保留时间；

W1及W2为此相邻两峰的峰宽。

除另外有规定外，分离度应大于1.5。

(3)拖尾因子为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰

的拖尾因子(T)是否符合各品种项下的规定，拖尾因子计算公式为

T=Wo.o5h/2di

式中，Wo.o5h为0.05峰高处的峰宽；5为峰极大至峰前沿之间的距离。

除另有规定外，T应在0.95-1.05之间。

中国药典规定，在采用HPLC法检测药品时，必须对仪器进行系统适用性试验,

其试验内容即为理论板数、分离度、拖尾因子以及重复性。

2、高效液相色谱仪的性能指标：本实验仅检查重复性。

重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积

测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。

3、内标法定量分析阿司匹林含量

（1）内标法的定义：将一个已知重量，样品中不含有的纯物质，加入至待测

样品溶液中，以此纯物质的量为标杆，对比测定待测i组分的含量的方法谓内标法。

（2）内标法特点：在进样量不超限（色谱柱不超载）范围内，定量结果与进

样量无关；只要被测组分及内标物出峰，分离度合乎要求，即可定量，定量结果与

其它组分是否出峰无关；很适用于药物或复方药物中某些有效成分的含量测定以及

药物中微量杂质的测定。由于杂质与主要成分含量相差悬殊，无法用归一化法测定

杂质含量，这时可加入一个与杂质量相当的内标物，加大进样量，增加杂质峰面积,

测量杂质峰与内标物峰面积比，即可求出杂质的含量。样品配制比归一化法麻烦，

内标物有时不易找寻是其缺点。

（3）内标物的要求：内标物应为样品中不含有的组分；内标物的保留时间应

与待测成分相近，分离度RNL5；内标物应为纯物质。

内标法可分为工作曲线法，内标对比法（内标一点法）、内标二点法及校正因

子法等，在HPLC中最常用内标对比法。使用内标法可抵消仪器稳定性差，进样量

不够准确等原因带来的定量分析误差。

当配制校正因子测定用的含有内标物质的对照品溶液和含有内标物质的供试

品溶液使用同一份内标物质溶液时且内标物加入量相同，则配制内标物质溶液不必

精密称（量）取。

【工作曲线法】是在待测组分各种浓度的对照品（或标准品）溶液中，将相

同量的内标物加入到同体积的各对照品溶液中，进样。分别测量i组分（对照品）

与内标物s的峰面积A（或峰高h）,以其峰面积比Ai/As对Ci（标嗡绘制工作曲线，

或求出回归方程式

C）=a+bAi/As

先用加内标物的对照品溶液求出直线的斜率b与截距a,有时测定工作曲线并

非直接用于定量分析，而是检验是否可用内标一点法进行定量分析。因为只有截距

a为零时才可用内标一点法定量，否则需用内标二点法定量。

样品测定：将与对照品溶液相同量的内标物加至样品溶液中，进样。分别测量

样品与内标物峰面积或峰高，以此两者峰面积或峰高之比代入回归方程计算出样品

中i组分的含量。

【内标一点法(内标对比法)】该方法不需知校正因子又具有内标法的定量

准确度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中，校正因子多是未知的，

就可利用此法。

先称取一定量的内标物，加入到对照品(或标准品)溶液中，组成对照品(标

准品)溶液(配制对照品溶液的目的实际上是用来测定校正因子)。然后将相同量

的内标物，加入到同体积样品溶液中，组成样品溶液，将两种溶液分别进样，由下

式计算出样品溶液中待测组分的含量。

由于截距a为零，Ci=bAi/As；若(Cs)对照=(Cs')样品，则由下式计算出样

品溶液中待测组分的含量：

(Ci)#&/(Ci)可照=(Ai/As)样品/(Ai/As)对照

若(Cs)对照不等于(Cs')样品，则由下式计算出样品溶液中待测组分的含量：

As/CsAs/Cs'

校正因子(f)=(---------)对版=(----------)样品

Ai/CiAi'/Ci'

式中，As、As'分别为对照品溶液中和样品溶液中内标物的峰面积；Ai、Ci分别

为对照溶液中对照品的峰面积和对照品的浓度；Ai'、Ci'分别为样品溶液中i组分

的峰面积及其浓度；Cs、Cs'分别为对照品溶液中和样品溶液中内标物的浓度。

As/CsAi'

(Ci)样品=()对第x()样1s

Ai/CiAs'/Cs'

【校正因子法】用此法需要已知校正因子，而HPLC法的校正因子很难由手册中查

到，常常需自己测定，校正因子测定方法如下：将精密称量的被测i组分的对照品

mi克，加一定量精密称量的内标物m,克配成溶液，在与测定样品溶液完全相同的

实验条件下，进样5—10次，测定内标物质峰面积As和i组分的峰面积Ai。用下

式计算待测物质的相对重量校正因子：

As/Cs

fi=

Ai/Ci

求出校正因子fi后，同法配制样品溶液，进样分析，测量待测i组分的峰面积Ai

和内标物峰面积As。按下式计算样品溶液中所含i组分的含量。

niifiAiCifiAi

----=--------或-----=-------

msfsAsCsfsAs

fiAi

Ci=XCs

fsAs

式中，fi、fs分别为i组分和内标物的重量校正因子；Ci、Cs分别为样品溶液中i组

分和内标物的浓度。如果校正因子是以内标物质作为基准物质而测得，则fs=l。

4、阿司匹林乙醇溶液在（280±1）nm波长处有最大吸收，可以用于定量测定。

在其生产和贮藏过程中，容易引入中间体、水解和分解产物，这些杂质也有紫外吸

收，因此采用高效液相色谱仪测定含量是合适的（如USP（24）采用HPLC法测定

阿司匹林片剂、长效与缓释片剂；Ch.P采用HPLC法测定阿司匹林栓剂）。

（-）阿司匹林中有关物质的检查

系特殊杂质检查。利用HPLC法检查化学物质结构不清的有关物质。HPLC法

不仅分离药物与杂质的效能高，且可准确地测定各组分的峰面积。本实验采用不加

校正因子的主成分自身对照法，用于没有杂质对照品时阿司匹林中杂质的限量检

查。

原理：当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法。对照

溶液的配制：按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当

的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以

柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的10%〜25%或其峰

面积能准确积分（面积约为通常条件下满量程峰积分值10%）。，取供试品溶液和对

照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的

2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，

计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供

试品溶液的色谱图I,再记录等体积纯溶剂的色谱图n。色谱图I上杂质峰的总面

积（包括溶剂峰），减去色谱图II上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然

后依法计算。

三、实验内容与操作

（-）仪器和试剂

1、仪器：高效液相色谱仪、ODS柱、万分之一分析天平、量筒（100mL、1000mL

各1个）、0.455im微孔滤膜（油系膜）、量瓶（50M1,6只；10mL,2只）、移液管

（2mL2支；10mL,2只）、吸耳球1个。

2、试剂：咖啡因（内标物）、阿司匹林、乙醇、甲醇（色谱纯）、二乙胺（AR）、

冰醋酸（AR）、重蒸偏水。

（二）实验步骤

1、阿司匹林含量测定

（1）色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲

醇一0.1%二乙胺水溶液一冰醋酸（40：60：4）为流动相，检测波长为280nm,理

论板数按阿司匹林峰计算应不低于2000,阿司匹林峰与相邻杂质峰的分离度应符合

要求。

（2）内标溶液的制备取咖啡因，加色谱纯甲醇制成每1mL中含4mg的溶

液，摇匀，即得。

（3）对照品溶液的制备取阿司匹林对照品约0.15g,精密称定，置50mL

量瓶中，精密加入内标溶液5mL,用色谱纯甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量

取2mL,置50mL量瓶中，用色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

（4）供试品溶液的制备取阿司匹林约0.15g,精密称定，置50mL量瓶中，

精密加入内标溶液5mL,用色谱纯甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取2mL,

置50mL量瓶中，用色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

（5）测定法用微量注射器量取对照品溶液，进样IORL（若为20RL定量环

则进样20此），记录色谱图，重复5次，以同样方法分析供试品溶液（重复3次）。

按下表记录峰面积。

对照品溶液供试品溶液

AiAsAi/AsA.AsAi/As

2

3

4

5

平均值

（6）结果计算按下式计算阿司匹林的百分含量

（Ai/As）样品mi对照

阿司匹林百分含量=（Wi样品/W"）xlOO%=---------X----X100%

（Ai/As）对原W样品

式中，W院为阿司匹林称重，Wi"为样品中阿司匹林含量，mi对照为阿司匹林对照

品称重。

2、阿司匹林中有关物质的检查

测定法色谱条件与阿司匹林含量测定方法相同。取本品适量，加色谱纯甲

醇制成每1mL中含3mg的溶液，作为供试品溶液；量取适量，加色谱纯甲醇制成

每1mL中含0.06mg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液IORL（若为20RL定量环

则进样20RL）注入液相色谱仪进行预试，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰

高为满量程的10%;再准确量取上述两种溶液各IOFIL分别进样，记录色谱图至主

成分峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的

和，不得大于对照溶液主成分峰的峰面积。

（三）注意事项

实验中可通过选择适当长度的色谱柱，调整流动相中甲醇与二乙胺水溶液的比

例或流速，使阿司匹林峰、水杨酸峰和内标物质峰的分离度达到定量分析的要求。

四、思考题

1.此实验中供试品溶液和对照品溶液中的内标物浓度是否必须相同？为什么？

2.内标对比法有何优点？

3、如何选择内标物质？

4、配制供试品溶液时，为什么要使其浓度与对照品溶液的浓度相接近？

5、内标法绘制校正曲线时，如果（A/As）—Ci直线不通过原点，能否用内标

对比法进行定量？

6、什么是分离度？如何提高分离度？

7、本实验为什么采用含有醋酸的流动相？

五、实验报告书写要求

1、实验目的；2、实验原理（简述）；3、主要仪器与试剂；4、实验结果；5、

回答思考题。

高效液相色谱仪使用说明

岛津LC-10AT型高效液相色谱仪操作规程

1.目的

规范岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。

2.范围

适用于岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。

3.职责

质检员对本规程的实施负责。

4.规程

4.1系统组成：本系统由2个LC-lOATvp溶剂输送泵（分主/A泵和副/B泵）、

Rheodyne7725i手动进样阀、SPD-lOAvp紫外-可见检测器、N2000色谱数

据工作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。

4.2准备

4.2.1准备所需的流动相，用合适的0.45pim滤膜过滤，超声脱气20min。

4.2.2根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。

4.2.3配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45Rm滤膜

过滤。

4.2.4检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

4.3开机：接通电源，依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器，待泵和检测

器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。

4.4参数设定

4.4.1波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按［func］键，用数字键输入所需波

长值，按［Enter］键确认。按［CE］键退出到初始屏幕。

4.4.2流速设定：在A泵显示初始屏幕时，按［func］键，用数字键输入所需的流

速（柱在线时流速一般不超过Iml/min）,按［Enter］键确认。按［CE］键退出。443

流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按［cone］键，用数字键输入流

动相B的浓度百分数，按［Enter］键确认。按［CE］键退出。

4.4.4梯度设定

4.4.4.1在A泵显示初始屏幕时，按［edit］键，［Enter］键；

4.4.4.2用数字键输入时间，按［Enter］键，重复按［func］键选择所需功能（FLOW

设定流速，BCNC设定流动相B的浓度），按［Enter］键，用数字键输入设定

值，按［Enter］键;

4.4.4.3重复上一步设定其它时间步骤；

4.4.4.4用数字键输入停止时间，重复按［func］键直至屏幕显示STOP,按［Enter］

键。按［CE］键退出。

4.5更换流动相并排气泡

4.5.1将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；

4.5.2逆时针转动A/B泵的排液阀180°,打开排液阀；

4.5.3按A/B泵的［purge］键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗，

3min（可设定）后自动停止；

4.5.4将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。

4.5.5如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。

4.5.6如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设

流速为5ml/min,按［pump］键，冲洗3min后再按［pump］键停泵，重新接上

柱并将流速重设为规定值。

4.6平衡系统

4.6.1按《N2000色谱数据工作站操作规程》打开“在线色谱工作站”软件，输

入实验信息并设定各项方法参数后，按下“数据收集''页的［查看基线］按

钮。

4.6.2等度洗脱方式

4.6.2.1按A泵的［pump］键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检验方法

规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。

4.6.2.2检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。

4.6.2.3观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过IMPa。如超过则可初

步判断为柱前管路仍有气泡，按456操作。

4.624观察基线变化。如果冲洗至基线漂移＜0.01mV/min,噪声为〈O.OOlmV时,

可认为系统已达到平衡状态，可以进样。

4.6.3梯度洗脱方式

4.6.3.1以检验方法规定的梯度初始条件，按462项下方法平衡系统。

4.6.3.2在进样前运行1~2次空白梯度。方法：按A泵的［run］键，指

示灯亮，梯度程序运行；程序停止时，指示灯灭。

4.7进样

4.7.1进样前按检测器［zero］键调零，按软件中［零点校正］按钮校正基线零

点，再按一下［查看基线］按钮使其弹起。

4.7.2用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量。

实验四中和滴定法测定烟酸的含量

一、实验目的

1、掌握中和滴定法测定烟酸含量的原理及方法

2、掌握中和滴定法测定烟酸含量的操作要点、注意事项与结果计算

3、熟悉中和滴定法的终点确定、效能指标评价的内容与要求

二、实验原理

烟酸为一元强酸性物质，因此，可直接采用强酸的酸碱滴定法测定其含量。具

体方法为以酚酰为指示剂，用氢氧化钠标准滴定液滴定烟酸的水溶液，根据消耗的

氢氧化钠标准滴定液的用量，计算以C6H5NO2计的烟酸的含量，并将滴定的结果用

空白试验校正。

三、实验内容与操作

（-）仪器与试剂

1、仪器：三角烧瓶（100mL12只）、碱式滴定管（25ml、一根）、酸式滴定

管（50ml,1根）、量筒（50ml,2只）、万分之一电子天平

2、试剂：0.1mol/L氢氧化钠滴定液（取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL,加新

沸过的冷水使成1000mL,即得）、水、酚猷指示液（取酚猷1g,加乙醇100mL使

溶解，即得）

（二）实验步骤

1、氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的标定

取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6g,精密称定，加新沸过的

冷水50mL,振摇，使其尽量溶解；加酚醐指示液2滴，用本液滴定，在接近终点

时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每1mL氢氧化钠滴定

液（lmol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸

氢钾的取用量，算出本液的浓度。平行测定3次，3次结果的相对平均偏差不得大

于01%

注：本滴定液应置聚乙烯塑料瓶中，密封保存；塞中有2孔，孔内各插入玻璃

管1支，1管与钠石灰管相连，1管供吸出本液使用。

2、烟酸的含量测定

(1)实验方法：取本品0.3g,精密称定，加50mL新沸过的冷水溶解后，加3

滴酚猷指示液，用氢氧化钠标准滴定液(O.lmol/L)滴定至粉红色，记录消耗氢氧

化钠滴定液的体积数(mL),每1mL氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于12.31mg

的烟酸(C6H5NO2),即得。

(2)结果计算

烟酸(以C6H5NO2计)的质量分数仞，数值以％表示，按下式计算：

(V-V^)xcxO.1231xlOO

/=

m

其中：V-消耗氢氧化钠标准滴定液的体积数，单位为mL；

Vo-空白实验消耗氢氧化钠标准滴定液的体积数，单位为mL；

c-氢氧化钠标准滴定液实际浓度数值，单位为moVL；

实验室样品的质量数值，单位为g;

注：该实验测得的为烟酸湿品的含量，测得烟酸干燥失重的结果后可将该结果

换算为干燥品的含量。

本实验平行操作2次，允许相对差在0.3%以内。

四、思考题

1、什么叫中和滴定突跃范围。

2、根据什么选择酸碱指示剂？举例说明。

3、如何计算氢氧化钠标准滴定液的浓度

4、如果标定氢氧化钠滴定液的基准未烘干，将使标准溶液浓度的标定结果偏

高还是偏低？

五、实验报告书写要求

1、实验目的；2、实验原理；3、主要仪器与试剂；4、实验结果；5、思考题

答案。

《药物分析三》实验指导书

实验一、葡萄糖的一般杂质检查

一、实验目的

1、熟悉药物中一般杂质限量检查的方法及限量计算方法。

2、熟悉药物中一般杂质检查的目的和意义。

3、掌握氯化物、硫酸盐、铁盐的检查原理。

二、实验原理

(一)葡萄糖的生产工艺

葡萄糖是用淀粉以无机酸水解或在酶催化下经过水解得稀葡萄糖液，再经脱

色、浓缩结晶制得。国内生产方法如下：

1、酸水解法以无机酸将淀粉水解为葡萄糖。

HC1

(C6Hl0O5)rt+/JH2O,-&»r/C6Hi2O6

2、双酶水解法以生物酶为催化剂将淀粉水解为葡萄糖。

生物酶一

(C6H10O5)W+«H2O»CfiH|2O6

△

3、酸酶水解法以盐酸为液化剂，糖化酶为催化剂，将淀粉水解为葡萄糖。

精化院》

(C6lIl0Os)„+HC;6Hl

△

根据葡萄糖生产工艺特点，应进行氯化物、硫酸盐、铁盐等一般杂质检查，

进行蛋白质、可溶性淀粉等特殊杂质检查。

(二)各种杂质检查原理

1、氯化物检查法

氯化物在硝酸酸性溶液中与硝酸银作用，生成氯化银白色浑浊液，与一定量

的标准氯化钠溶液和硝酸银在同样条件下处理生成的氯化银浑浊相比较，测定供

试品中氯化物的限量。

Cl-+Ag+——>AgClj

2、硫酸盐检查法

药物中微量硫酸盐与氯化钢在酸性溶液中作用，生成硫酸钢微粒而显白色浑

浊液，同一定量标准硫酸钾溶液与氯化钢在同样条件下，用同法处理生成的浑浊

比较，判断药物中含硫酸盐的限量。

22+

SO4~+Ba—>BaSO4i

3、铁盐检查法

三价铁盐在硝酸酸性溶液中与硫氟酸盐生成红色可溶性硫富酸铁络离子，与

一定量标准铁溶液用同法处理后进行比色。

Fe3,4-6SCN—>[Fe(SCN)6]3-红色

进行葡萄糖的铁盐检查时，需在显色前加硝酸3滴，煮沸5min,使Fe?+氧化为

Fe3+o由于硝酸中可能含有亚硝酸，亚硝酸也能与硫氟酸根离子反应生成红色的亚

硝酰硫氟化物，影响比色，因此加入显色剂之前加热煮沸有助于除去氧化氮，以消

除氧化氮生产的亚硝酸干扰。

三、实验内容与操作

(一)仪器和试剂

1、材料

葡萄糖(药用)。

2、试剂

⑴酚酸指示液：取酚献1g,加乙醇100ml使溶解，即得。

⑵氢氧化钠滴定液(0.02mol/L)：取氢氧化钠4.000g,加水振摇使溶解成饱和溶液，

冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后备用。

取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6ml,加新沸过的冷水使成1000ml,摇匀，精

密量取溶液2ml,置10ml容量瓶中加水稀释至刻度，即得。

(3)标准氯化钠溶液：称取氯化钠0.165g,置1000ml容量瓶中，加水适量使溶解并

稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。

(4)稀硝酸：取硝酸105ml加水稀释至1加0ml,即得。

(5)硝酸银试液(0.1mol/L)：取硝酸银17.5g,加水适量使溶解成1000mL

摇匀，置玻璃塞的棕色玻瓶中，密闭保存。

(6)标准硫酸钾溶液：称取硫酸钾0.181g,置1000ml容量瓶中，加水适量使溶

解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml相当于100〃g的S04)o

(7)稀盐酸:取盐酸234ml,加水稀释至1000mL即得。

(8)25%氯化钢溶液：取氯化车贝25g,加水适量使溶解成100ml,即得。

(9)标准铁溶液：称取硫酸铁镀[FeNH4(SO4)2-12H2O]0.863g,置1000ml容量

瓶中，加水溶解后，加硫酸2.5ml,用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。

(10)硫氟酸镂溶液：取硫氟酸镂30g,加水适量使溶解成100ml,即得。

(11)其它：乙醇、石蕊试纸。

3、器材

量筒(100ml1个、500ml2个、1000ml1个)；

刻度吸管(1ml1支、5ml1支、10ml1支、20ml1支)；

容量瓶(10ml1个、100ml2个、1000ml2个)：

移液管(2ml1支)；

聚乙烯塑料瓶(500ml2个)；

玻璃塞的棕色玻瓶(1000ml2个)；

无色广口瓶(1000ml2个)；

纳氏比色管(50ml6支)；

烧杯(50ml6只、100ml4只)；

试管(50ml4支)；

加热回流装置，电子天平，水浴锅，电炉。

(-)实验步骤

1、酸度

取本品2.0g,加水20ml溶解后，加酚酗指示液3滴与氢氧化钠滴定液(0.02

mol/L)0.20mL应显粉红色。

2、乙醇溶液的澄清度

取本品1.0g,加90%乙醇30ml,置水浴上加热回流约lOmin,溶液应澄清。

3、氯化物

(1)标准氯化钠溶液的制备

精密量氯化钠贮备液10mL置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，

即得(每1ml相当于10〃g的C1)。

(2)供试溶液的配制

取本品0.60g,加水溶解使成25ml(溶液如显碱性，可滴加硝酸使遇石蕊试

纸显中性反应)，再加稀硝酸10ml,溶液如不澄清，应用事先已洗浮Ct的滤纸

滤过；置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml,摇匀，即得供试溶液。

(3)对照溶液的配制

取标准氯化钠溶液6.0ml,置50ml纳氏比色管中，加稀硝酸10mL用水稀

释使成约40ml,摇匀，即得对照溶液。

(4)检查

于供试溶液与对照溶液中分别加硝酸银试液(0.1mol/L)1.0ml,用水稀释使

成50ml,摇匀，在暗处放置5min,同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，

比较所产生的浑浊，样品管不得比对照管更浓(0.01%)。

4、硫酸盐

(1)标准硫酸钾溶液的制备

称取硫酸钾0.181g,置1000ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，

摇匀，即得(每1ml相当于100的SO4)o

(2)供试溶液的配制

取本品2.0g,加水溶解使成约40ml(如溶液显碱性，可滴加盐酸使遇石蕊试

纸显中性反应)；溶液如不澄清，应滤过；置50ml纳氏比色管中，加稀盐酸2ml,

摇匀，即得供试溶液。

(3)对照溶液的配制

取标准硫酸钾溶液2.0ml,置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml,加稀

盐酸2ml,摇匀，即得对照溶液。

(4)检查

于供试溶液与对照溶液中分别加入25%氯化钢溶液5ml,加水稀释至50ml,

充分摇匀，放置lOmin,同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较所产生

的浑浊，样品管不得比对照管更浓(0.01%)。

5、铁盐

(1)标准铁溶液的制备

精密量取硫酸铁铁贮备液10ml,置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇

匀，即得(每1ml相当于10〃g的Fe)。

(2)检查

取本品2.0g,加水20ml溶解后，加硝酸3滴，缓缓煮沸5min,放冷，加

水稀释使成45mL加硫鼠酸镀溶液(30-100)3ml,摇匀，如显色，与标准铁溶

液2.0ml用同一方法制成的对照液比较，不得更深(0.001%)。

四、实验报告书写要求

样品名称来源批号

数据记录

检查项目现象及数据结果

五、注意事项

1、纳氏比色管的选择与洗涤

比色或比浊操作，一般均在纳氏比色管中进行，因此在选用比色管时，必须

注意使样品与标准管的体积相等，玻璃色质一致，最好不带任何颜色，管上的刻

度均匀，如有差别，不得大于2mm。纳氏比色管用后应立即冲洗，比色管洗涤时避

免用毛刷或去污粉等洗刷，以免管壁划出条痕影响比色或比浊。

2、平行操作原则

进行比色、比浊检查时，样品溶液与对照溶液的实验条件应尽可能一致，严

格按照操作步骤平行操作，按规定顺序加入试剂。比色、比浊前可利用手腕转动

360°的旋摇使比色管内试剂充分混匀。比色方法一般是将两管同置于白色背景

上，从侧面观察；比浊方法是将两管同置于黑色或白色背景上，自上而下地观察。

3、实验中应准确选用量具，杂质检查中允许的误差为±10%,量筒的绝对

误差为1ml,刻度吸管的绝对误差为0.01〜0.1ml,在实验中，应根据样品、标

准液的取用量正确选用量器。例如，取标准液2ml应选择刻度吸管或移液管吸取

标准液。取样品2g,允许的误差为0.2g,可选用称量精度为0.1g的普通天平。

4、进行铁盐检查时，采用硝酸将Fe?+氧化为Fe3+,标准液应与样品液同法

操作。样品液加硝酸煮沸时，应注意防止暴沸，必要时补充适量水。

六、思考题

1、比色、比浊操作中应注意什么原则？

2、进行葡萄糖的铁盐检查时，在加入显色剂之前应如何操作?为什么？

3、各杂质的杂质限量计算

实验二、葡萄糖注射液的质量检查

一、目的要求

1、掌握葡萄糖注射液的鉴别原理及方法。

2、葡萄糖注射液中特殊杂质检查原理及方法。

3、熟练使用旋光仪，掌握旋光法测定葡萄糖含量的操作并能进行有关计算。

二、实验原理

（-）鉴别

葡萄糖分子中含有皴基，具还原性，能还原碱性酒石酸铜试液（斐林试液）生成

氧化亚铜红色沉淀。

CH2OHCH20H

葡萄糖Fehling试剂葡萄糖酸

CU2(OH)2Cu2Oj+H2O

红色)

（二）葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的检查

采用紫外分光光度法检查5-羟甲基糠醛的含量。利用5-羟甲基糠醛在284nm

波长处有最大吸收。本品每100ml中含1.0g葡萄糖的水溶液在284nm波长处的

吸收度不得大于0.32o

（三）含量测定

葡萄糖采用旋光法测定其含量。根据测得供试品的旋光度与2.0852相乘，

计算出葡萄糖在供试品中的百分比浓度和标示量的百分比。

三、试剂与器材

1、材料

葡萄糖注射液（规格20ml:10g）o

2、试剂

（1）碱性酒石酸铜试液：

①取硫酸铜结晶6.93g,加水使溶解成100mlo

②取酒石酸钾钠结晶34.6g与氢氧化钠10g,加水使溶解成100mlo

用时将两液等量混合，即得。

（2）氨试液：取浓氨溶液400ml,加水使成1000ml,即得。

3、器材

刻度吸管（2ml2支）；

容量瓶（100ml2个，或100ml1个、50ml1个）；

移液管（20ml1支，或10ml1支）；

试管（25ml2支）；

试剂瓶（250ml4个）；

水浴，紫外一可见分光光度仪，旋光仪。

四、实验步骤

（一）性状

观察葡萄糖注射液的性状，本品为无色或几乎无色的澄明液体；味甜。

（二）鉴别

取本品，缓缓滴入微温的碱性酒石酸铜试液中，即生成氧化亚铜的红色沉淀。

（三）5-羟甲基糠醛的检查

1、测定液的配制：

①100ml容量瓶：

精密量取本品适量（约相当于葡萄糖L0g,即精密量取本品2ml）置100ml容量

瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

②50ml容量瓶：

精密量取本品适量（约相当于葡萄糖0.5g,即密量取本品1ml）置50ml容

量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2、测定：取配制的测定液盛入1cm厚的石英池中，置预先校正好的紫外分

光光度计的试样室中，以水为空白，在284nm波长处测定其吸收度，重复三次，

取其平均值，《中国药典》2005规定，其吸收度不得大于0.32。

（四）含量测定

《中国药典》2010规定，本品含葡萄糖（C6Hl2。6•一0）应为标示量的95.0%~

105.0%o

1、测定液的配制：

①100ml容量瓶：

精密量取本品适量（约相当于葡萄糖10g,即精密量取本品20ml）,置100ml

容量瓶中，加氨试液0.2ml,用水稀释至刻度，摇匀，静置10分钟，即得。

②50ml容量瓶：

精密量取本品适量（约相当于葡萄糖5g,即精密量取本品10ml）,置50ml

容量瓶中，加氨试液0.2ml,用水稀释至刻度，摇匀，静置10分钟，即得。

2、测定：依法测定该溶液的旋光度，与2.0852相乘（测定管长度为1dm）,即

得供试品中含有C6H1206-H20的重量（g）。

3、计算

10852x122

标»---------------W~xl00%

20

五、数据记录及处理

样品名称：来源：批号:

现象结论

（一）性状

（二）鉴别

（三）5-羟甲基糠醛检查

读数1读数2读数3

吸收度

平均值

判断0.32

结论

（四）含量测定

读数1读数2读数3

旋光度

平均值

含量计算公式

判断95.0%~105.0%

结论

六、注意事项

1、碱性酒石酸铜试液是由碱性酒石酸铜试液I（硫酸铜溶液）